慈鴻飛 賈戶亮

（復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院普外科 上海 200040）

膽管細(xì)胞癌（cholangiocarcinoma，CCA）于1840年首次被報道，然而當(dāng)時這一疾病并沒有受到人們的重視，直到100年后才有系統(tǒng)的綜述介紹CCA［1-2］。CCA可以起源于膽道的任何位置，臨床上多數(shù)按解剖學(xué)位置將其分為肝內(nèi)膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，iCCA）、肝門部膽管癌（perihilar cholangiocarcinoma，pCCA）和遠(yuǎn)端膽管 癌（distal cholangiocarcinoma，dCCA），60%的CCA都發(fā)生在肝膽管分叉處［3］。大多數(shù)CCA患者早期無明顯癥狀，有些患者直到晚期發(fā)生了膽道梗阻才來就診，目前常規(guī)超聲篩查難以發(fā)現(xiàn)早期的小病灶，確診時間較晚也是導(dǎo)致CCA總體5年生存率小于10%的原因之一。因此，尋找特異的生物學(xué)標(biāo)志物，早期篩查出CCA已成為目前臨床關(guān)注的重點［4］。

外泌體是由內(nèi)涵體分泌產(chǎn)生的直徑在30～150 nm的胞外囊泡（extracellular vesicle，EV），根據(jù)大小、功能、運輸方式等不同，胞外囊泡還包括微泡（microvesicles）、凋亡小體（apoptosis bodies）等［5］。細(xì)胞分泌外泌體這一現(xiàn)象最早是在1983年由Johnstone等［6］在培養(yǎng)綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)，但是當(dāng)時認(rèn)為其只是細(xì)胞處理代謝廢物的一種途徑，在1987年的后續(xù)研究［7］中將這種特殊的囊泡命名為外泌體。目前已知外泌體參與的生理過程有器官發(fā)育、抗原呈遞和免疫反應(yīng)、神經(jīng)元通信及控制和細(xì)胞增殖等過程［8］。由于外泌體不但能夠在體液中穩(wěn)定廣泛存在，而且能夠攜帶有細(xì)胞的特異分子，這就為探究外泌體相關(guān)腫瘤標(biāo)記物、載藥治療技術(shù)提供了可能。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進步，不同外泌體攜帶的組分逐漸被鑒定出來。盡管外泌體的來源細(xì)胞特性高度影響外泌體成分的表達，但一些蛋白諸如四次跨膜蛋白（CD9、CD26、CD58）、Rab蛋白家族、熱休克蛋白家族（Hsp70、Hsp90）、核內(nèi)體相關(guān)蛋白（Alix、TSG101）等都是常見的共同表達成分［9］。外泌體中的核酸分子無論是DNA還是編碼的mRNA和非編碼RNA（miRNA、lncRNA、circRNA）都沒有缺席，這豐富了外泌體對于靶細(xì)胞表達調(diào)控的機制。此外，外泌體的膜上還能檢測到多種豐富的脂質(zhì)，如磷脂酰絲氨酸和膽固醇［10］。

外泌體中的核酸分子在CCA中的作用

環(huán)狀RNA環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是非編碼長鏈RNA的一種，共價閉環(huán)的結(jié)構(gòu)是它的特征，由于沒有極性和polyA尾部結(jié)構(gòu)，具有相對無干擾的結(jié)構(gòu)框架；并且circRNA在真核轉(zhuǎn)錄組中表達具有高度特異性，這使得circRNA在一些疾病中扮演分子標(biāo)志物的角色［11-12］。

研究發(fā)現(xiàn)，circ-0000284在膽管癌細(xì)胞系分泌的外泌體中表達增多，并具有明顯的促進遷移、侵襲的能力［13］。該團隊也發(fā)現(xiàn)circ-0000284能夠作為miRNA海綿與miR-637結(jié)合抑制其作用，同時在結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)其與miR-7也有類似機制［14］。有研究發(fā)現(xiàn)circ-0000284在肝癌細(xì)胞中顯著上調(diào)，促進腫瘤細(xì)胞增殖；而另有研究發(fā)現(xiàn)該分子也可以抑制膀胱癌的生長和轉(zhuǎn)移［15-16］。circ-0000284究竟是致癌還是抑癌分子還需要更深入的研究。

circ-CCAC1是新發(fā)現(xiàn)的在CCA組織和膽汁外泌體中都過表達的circRNA，發(fā)揮功能時circ-CCAC1主要通過海綿作用結(jié)合miR-514a-5p上調(diào)陰陽蛋白1（Yin-Yang 1，yy1）表達，進一步激活鈣調(diào)親環(huán)蛋白配體（calcium signal-modulating cyclophilin ligand，CAMLG）來促進CCA進展，這也是首次證明circ-CCAC1/miR-514a-5p/yy1/CAMLG軸在CCA中的重要性，而且CCA分泌的攜帶circ-CCAC1的外泌體還有促進血管內(nèi)皮細(xì)胞生成的作用，因此CCA組織和膽汁的外泌體中都上調(diào)的circ-CCAC1被認(rèn)為可能是一種CCA潛在標(biāo)記物［17-18］。

在CCA患者中高表達的circDNM3OS與腫瘤的大小、TNM分期和淋巴結(jié)浸潤有關(guān)，這一現(xiàn)象是circDNM3OS通過海綿作用于miR-145-5p后上調(diào)致癌基因MORC2，促進了CCA細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和谷氨酰胺代謝［19-20］。不過該分子在外泌體中的表達情況還未有實驗驗證。

miRNA miRNA（microRNA）因為具有靶向mRNA的能力而在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中扮演重要角色，并參與各種生理、病理過程［21］。研究發(fā)現(xiàn)血漿或膽汁中都存在核糖核酸酶（ribonuclease，RNase），并且外源性miRNA會被降解以維持機體穩(wěn)態(tài)，內(nèi)源性miRNA能夠穩(wěn)定發(fā)揮作用的機制目前尚未完全確定，但外泌體作為miRNA的主要載體保護其不被分解已經(jīng)得到驗證［22-24］。外泌體miRNA的功能中，與CCA相關(guān)的研究主要是作為生物標(biāo)記物的功能［25］。

有研究比較CCA細(xì)胞系來源的外泌體中miRNA與膽管上皮細(xì)胞的差異，在CCA中miR-205-5p上調(diào)最明顯，miR-199a-5p下調(diào)最明顯，通過京都基因和基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析發(fā)現(xiàn)這些差異miRNA與癌癥相關(guān)的途徑有顯著的關(guān)聯(lián)［26］。隨后在CCA患者血清中檢測外泌體來源miRNA，篩選出5個有顯著差異的miRNA分子，其中MiR-200家族中有4個microRNA（miR-141-3p、miR-200a-3p、miR-200b-3p和miR-200C-3p）的AUC高于CA19-9（0.78），miR-200a/c-3p不僅是診斷CCA的生物標(biāo)志物，且濃度與CCA分期成正相關(guān)，這使其成為反映疾病進展的指標(biāo)［27］。

治療方面，在CCA及其基質(zhì)中下調(diào)的外泌體中的miR-195能夠抑制CCA的生長和侵襲能力，CCA小鼠模型中注入包裹miR-195的外泌體后也觀察到同樣的現(xiàn)象，但是具體機制還不清楚［28］。有關(guān)miRNA的實驗室研究較多，而臨床試驗相對較少，因此還需要更多的臨床數(shù)據(jù)驗證實驗室結(jié)果［29］。

mRNA早在2007年研究者就觀察到，將鼠源的外泌體與人肥大細(xì)胞體外共培養(yǎng)后，肥大細(xì)胞表達鼠源特異性蛋白，便推測外泌體中mRNA有能夠到靶細(xì)胞翻譯的功能。目前基于外泌體攜帶功能性mRNA的核酸療法備受關(guān)注，通過外泌體的載體特性可能更好地解決mRNA無法有效遞送至目標(biāo)組織或細(xì)胞的問題［30-31］。

Haga等［32］將CCA細(xì)胞系提取出來的外泌體與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)后，增強了間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移能力和α-平滑肌肌動蛋白mRNA的表達，以及CXCL-1、CCL2和IL-6 mRNA的表達和釋放，通過將外泌體與膽管癌細(xì)胞中mRNA比較，發(fā)現(xiàn)外泌體中相關(guān)mRNA顯著上調(diào)，因此推測是CCA外泌體攜帶的mRNA釋放到間充質(zhì)細(xì)胞中發(fā)揮了作用［32］。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進步，有多篇文獻報道了運用多組學(xué)技術(shù)檢測CCA患者血清及尿液分子中可用作標(biāo)記物的mRNA，但篩選出多個特異分子而未進行深入的臨床及分子機制研究，距離用于臨床解決實際問題還有較遠(yuǎn)距離［33］。

外泌體中的蛋白質(zhì)分子在CCA中的研究外泌體所攜帶的蛋白質(zhì)一般分成非特異性和特異性兩大類：非特異性蛋白包括細(xì)胞骨架蛋白、與轉(zhuǎn)運有關(guān)的四跨膜蛋白家族成員（CD9、CD63、CD81和CD82）、熱休克蛋白、整合素等，在研究中主要作為外泌體鑒定的標(biāo)志物；特異性蛋白主要與分泌細(xì)胞有關(guān)，隨著疾病的進展，含量和定位會有明顯變化［34-35］。目前外泌體相關(guān)文獻中，對于蛋白質(zhì)的研究只占了小部分，但是隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對于蛋白質(zhì)在外泌體功能方面的關(guān)注越來越多，外泌體蛋白質(zhì)的研究不僅能增加對其生物學(xué)作用機制的認(rèn)識，還可能發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物［36］。當(dāng)前對于CCA相關(guān)外泌體中蛋白質(zhì)的鑒定方法以蛋白質(zhì)質(zhì)譜為主，而外泌體來源有多種方式，包括患者血漿提取、體外培養(yǎng)的CCA細(xì)胞上清液提取、動物原位CCA模型的血漿提取以及直接從人CCA組織提取，由于外泌體來源和質(zhì)譜的參數(shù)不同，得到的差異蛋白的種類和數(shù)量也不同［37-39］。

有研究對比了CCA患者與健康人血清中外泌體蛋白質(zhì)譜，試圖找出具有診斷意義的差異蛋白，在其中AUC值與敏感性最高的是氨肽酶N（aminopeptidase N，APN），APN用于篩查CCA的敏感性超過常用指標(biāo)CA199，但特異性略低［38］。APN是一種可以裂解蛋白質(zhì)N端氨基酸的鋅酶，屬于M1鋅金屬肽酶家族成員，在多種腫瘤及其周圍血管組織都有發(fā)現(xiàn)［40］。APN關(guān)注焦點是作為檢測肝細(xì)胞肝癌干細(xì)胞的標(biāo)記物，而CCA中癌癥干細(xì)胞的比例遠(yuǎn)高于大多數(shù)實體瘤，因此推測血清中外泌體APN的升高與CCA的進展存在關(guān)聯(lián)，其中具體機制還需要進一步的探索［41-42］。

除了血清，膽汁也是重要的膽管癌外泌體來源之一。最近有研究使用組學(xué)分析比較了CCA患者和膽結(jié)石患者膽汁中外泌體攜帶的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)Claudin-3具有作為CCA生物標(biāo)記物的潛力，因為其表達升高顯著，敏感性和差異性都高達0.875［39］。Claudin-3具有不依賴鈣離子的細(xì)胞黏附活性，在緊密連接細(xì)胞、消除細(xì)胞間隙、細(xì)胞旁運輸以及細(xì)胞增殖遷移中起重要作用，在結(jié)腸癌中Claudin-3的表達上調(diào)會破壞緊密連接的穩(wěn)定性，導(dǎo)致大分子的細(xì)胞旁通量增加，促使細(xì)胞遷移和集落形成的誘導(dǎo)，不過這一現(xiàn)象還未在CCA中得到驗證［43-44］。

通過對CCA細(xì)胞系與正常人膽管上皮細(xì)胞系H69培養(yǎng)后分離出的外泌體蛋白質(zhì)質(zhì)譜組學(xué)分析，篩選出38種差異表達蛋白，差異最大的是半乳糖凝集素3結(jié)合蛋白（lectin galactoside binding soluble 3 binding protein，LG3BP），也被稱為MAC2BP、M2BP［37］。將CCA細(xì)胞分離出的外泌體與H69細(xì)胞系共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)CCA細(xì)胞系的外泌體增強了H69細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力，而對其增殖能力影響不大，但該研究樣本數(shù)量較少，有待進一步驗證。LG3BP為一種分泌蛋白，廣泛存在于細(xì)胞外基質(zhì)中，在正常人的肝組織中表達量較低，參與調(diào)節(jié)Wnt蛋白的胞外擴散，提示其在腫瘤的免疫逃逸中有重要作用［45］。研究發(fā)現(xiàn)，LG3BP在高復(fù)發(fā)風(fēng)險的子宮內(nèi)膜癌患者血清外泌體中富集，在人類大腸癌和前列腺癌的細(xì)胞外基質(zhì)中表達升高［46-47］。LG3BP曾經(jīng)被認(rèn)為是一種用于診斷非酒精性肝硬化及丙型肝炎等慢性肝病的標(biāo)志物，然而最近有研究對其診斷效能產(chǎn)生了質(zhì)疑，借助外泌體來提高LG3BP的診斷效能可能成為一個新的突破點［48-49］。

成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）及其下游的信號通路參與調(diào)節(jié)多種生物學(xué)功能，包括細(xì)胞增殖、分化、組織修復(fù)、血管生成等，成纖維細(xì)胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR）軸的異常激活是腫瘤發(fā)生的重要因素［50］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，iCCA中幾種不同的FGFR2基因有較高的概率發(fā)生融合，但是pCCA/dCCA中幾乎沒有融合，這提示發(fā)生在不同位置的CCA可能在起源上存在差異［51-52］。FGFR2融 合蛋白通過激活絲裂原活化蛋白激酶來激活FGFR相關(guān)通路，并促進非錨位生長；存在FGFR異位的腫瘤中FGFR的結(jié)合配體介導(dǎo)低聚化和相應(yīng)的FGFR激酶的激活，這些基因融合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為靶向治療提供幫助，首個針對膀胱癌FGFR突變位點的靶向藥物厄達替尼在2019年4月被FDA批準(zhǔn)上市［53-54］。FGF2被骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌到外泌體中，攜帶FGF2的外泌體被白血病細(xì)胞攝取后能夠逃脫化療藥物的攻擊，但關(guān)于CCA進展中是否存在外泌體相關(guān)FGF家族的現(xiàn)象還需要進一步研究［55］。

胞質(zhì)異戊檸檬酸脫氫酶1（isocitrate dehydrogenase［NADP］cytoplasmic，IDH1）是一種能催化異檸檬酸還原型NADP生成α酮戊二酸的酶，IDH1基因突變現(xiàn)象在多種腫瘤中都有發(fā)現(xiàn)，IDH1突變通過抑制其正常催化的反應(yīng)來起到負(fù)性調(diào)節(jié)作用［56］。研究發(fā)現(xiàn)IDH1突變的膽管癌細(xì)胞系中外泌體分泌量明顯減少，通過通路分析推測可能是一種ATP受體P2RX7高表達導(dǎo)致的，與P2RX7共表達的基因多與外泌體的釋放和定位相關(guān)，該發(fā)現(xiàn)是IDH1突變的CCA在外泌體研究中的首次嘗試［57］。

結(jié)語CCA作為肝膽系統(tǒng)第二高發(fā)的癌癥，近年來發(fā)病率和死亡率都有上升的趨勢，臨床工作中應(yīng)對該疾病有足夠的重視，當(dāng)務(wù)之急是開發(fā)出高效的早期診斷手段。外泌體是近年來新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞間信息交流信使，分布廣泛且穩(wěn)定性好，擁有疾病診斷和靶向治療的潛能是外泌體目前廣受關(guān)注的重要原因。當(dāng)前限制外泌體領(lǐng)域進展的一大因素是外泌體富集和純化技術(shù)，目前尚無實現(xiàn)高通量、高純度、高速率的外泌體提取方法?？傮w來說，外泌體應(yīng)用于CCA的診療研究數(shù)量較少，這可能與CCA的患者基數(shù)較小有關(guān)，雖然已有幾個基于外泌體的組學(xué)研究篩選出的潛在標(biāo)記物，但尚無后續(xù)的深入研究能夠得到可靠的依據(jù)。外泌體應(yīng)用于診斷還處于早期階段，隨著研究深入，外泌體應(yīng)用于CCA這一類高度惡性腫瘤的早期診斷具有深遠(yuǎn)的臨床意義。

作者貢獻聲明慈鴻飛文獻檢索，論文設(shè)計和撰寫。賈戶亮論文構(gòu)思和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。