任 彬， 李 博， 范 超，， 洪 皓， 張 春 枝

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034；2.大連醫(yī)諾生物股份有限公司， 遼寧 大連 116600 )

0 引 言

β-丙氨酸是泛酸合成的前體，是機(jī)體內(nèi)合成肌肽的限速前體，在生物中具有重要的生理功能；同時(shí)也是食品添加劑、藥品和含氮化學(xué)品的中間體，在工業(yè)中發(fā)揮著重要作用[1-2]。β-丙氨酸的合成方法主要有兩種，即化學(xué)合成法和生物轉(zhuǎn)化法?；瘜W(xué)合成法反應(yīng)條件苛刻，副產(chǎn)物分離純化復(fù)雜，對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重[3]。利用L-天冬氨酸α-脫羧酶將L-天冬氨酸轉(zhuǎn)化生成β-丙氨酸的生物轉(zhuǎn)化法具有副產(chǎn)物少、成本低、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，更具備發(fā)展前景[4]。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者著力于性能良好的L-天冬氨酸α-脫羧酶基因(panD)的挖掘，以及對(duì)L-天冬氨酸α-脫羧酶(PanD)酶學(xué)性質(zhì)和生物轉(zhuǎn)化等方面的研究。陳濤等將結(jié)核桿菌中的基因克隆后在大腸桿菌中進(jìn)行重組表達(dá)，并對(duì)其誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，將酶活提高約70%。鄧思穎等[6]分別對(duì)來(lái)源于大腸桿菌、谷氨酸棒狀桿菌及枯草芽孢桿菌的PanD進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)來(lái)源于枯草芽孢桿菌的PanD重組酶最適pH為6.5，最適溫度為65 ℃，具有更好的活性和穩(wěn)定性，并且根據(jù)反應(yīng)溫度越高酶活越高PanD失活越快，推測(cè)其可能和S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶具有同樣的失活機(jī)理。陳夏林等[7]對(duì)單核增生李斯特菌和杰氏棒桿菌的panD進(jìn)行密碼子優(yōu)化并構(gòu)建了重組基因工程菌，對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)研究，發(fā)現(xiàn)兩種酶的最適反應(yīng)溫度為55 ℃，最適pH分別為7.0和6.0，同時(shí)它們均在30～50 ℃和酸性條件下穩(wěn)定。

本研究使用實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的基因工程菌異源表達(dá)L-天冬氨酸α-脫羧酶，使用粗酶液催化L-天冬氨酸生產(chǎn)β-丙氨酸。對(duì)酶蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和粗酶液轉(zhuǎn)化的條件進(jìn)行優(yōu)化，提高表達(dá)量和轉(zhuǎn)化效率，初步確立了生產(chǎn)條件。

1 材料與方法

1.1 材 料

菌株：E.coliBL21(DE3)/pET30a(+)-panDI88M，實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，pH 7.5。

LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，pH 7.5，瓊脂20 g/L，121 ℃ 滅菌20 min，倒平板前加入卡那霉素至終質(zhì)量濃度50 μg/mL。

主要試劑與儀器：蛋白胨、酵母浸粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉、正丁醇、冰醋酸、氫氧化鈉、氨水，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；IPTG，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；L-天冬氨酸、β-丙氨酸，張家港華昌藥業(yè)有限公司；苯駢戊三酮(茚三酮)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫酸銅、無(wú)水乙醇，天津市大茂化學(xué)試劑廠；1號(hào)新華濾紙，杭州沃華濾紙有限公司；V-1100D型紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 粗酶液的制備

取實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保藏甘油管，在含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上劃線。于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜活化培養(yǎng)，次日挑單菌落至50 mL含有50 μg/mL卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min下?lián)u床培養(yǎng)過(guò)夜得到種子液。將種子液按2%接種量接種于100 mL含有50 μg/mL 卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)120～180 min至OD600達(dá)到0.6左右時(shí)，加入IPTG至終濃度達(dá)到0.3～0.7 mmol/L，在15、20、25、30、35 ℃下誘導(dǎo)12～20 h。4 ℃、4 000 r/min離心10 min收集菌體，使用pH 7.5磷酸鹽緩沖液10 mL重懸菌體超聲破壁，4 ℃低溫離心，上清即為粗酶液。

1.2.2 酶活力測(cè)定

取1.5 mL酶液，加入250 g/L的L-Asp 3 mL 和pH 7.5的磷酸鹽緩沖液5.5 mL，在37 ℃ 下反應(yīng)1 h，取1 mL反應(yīng)溶液加1 mol/L氫氧化鈉溶液0.1 mL終止反應(yīng)。

酶活定義：在37 ℃，pH 7.5條件下，每小時(shí)轉(zhuǎn)化生成產(chǎn)物β-丙氨酸1 μmol所需的酶量為一個(gè)酶活單位(U)。

1.2.3 β-丙氨酸含量分析

使用紙層析-分光光度法測(cè)定β-丙氨酸含量。展開劑為體積比4∶1∶1的正丁醇-冰醋酸-水溶液，0.5%茚三酮。層析結(jié)束后，將濾紙置于110 ℃ 烘箱中2 min，出現(xiàn)紫紅色斑點(diǎn)即可。將樣品點(diǎn)剪下，置于比色管中，加入洗脫液，洗脫液成分為體積比19∶17的5%乙醇和0.2%硫酸銅水溶液，于30 ℃下洗脫20 min。利用紫外可見分光光度計(jì)于510 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算出樣品中β-丙氨酸含量[8]。

使用HPLC法分析β-丙氨酸含量。利用PITC進(jìn)行柱前衍生：取樣品800 μL，加入衍生劑A和B各400 μL，充分振蕩3 min，靜置1 h。加入等體積的正丁醇萃取，進(jìn)行HPLC檢測(cè)。使用C18色譜柱(4.6 mm×250 mm)，流動(dòng)相A，體積比93∶7的乙酸鈉和乙腈；流動(dòng)相B，體積比為4∶1 的乙腈和水，體積流量1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，梯度洗脫[9]。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

使用Oringin2018軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并繪制圖表。所用數(shù)據(jù)均為3次測(cè)定的(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差值)。

2 結(jié)果與討論

2.1 L-天冬氨酸α-脫羧酶誘導(dǎo)條件的確定

2.1.1 LPTG添加時(shí)間對(duì)酶活的影響

在接種量2%、37 ℃搖床培養(yǎng)180 min，分別在菌體生長(zhǎng)的不同時(shí)間加入IPTG，結(jié)果如圖1所示。OD600達(dá)到0.6左右時(shí)，添加IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，酶的表達(dá)量最高，酶活力達(dá)到249.2 U/mL。原因可能是菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，代謝旺盛。如IPTG加入過(guò)早，菌種代謝負(fù)擔(dān)大，影響菌體生長(zhǎng)繁殖，菌體生長(zhǎng)量不足影響酶蛋白的表達(dá)量；而IPTG加入過(guò)晚，菌體代謝速度降低，甚至出現(xiàn)菌種老化，不利于酶蛋白表達(dá)，還有可能出現(xiàn)包涵體。

圖1 誘導(dǎo)劑添加時(shí)間對(duì)酶活的影響Fig.1 Effect of adding time of inducer on enzyme activity

2.1.2 IPTG終濃度對(duì)酶活的影響

如圖2所示，當(dāng)IPTG濃度達(dá)到0.5 mmol/L時(shí)，酶表達(dá)量最高，酶活達(dá)到170.1 U/mL；如果濃度繼續(xù)升高，由于IPTG對(duì)菌體有一定的毒性，蛋白的表達(dá)水平會(huì)受到影響，過(guò)高的IPTG濃度甚至可能會(huì)導(dǎo)致包涵體生成。

圖2 IPTG終濃度對(duì)酶活的影響Fig.2 Effect of IPTG concentration on enzyme activity

2.1.3 誘導(dǎo)溫度對(duì)酶活的影響

如圖3所示，當(dāng)誘導(dǎo)溫度在15～35 ℃，酶表達(dá)量先上升后下降，誘導(dǎo)溫度為25 ℃時(shí)，酶活力達(dá)到最大，為203.7 U/mL。誘導(dǎo)溫度過(guò)低可能導(dǎo)致菌體代謝慢，生長(zhǎng)緩慢，酶表達(dá)量降低；誘導(dǎo)溫度過(guò)高，菌體代謝旺盛，生長(zhǎng)速度過(guò)快，蛋白可能被錯(cuò)誤折疊形成沒有活性的包涵體。

圖3 誘導(dǎo)溫度對(duì)酶活的影響Fig.3 Effect of induction temperature on enzyme activity

2.1.4 誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)對(duì)酶活的影響

如圖4所示，誘導(dǎo)18 h后，酶表達(dá)效果最好，酶活達(dá)251.2 U/mL。誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間過(guò)短，酶表達(dá)量較低；而超過(guò)18 h，會(huì)因?yàn)檎T導(dǎo)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致菌種老化和包涵體的生成，延長(zhǎng)生產(chǎn)周期，成本增加。

圖4 誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)對(duì)酶活的影響Fig.4 Effect of induction duration on enzyme activity

2.2 L-天冬氨酸α-脫羧酶轉(zhuǎn)化條件的確定

2.2.1 溫度對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

如圖5所示，在最適轉(zhuǎn)化溫度之前，隨著轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度的升高，反應(yīng)速度加快，產(chǎn)物β-丙氨酸產(chǎn)量呈上升趨勢(shì)。但當(dāng)溫度超過(guò)60 ℃時(shí)，過(guò)高的反應(yīng)溫度會(huì)導(dǎo)致酶失活變性，降低轉(zhuǎn)化反應(yīng)速度，產(chǎn)物β-丙氨酸產(chǎn)量呈下降趨勢(shì)。因此，確定L-天冬氨酸α-脫羧酶的最適轉(zhuǎn)化溫度為60 ℃。

圖5 溫度對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of temperature on the conversion reaction

2.2.2 pH對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

用6 mol/L鹽酸將反應(yīng)體系pH分別調(diào)至6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，1 h后終止反應(yīng)，樣測(cè)定β-丙氨酸產(chǎn)量。如圖6所示，在pH 6.5～8.5，隨著pH的上升， β-丙氨酸產(chǎn)量也呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，pH為7.5時(shí)，β-丙氨酸產(chǎn)量達(dá)到最高。

圖6 pH對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響Fig.6 Effect of pH on the conversion reaction

2.2.3 底物質(zhì)量濃度對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

如圖7所示，當(dāng)?shù)孜風(fēng)-Asp質(zhì)量濃度低于90 g/L 時(shí)，β-丙氨酸產(chǎn)量隨底物質(zhì)量濃度的升高而升高。而當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度高于90 g/L時(shí)，β-丙氨酸產(chǎn)量呈下降趨勢(shì)。

圖7 底物質(zhì)量濃度對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響Fig.7 Effect of substrate concentration on theconversion reaction

3 結(jié) 論

對(duì)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的菌株E.coliBL21(DE3)/pET30a(+)-panDI88M進(jìn)行生產(chǎn)工藝優(yōu)化。

使用L-天冬氨酸粗酶液催化合成β-丙氨酸，在菌體OD600達(dá)到0.6左右時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，最適條件為誘導(dǎo)劑IPTG濃度0.5 mmol/L、25 ℃誘導(dǎo)表達(dá)18 h，酶活達(dá)251.4 U/mL。在pH 7.5、60 ℃條件下，1.5 mL粗酶液3 h可催化90 g/L的L-天冬氨酸生成β-丙氨酸32.58 g/L，β-丙氨酸的產(chǎn)率得到提高。與張波琨等[13]的研究成果全細(xì)胞催化7 h，β-丙氨酸產(chǎn)量達(dá)到24.17 g/L相比，僅需粗酶液催化3 h，β-丙氨酸產(chǎn)量就達(dá)到32.58 g/L，大大提高產(chǎn)量。