Safdar Anum，李 慧，李壯壯，相 笑，魏建超，劉 珂，邵東華，李蓓蓓，馬志永，邱亞峰

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

人TREX1（three prime repair exonuclease 1）于1999年首次被發(fā)現(xiàn)，由314個(gè)氨基酸組成（分子量約為32 kDa），分為兩個(gè)功能域：N末端包含核酸外切酶活性的元件；C末端與細(xì)胞質(zhì)的定位相關(guān)[1]。TREX1是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中重要的3′-5′的核酸外切酶，廣泛地表達(dá)于各種細(xì)胞，在細(xì)胞中該蛋白主要分布于細(xì)胞質(zhì)中[2]。在細(xì)胞內(nèi)，TREX1通過(guò)核酸外切酶的活性清理殘留的DNA片段，發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞內(nèi)DNA穩(wěn)態(tài)的作用。相反，TREX1基因突變或缺失導(dǎo)致TREX1功能減弱或消失，從而促進(jìn)DNA片段的沉積?，F(xiàn)有研究顯示，TREX1功能缺陷與自身免疫病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemic Lupus Erthematosus,SLE）[3]和阿拉吉耶綜合征（Alagiye syndrome,AGS）[4]等相關(guān)，這與TREX1負(fù)調(diào)控Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生相關(guān)[5]。在正常情況下，TREX1抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，其具體的機(jī)制為：TREX1降解細(xì)胞質(zhì)中的DNA，繼而抑制模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors,PRR）的激活，從而抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生[6]。

盡管TREX1負(fù)調(diào)控Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生是其抑制自身免疫病的重要機(jī)制，但是，Ⅰ型干擾素在抗病毒反應(yīng)中起著重要的作用[7-9]。已有研究顯示，TREX1抑制HIV感染導(dǎo)致的干擾素[10]。除此之外，TREX1還參與其他病毒的感染，如流感病毒、仙臺(tái)病毒和西尼羅熱病毒，有意思的是，TREX1可通過(guò)Ⅰ型干擾素非依賴的途徑抑制這些RNA病毒的感染[11]。因此，TREX1通過(guò)干擾素依賴的和非依賴的途徑參與宿主先天性抗病毒反應(yīng)的調(diào)控。

我們感興趣于豬TREX1在病毒感染中的作用，同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果顯示，JEV感染上調(diào)TREX1的表達(dá)。因此，已發(fā)表的結(jié)果以及我們的前期結(jié)果促使我們假想豬TREX1在JEV感染中起著重要的作用。然而，目前關(guān)于豬TREX1的研究還非常有限，對(duì)于其表達(dá)特征以及生物學(xué)功能還不清楚。本研究聚焦于豬TREX1的真核表達(dá)以及其在JEV感染中的作用研究，以期揭示TREX1在JEV感染中的作用，也為研究豬TREX1在其他病毒感染中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 真核表達(dá)載體p3xFlag-CMV-14、293T細(xì)胞、PIEC細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；DNA marker、DH5α購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；蛋白預(yù)染marker、鼠抗Flag一抗、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠二抗購(gòu)自Abcam公司；Lipofectamine 2000、胎牛血清、雙抗、DMEM購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自QIAGEN；TRIzol試劑、PrimeScript? RT Master Mix （Perfect Real Time）、TB Green? Premix Ex Taq? Ⅱ （Tli RNaseH Plus）、限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。

1.2 真核表達(dá)載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及表達(dá)鑒定

1.2.1 真核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)豬TREX1基因的序列（GenBank登錄號(hào)：XM_021070628.1）設(shè)計(jì)引物（Sense：5′-TATAAAGCTTATGGGCTCGCAGGCC CTGCC-3′；Anti-sense：5′-AGTCGGATCCATGCC CAGGTATGGCTATGG-3′），以豬肺泡巨噬細(xì)胞的總RNA為模板，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增獲得豬TREX1基因的ORF（去掉終止密碼），利用HindⅢ和BamHⅠ為酶切位點(diǎn)將其克隆入p3xFlag-CMV-14真核表達(dá)載體中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pFlag-pTREX1。

1.2.2 重組質(zhì)粒的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 質(zhì)粒提取以及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法參見(jiàn)參考文獻(xiàn)[12]。利用QIAGEN plasmid Midi kit制備p3xFlag-CMV-14和pFlag-pTREX1，并用于后續(xù)的轉(zhuǎn)染。于轉(zhuǎn)染前1 d，將293T細(xì)胞鋪到6孔板中，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%滿時(shí)，利用Lipofectamine 2000將p3xFlag-CMV-14和pFlag-pTREX1分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染24 h后收取細(xì)胞樣品，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 Western blot檢測(cè) 配制12%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)2 h轉(zhuǎn)印至NC膜，5%脫脂乳室溫?fù)u床封閉1 h，棄去封閉液TBST漂洗后加入稀釋好的鼠抗Flag抗體（1∶3000），4℃搖床孵育過(guò)夜，回收抗體后加TBST置室溫?fù)u床漂洗10 min，重復(fù)洗3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗（1∶5000），室溫?fù)u床孵育1 h，棄去抗體加TBST置室溫?fù)u床漂洗10 min，重復(fù)洗3次，暗室中進(jìn)行顯影。

1.2.4 過(guò)表達(dá)與TCID50分析 PIEC細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%滿時(shí)，根據(jù)上述的方法將p3xFlag-CMV-14和pFlagpTREX1轉(zhuǎn)染如PIEC中，于轉(zhuǎn)染后12 h，感染JEV（1 MOI），于感染后24 h收獲細(xì)胞上清液和細(xì)胞。細(xì)胞樣品根據(jù)上述的Western blot方法進(jìn)行蛋白分析；細(xì)胞上清液進(jìn)行TCID50分析[13]。

1.2.5 RNA干擾與熒光定量PCR 根據(jù)豬TREX1基因的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，共獲得3條特異的siRNA，利用LipofectamineTMRNAiMAX進(jìn)行轉(zhuǎn)染，于轉(zhuǎn)染后48 h感染JEV NJ2008毒株[14]（1 MOI），于感染后24 h收獲細(xì)胞上清液和細(xì)胞。利用TRIzol試劑裂解細(xì)胞，根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行總RNA的提取，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA。參考文獻(xiàn)[12]方法進(jìn)行熒光定量PCR分析[12]，相對(duì)表達(dá)量通過(guò)與內(nèi)標(biāo)GAPDH進(jìn)行比對(duì)獲得。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)豬TREX1基因的真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)檢測(cè) 將RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ雙酶切后克隆到p3xFlag-CMV-14真核表達(dá)載體中，獲得的重組質(zhì)粒pFlag-pTREX1。利用HindⅢ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，可見(jiàn)兩條大小分別約為6300 bp及950 bp的片段，與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。此外，對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果顯示豬TREX1基因成功插入p3xFlag-CMV-14真核表達(dá)載體中。隨后，利用Western blot對(duì)Flag-pTREX1的表達(dá)進(jìn)行了分析，具體為將重組表達(dá)質(zhì)粒pFlag-pTREX1與pFlag-vector分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，24 h后收取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blot分析，利用抗Flag標(biāo)簽抗體鑒定Flag-pTREX1的表達(dá)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pFlag-pTREX1的樣品組在約35 kDa處出現(xiàn)特異性的條帶（圖2），F(xiàn)lag-vector的樣品組沒(méi)有出現(xiàn)條帶。說(shuō)明重組蛋白Flag-pTREX1獲得成功表達(dá)。

圖1 pFlag-pTREX1重組載體的雙酶切鑒定Fig.1 Double enzyme digestion of pFlag-pTREX1

圖2 真核表達(dá)載體pFlag-pTREX1的Western blot表達(dá)鑒定Fig.2 Western blot of expression of pFlag-pTREX1

2.2 過(guò)表達(dá)豬TREX1基因?qū)EV感染的影響 為了探討豬TREX1在JEV感染中的作用，首先，通過(guò)過(guò)表達(dá)Flag-pTREX1分析豬TREX1對(duì)JEV感染的影響，Western blot的結(jié)果顯示，pFlag-pTREX1在PIEC上獲得有效表達(dá)，同時(shí)，與vector組相比，過(guò)表達(dá)豬TREX1增加JEV NS3的表達(dá)（圖3A）。進(jìn)一步，利用TCID50對(duì)病毒的滴度進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，與vector組相比，過(guò)表達(dá)豬TREX1增加JEV感染（圖3B），這與Western blot的結(jié)果相符。因此，過(guò)表達(dá)豬TREX1促進(jìn)JEV的感染。

圖3 過(guò)表達(dá)豬TREX1對(duì)JEV感染的影響分析Fig.3 Analysis of the effect on JEV infection by overexpression of porcine TREX1

2.3 豬TREX1基因knock-down對(duì)JEV感染的影響 為了進(jìn)一步探討TREX1在JEV感染中的作用，我們利用RNA干擾技術(shù)沉默TREX1基因的表達(dá)，驗(yàn)證TREX1在JEV感染中的作用。qPCR檢測(cè)的RNA干擾效率結(jié)果顯示，在病毒感染組，基因特異的siRNA可以有效地沉默TREX1基因的表達(dá)（圖4A）。另外，JEV感染可以有效增加TREX1基因的表達(dá)（圖4A），這與我們前期觀察到的結(jié)果相符。此外，對(duì)病毒感染情況的分析結(jié)果顯示，與感染的NC組相比，沉默TREX1基因的表達(dá)顯著抑制JEV E基因的表達(dá)（圖4B）。以上結(jié)果表明，沉默豬TREX1基因的表達(dá)抑制JEV在PIEC上的感染。

圖4 沉默豬TREX1基因?qū)EV感染的影響分析Fig.4 Analysis of the effect of porcine TREX1 on JEV infection by RNA interference

3 討論

本研究率先利用真核表達(dá)系統(tǒng)研究了豬TREX1基因的表達(dá)特點(diǎn)，并初步鑒定了豬TREX1能促進(jìn)JEV的感染。首先，我們將編碼314氨基酸的豬TREX1基因克隆入真核表達(dá)載體p3xFlag-CMV-14中，通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及Western blot檢測(cè)豬TREX1的表達(dá)特點(diǎn)。隨后，通過(guò)過(guò)表達(dá)揭示了豬TREX1有利于JEV的感染。最后，通過(guò)RNA干擾揭示了JEV通過(guò)上調(diào)豬TREX1基因的表達(dá)促進(jìn)JEV的感染。

根據(jù)我們克隆的豬TREX1基因的序列，推導(dǎo)獲得氨基酸的序列。首先，序列分析的結(jié)果顯示豬TREX1中也包含有3個(gè)核酸外切酶保守的基序即ExoⅠ、ExoⅡ及Exo Ⅲ（數(shù)據(jù)未顯示）[1]。進(jìn)一步，對(duì)編碼的蛋白分子量預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示豬TREX1約為33 kDa。分析結(jié)果顯示重組融合蛋白Flag-pTREX1的分子量約為35 kDa（圖2），這與預(yù)測(cè)的結(jié)果吻合。由于目前還沒(méi)有針對(duì)豬TREX1的特異抗體，因此，豬TREX1在不同組織中的表達(dá)特征需要進(jìn)一步研究。

TREX1作為3′-5′核酸外切酶，通過(guò)降解細(xì)胞質(zhì)中的DNA負(fù)調(diào)控先天性免疫反應(yīng)，即TREX1可以通過(guò)干擾素依賴的或非依賴的途徑負(fù)調(diào)控先天性抗病毒反應(yīng)[10-11]。前期研究結(jié)果顯示JEV感染上調(diào)TREX1的表達(dá)，本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)JEV感染增加豬TREX1的表達(dá)。雖然目前關(guān)于豬TREX1是否參與JEV感染還不清楚，但本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)豬TREX1促進(jìn)JEV的感染，相反，沉默豬TREX1基因的表達(dá)抑制JEV的感染，本研究結(jié)果提示，豬TREX1基因可能通過(guò)負(fù)調(diào)控先天性抗病毒反應(yīng)促進(jìn)JEV的感染?？傊?，本研究初步鑒定了豬TREX1基因的表達(dá)特點(diǎn)，并揭示了豬TREX1促進(jìn)JEV的感染。然而目前，對(duì)豬TREX1促進(jìn)JEV感染的機(jī)制不清楚，這需要將來(lái)進(jìn)一步的研究。此外，除了JEV外，是否豬TREX1也參與其他病毒的感染，也需要進(jìn)一步的研究。因此，本研究不僅為揭示豬TREX1基因在病毒感染中的作用奠定基礎(chǔ)，而且為理解病毒和宿主的相互作用奠定基礎(chǔ)。