提金鳳，李志杰，王海燕，王莉莉

（1山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院，濰坊 261061；2壽光市紀臺鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作站，壽光 262722；3青島市黃島區(qū)農業(yè)農村局，青島 266400）

鴨坦布蘇病毒（Tembusu virus，TMUV）感染是2010年以來我國東南養(yǎng)鴨地區(qū)最先出現的一種病毒性傳染病，該病傳播速度快，波及范圍廣[1-3]，主要引起產蛋鴨產蛋率急劇下降，卵泡出血、萎縮、變形，病程可持續(xù)1個月左右，之后產蛋率逐漸恢復[4-6]。該病毒也可感染雛鴨，主要表現為震顫、站立不穩(wěn)等癥狀。到目前為止，該病在我國主要養(yǎng)鴨地區(qū)依然發(fā)生，常呈地方性流行，給養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴重危害和經濟損失[7]。

DTMUV弱毒苗和滅活疫苗的成功研制為臨床上有效防控該病奠定基礎，但弱毒苗存在散毒、毒力易返強、易污染等風險；滅活苗雖然安全性好，但難以誘發(fā)良好的細胞免疫[8-9]，與弱毒苗相比免疫效果較差。因此，如何增強DTMUV滅活疫苗免疫效果，揭示其免疫增強機制，可為臨床上DTMUV感染的有效防控提供新思路、新方法，在該病的早期防控中意義重大。

Toll樣受體（TLRs）活化后可誘導機體天然免疫應答，尤其是TLR3、TLR7、TLR8、TLR9等在機體抗病毒免疫中發(fā)揮重要作用[10-11]。TLR3的配體主要是雙鏈RNA，RNA病毒（病毒復制過程中天會產生雙鏈RNA）和人工合成的雙鏈RNA，如poly（I:C），均可激活TLR3，啟動天然免疫應答，進而激活機體的特異性免疫，發(fā)揮抗病毒作用[12-15]。本研究采用TLR3配體和滅活DTMUV作用雛鴨外周血單個核細胞（PBMC），檢測不同時間點TLR3、相關信號蛋白及細胞因子水平，初步明確TLR3配體對DTMUV滅活疫苗免疫應答的增強作用。通過以上研究，旨在闡明TLR3配體對DTMUV滅活疫苗的免疫增強機制，從而揭示TLR3配體在機體免疫應答方面的作用機制，為臨床新型疫苗佐劑的研制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及病毒 SPF鴨胚購自中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所。SPF鴨胚在孵化箱中孵化出雛鴨，飼養(yǎng)雛鴨生長至1周齡。鴨坦布蘇病毒SDSG株由山東農業(yè)大學禽病研究所分離保存，該毒株（GenBank登錄號：KJ740746）是2013年從山東省某發(fā)病鴨場分離，雞胚半數致死量為104.8ELD50/0.2 mL。

1.2 試劑 鴨IL-6、α-IFN、β-IFN、γ-IFN ELISA檢測試劑盒購自上海朗頓生物科技有限公司，TLR3配體Poly（I:C）購自購自InvivoGen 公司，雛鴨外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）分離試劑盒購自碧云天生物技術有限公司，DH5α購自北京康為世紀生物科技有限公司，β-丙內酯購自Ferak 公司，RNAsimple 總RNA提取試劑盒（DP419）購自天根生化科技（北京）有限公司，pMD18-T試劑盒、SYBR Premix Ex Taq、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、DNA凝膠純化試劑盒等購自寶生物工程（大連）限公司，ddH2O、PCR mix購自北京索萊寶科技有限公司，RPMI-1640 培養(yǎng)基和胎牛血清購自Invitrogen公司，FITC標記的山羊抗小鼠IgG（H+L）購自北京全仕金生物技術有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.3 雛鴨外周血單個核細胞（PBMC）的制備及培養(yǎng) 無菌采集1周齡SPF雛鴨的外周抗凝血與等量Hank′s液混勻，加到淋巴細胞分離液的液面上，2000×g水平離心20 min。離心后分為三層，在上、中層界面處有一層以單個核細胞為主的白色云霧層，即為外周血單個核細胞，吸取后用Hank′s液洗滌兩次。用含有10%小牛血清的RPMI1640重懸細胞，調整細胞密度為1×106個/mL，分裝至6孔細胞培養(yǎng)板，放置于5%CO2的細胞培養(yǎng)箱37℃孵育2 h，備用。

1.4 病毒滅活及試驗分組 將1mL DTMUV（1×104.8ELD50/0.2 mL）經0.05%β-丙內酯4℃作用12 h，再經37℃ 孵育2 h，DEF細胞中傳三代，沒有細胞病變且RT-PCR檢測為陰性即病毒滅活成功。TLR3配體poly（I:C）與滅活DTMUV共同孵育雛鴨PBMC，試驗分4組：a.po ly（I:C）（20 μg/mL，100 μL/孔）與滅活DTMUV（100 μL/孔）共同孵育雛鴨PBMC，b.poly（I:C）（20 μg/mL）（100 μL/孔）單獨孵育雛鴨PBMC，c.滅活DTMUV（100 μL/孔）單獨孵育雛鴨PBMC，d.RP MI-1640 對照組。分別收集作用4、8、12 h后各組樣品，離心，取上清液和細胞沉淀，-20℃?zhèn)溆谩Ｃ拷M樣品做3個重復。

1.5 SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法的建立 根據GenBank上發(fā)布的鴨細胞因子IL-6（XM 027450925）、鴨α-IFN（EF053034）、鴨β-IFN（KM035791）、鴨γ-IFN（AF087134）、TLR3（KU949327）、MyD88（KP729184）、T R I F（K J 4 6 6 0 5 1）以及內參基因G A P D H（XM038180584）的基因序列，利用Primier Premier 5.0軟件設計引物，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。PCR擴增片段與pMD18-T載體連接，構建IL-6、α-IFN、β-IFN、γ-IFN、TLR3、MyD88、TRIF、GAPDH8的陽性重組質粒，作為熒光定量PCR的陽性標準品。利用陽性標準品建立以GAPDH 為內參的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR，建立標準曲線。

表1 引物序列Table 1 The primer sequence

1.6 TLR3相關細胞因子和信號蛋白轉錄水平的檢測分別收集試驗組和對照組作用4、8、12 h后的PBMC樣品，12 000×g離心5 min，收集離心后的PBMC沉淀，用無菌PBS洗滌3次，采用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，分光光度計測定其純度和濃度。利用反轉錄試劑盒，采用20 μL體系合成1000 ng RNA的cDNA。利用建立的SYBR GreenⅠ實時熒光PCR測定各PBMC樣品中IL-6、α-IFN、β-IFN、γ-IFN以及信號蛋白TLR3、TRIF、MyD88、NF-κB的mRNA轉錄水平。反應體系按照SYBR? Premix Ex Taq?kit說明書進行配制：SYBR? Premix Ex Taq?（2×）12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，RNA模板1000 ng，ddH2O補充至25 μL。每組樣品做3個重復。

1.7 雛鴨PBMC細胞上清液中細胞因子和干擾素含量的檢測 分別收集試驗組和對照組作用4、8、12 h后的PBMC樣品，12 000× g離心5 min，收集離心后的細胞上清液，通過商品化的ELISA 試劑盒檢測IL-6、α-IFN、β-IFN、γ-IFN的含量，測定方法依據檢測試劑盒說明書的步驟。

1.8 NF-κB 對雛鴨PBMC分泌細胞因子和干擾素影響的檢測 為了研究NF-κB對雛鴨PBMC分泌細胞因子和干擾素的影響，用濃度為5 μmol/L的 NF-κB 抑制劑BAY11-7082和DMSO分別預處理雛鴨PBMC 2 h，再用poly（I:C）和滅活DTMUV的不同組合孵育雛鴨PBMC 8 h，收集細胞樣品，12 000×g離心5 min，收集離心后的PBMC沉淀，提取細胞總RNA，熒光定量PCR檢測細胞因子mRNA的轉錄水平。

2 結果

2.1 SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法的建立 構建8個重組質粒T-IL-6、T-α-IFN、T-β-IFN、T-γ-IFN、T-TLR3、T-MyD88、T-TRIF、T-GAPDH，PCR對其進行鑒定，分別獲得IL-6基因136 bp，α-IFN基因230 bp、β-IFN基因201 bp、γ-IFN基因247 bp，TLR3基因201 bp，TRIF基因101 bp，MyD88基因187 bp以及GAPDH基因176 bp，如圖1所示。以上重組質粒的測序結果與 GenBank 中發(fā)布的核酸序列比對，同源性均為100%。優(yōu)化試驗確定了實時熒光定量PCR反應的最佳退火溫度、引物濃度、循環(huán)次數、循環(huán)條件等指標。優(yōu)化后的實時熒光定量PCR反應體系為：2×SYBR GreenⅠPremix 12.5 μL，模板1000 ng，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，加ddH2O至25 μL。反應條件優(yōu)化后為：94℃預變性4 min；94℃變性15 s，59℃退火45 s，反應40個循環(huán)。

圖1 陽性標準品的PCR鑒定Fig.1 PCR identification of the standard plasmids

2.2 不同時間雛鴨PBMC中細胞因子轉錄水平的檢測TLR3 配體poly（I:C）與DTMUV 滅活抗原共同孵育雛鴨PBMC 4、8、12 h后，分別收集細胞沉淀，提取細胞總RNA，熒光定量PCR檢測不同組相關細胞因子（IL-6）和干擾素（α-IFN、β-IFN、γ-IFN）的mRNA轉錄水平，結果如圖2所示。滅活DTMUV孵育組與RPMI-1640對照組，細胞因子和干擾素mRNA的表達量維持在本底水平；與滅活DTMUV孵育組、RPMI-1640對照組相比，poly（I:C）+滅活DTMUV孵育組中細胞因子和干擾素mRNA 的表達水平從孵育后4 h開始升高，4、8、12 h表達水平均差異顯著（P＜0.05）。與滅活DTMUV孵育組、RPMI-1640對照組相比，poly（I:C）組在孵育4 h后，細胞因子和干擾素mRNA 的表達水平開始升高，但差異不顯著；孵育12 h后，IL-6及干擾素mRNA 的表達水平升高顯著（P＜0.05）；尤其是β-IFN和γ-IFN，孵育8h后轉錄水平開始升高，且差異顯著（P＜0.05）。poly（I:C）組與poly（I:C）+滅活DTMUV孵育組相比，IL-6及干擾素mRNA 的轉錄水平低，且差異顯著（P＜0.05）。

圖2 不同時間細胞因子的轉錄水平Fig.2 Transcription levels of cytokines at different times

2.3 雛鴨PBMC中細胞因子表達水平的檢測 TLR3配體poly（I:C）與滅活DTMUV的不同組合分別孵育雛鴨PBMC 4、8、12 h后，收集細胞上清液，采用商品化ELISA試劑盒進行細胞因子蛋白表達水平的檢測。按照說明書的步驟，檢測不同試驗組雛鴨PBMC上清中細胞因子（IL-6）和干擾素（α-I FN）的含量，結果 如 圖3所示。滅活DTMUV孵育組與RPMI-1640對照組，細胞因子和干擾素的蛋白表達水平始終較低，沒有升高趨勢。與滅活DTMUV孵育組和對照組相比，poly（I:C）+滅活DTMUV組中細胞因子和干擾素的含量從孵育后4 h開始升高，孵育8 h后細胞因子含量升高顯著（P＜0.05），孵育12 h后各細胞因子含量持續(xù)升高，且差異顯著（P＜0.05）。poly（I:C）組在孵育12 h后，細胞因子和干擾素蛋白表達量升高明顯，分別與滅活DTMUV孵育組和RPMI-1640對照組相比，差異顯著。但與poly（I:C）+滅活DTMUV孵育組相比，各細胞因子和干擾素表達水平較低，且差異顯著（P＜0.05）。可見，細胞因子（IL-6）和干擾素（α-IFN、β-IFN、γ-IFN）蛋白含量水平與轉錄水平的檢測結果是一致的。

圖3 不同時間細胞因子的蛋白表達水平Fig.3 Protein expression levels of different cytokines at different times

2.4 鴨PBMC中信號蛋白TLR3、TRIF、MyD88和NF-κB轉錄水平的檢測 TLR3配體poly（I:C）與滅活DTMUV的不同組合分別與雛鴨PBMC作用4、8、12 h，熒光定量PCR檢測各組TLR3、TRIF、MyD88及NF-κB的轉錄水平，結果如圖4所示。滅活DTMUV孵育 組和RPMI-1640對照組，TLR3、TRIF、MyD8 8及NF- κB的轉錄水 平，即mRNA的表達量始終保持在本底水平。與滅活DTMUV孵育組、RPMI-1640對照組相比，poly（I:C）+滅活DTMUV孵育組中，TLR3、TRIF的mRNA轉錄水平在8 h和12 h升高顯著（P＜0.05）；MyD88 mRNA轉錄水平升高不明顯；NF-κB的mRNA的轉錄水平8 h明顯升高，12 h升高顯著（P＜0.05）。poly（I:C）孵育組中，TLR3和TRIF的mRNA轉錄水平從8 h開始升高，12 h升高顯著（P＜0.05），但轉錄水平均低于poly（I:C）+DTMUV滅活抗原孵育組；MyD88的mRNA轉錄水平基本沒有升高；NF-κB的mRNA轉錄水平升高不顯著。

圖4 不同時間信號蛋白的轉錄水平Fig.4 Transcription levels of different signaling protein at different times

2.5 NF-κB對雛鴨PBMC細胞因子分泌的影響 先用濃度為5 μM的 N F-κB抑制劑BAY11-7082和DMSO分別作用雛鴨PBMC 2 h，再用poly（I:C）與滅活DTMUV的不同組合分別孵育雛鴨PBMC，熒光定量PCR檢測細胞因子（IL-6）和干擾素（α-IFN、β-IFN、γ-IFN）mRNA的相對表達量，結果如圖5所示。poly（I:C）+滅活DTMUV組和poly（I:C）組，NF-κB抑制劑作用組，各細胞因子mRNA的轉錄水平較未作用組下降顯著（P＜0.05）。而滅活DTMUV孵育組和RPMI-1640對照組，NF-κB抑制劑作用組和未作用組，各細胞因子mRNA的轉錄水平始終處于較低水平。以上結果表明，NF-κB對poly（I:C）+滅活DTMUV孵育組細胞因子和干擾素的產生發(fā)揮重要的調節(jié)作用。

圖5 NF-κB抑制后細胞因子的轉錄水平Fig.5 Transcription levels of different cytokines after the inhibition of NF-κB

3 討論

DTMUV感染是近年來我國出現的一種水禽病毒性傳染病，其他禽類偶爾也能感染。由于該病傳播快，肉鴨、蛋鴨均可感染，尤其是肉鴨感染后易繼發(fā)細菌病，造成的死淘率高，蛋鴨感染后對產蛋率和蛋的品質影響大，給養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴重危害[16]。DTMUV滅活疫苗的成功研制為臨床上有效防控該病奠定基礎，滅活苗具備安全性好，使用方便，而且免疫保護力維持時間長等優(yōu)勢；但滅活苗也存在難以誘發(fā)良好的細胞免疫，誘發(fā)免疫保護力較遲等缺點。因此，增強DTMUV滅活苗的免疫水平，誘導更持久和水平更高的免疫保護力，可通過選擇免疫佐劑或免疫增強劑來實現。據報道，TLR3配體Poly（I:C）作為佐劑與火雞皰疹病毒疫苗一同免疫雞群后，機體對馬立克病的抵抗力顯著增強[17]。對禽流感病毒來說，Poly（I:C）能抑制其脫殼，上調1型干擾素、IL-8等表達的作用[18]。這些研究結果均表明TLR3配體具有增強宿主免疫力的作用，可作為禽類病毒疫苗的備選佐劑。本研究通過利用TLR3配體poly（I:C）與滅活DTMUV共同孵育雛鴨PBMC，揭示TLR3配體的免疫增強機制，可為臨床上DTMUV滅活苗免疫增強劑的選擇提供依據，為有效預防DTMUV感染及該病的早期防控奠定基礎。

病原體感染后，TLRs在控制先天性免疫和獲得性免疫中發(fā)揮重要的作用。TLRs受體能激活TLRs，從而增強抗原遞呈細胞如樹突狀細胞的成熟，樹突狀細胞（DCs）與T細胞相互作用后，可以促進T細胞的免疫應答，引起不同細胞因子的大量表達[19]。作為TLR3的受體poly（I:C），可以激活TLR3，募集TRIF與TLR3結合，激活下游信號通路，引起細胞因子和干擾素的表達。由于TLRS主要在單核細胞、淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等表面表達，因此本研究中選擇雛鴨PBMC作為研究對象。TLR3配體poly（I:C）與滅活DTMUV共同孵育雛鴨PBMC 4、8、12 h后，細胞因子IL-6和干擾素IFN-α、IFN-β、IFN-γ的mRNA轉錄水平和蛋白表達均升高。雖然poly（I:C）組的IL-6及干擾素mRNA的表達水平從孵育4 h后也開始升高，但與poly（I:C）+滅活DTMUV孵育組相比，轉錄水平低，且差異顯著（P＜0.05）。而滅活DTMUV組和RPMI-1640對照組，各細胞因子和干擾素mRNA的轉錄水平始終維持在本底水平?？梢姡琾oly（I:C）可以增強雛鴨PBMC對DTMUV的抗原遞呈能力和免疫反應，對滅活的DTMUV有免疫增強效果。

在TLRs家族中，只有TLR3的信號傳導是不依賴髓樣細胞分化因子（MyD88）途徑[20]。TLR3通過胞漿內的接頭蛋白TRIF，激活三種轉錄因子IRF-3、NF-κB和AP-1的表達，從而誘導Ⅰ型干擾素、細胞因子的產生及DC細胞的成熟[21]。為進一步研究TLR3配體poly（I:C）與滅活DTMUV孵育雛鴨PBMC后細胞因子和干擾素的產生機制，將TLR3配體與滅活DTMUV的不同組合與雛鴨PBMC分別孵育4、8、12 h，熒光定量PCR檢測各組細胞的TLR3、TRIF、MyD88及NF-κB的轉錄水平。poly（I:C）+滅活DTMUV孵育組中，TLR3、TRIF的mRNA轉錄水平升高顯著（P＜0.05）；MyD88m的mRNA轉錄水平升高不明顯；NF-κB的mRNA的轉錄水平升高明顯。poly（I:C）孵育組中，TLR3和TRIF的mRNA轉錄水平也升高，但均低于poly（I:C）+滅活DTMUV孵育組?？梢姡琓LR3配體poly（I:C）通過與TLR3結合，激活了TRIF-NF-κB通路，從而引起細胞因子和Ⅰ型干擾素的產生。

如果NF-κB的磷酸化受到抑制，也就抑制了NF-κB信號通路的激活。本研究中，經BAY11-7082 抑制后的poly（I:C）+滅活DTMUV組的雛鴨PBMC，細胞因子和干擾素mRNA的轉錄水平顯著降低，可見NF-κB對poly（I:C）+滅活DTMUV孵育組細胞因子和干擾素的產生發(fā)揮重要的調節(jié)作用。這也表明TLR3配體poly（I:C）通過NF-κB依賴性的信號通路引起相關細胞因子和Ⅰ型干擾素的產生。總之，TLR3配體通過激活雛鴨PBMC中TRIF-NF-κB信號通路顯著提高了細胞因子和Ⅰ型干擾素的表達，TLR3配體增強了雛鴨PBMC捕獲滅活DTMUV的能力，增強了PBMC的免疫功能，可作為DTMUV滅活疫苗的新型候選佐劑。