姜 軒，徐承倩，張 欣，張 奧，趙瑞利，馬吉飛，孫英峰

（天津農(nóng)學(xué)院 動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384）

化膿隱秘桿菌（Arcanobacterium pyogenes）又稱化膿放線菌（Actinomyces pyogenes），屬于隱秘桿菌屬（Arcanobacterium）。該菌最早于1893年從牛的膿汁中分離到，常引起豬、牛、羊等動物的化膿性感染，表現(xiàn)為肺炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、乳腺炎、皮下膿腫等疾病[1]，也曾有化膿隱秘桿菌感染人的事件報道[2]。該菌的臨床致病性與所攜帶的毒力因子密切有關(guān)，目前已報道的化膿隱秘桿菌毒力因子有多種，如溶血素（pyolysin,Plo）、神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase,NanH）、膠原結(jié)合蛋白（CbpA）等，其中同時攜帶Plo基因和NanH基因的菌株的致病性要強(qiáng)于攜帶其他幾種毒力因子的菌株[3-5]。本研究對2019年3月從天津地區(qū)某豬場發(fā)病豬的肺臟膿腫中分離到的1株病原菌，進(jìn)行了細(xì)菌常規(guī)鑒定、16S rRNA序列及毒力基因PCR檢測與耐藥性實驗。通過對該病原菌的生物學(xué)特性、遺傳進(jìn)化、毒力因子和耐藥情況，為豬化膿隱秘桿菌的流行病學(xué)調(diào)查及臨床防治提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源 天津市某規(guī)?；i場斷奶仔豬，病豬體溫達(dá)到41℃，食欲廢絕，個別豬嚴(yán)重呼吸困難。無菌條件下采集肺臟膿腫物進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，編號為NF1913。

1.2 試劑與培養(yǎng)基 鮮血平板培養(yǎng)基購自凱林貿(mào)易有限公司；革蘭氏染色試劑盒、藥敏紙片、生化鑒定管等均購自杭州微生物有限公司；10×PCR buffer、dNTP、Taq酶等均購自寶生物工程（大連）有限公司；其他試劑均為分析純。

1.3 試驗動物 健康昆明系小鼠20只，體重18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.4 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中公開發(fā)表的細(xì)菌16S rRNA基因設(shè)計通用性引物。依據(jù)參考文獻(xiàn)[6]合成化膿隱秘桿菌毒力基因Plo、NanH、CbpA、NanP引物。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，具體信息見表1。

表1 本研究使用引物序列Table 1 Primer used in this study

1.5 細(xì)菌的分離培養(yǎng)及純化 在無菌條件下將肺部濃汁劃線培養(yǎng)于鮮血瓊脂平板上，37℃恒溫培養(yǎng)48 h，挑取可疑單克隆菌落進(jìn)一步純化后，將該單克隆菌株命名為TJjh1913，革蘭染色觀察分離株的形態(tài)染色特征。

1.6 細(xì)菌生化試驗 參考文獻(xiàn)[7-8]將純化后的菌液接種至不同細(xì)菌微量生化試驗管內(nèi)，37℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察記錄結(jié)果，參照細(xì)菌生化鑒定手冊進(jìn)行判定。

1.7 藥物敏感性試驗 根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（Clinical & Laboratory Standards Institute,CLSI）推薦的紙片擴(kuò)散法和判斷標(biāo)準(zhǔn)[8]對分離到的菌株進(jìn)行藥敏試驗。取100 μL的新鮮菌液均勻涂布在鮮血平板培養(yǎng)基上，選取藥敏紙片貼在平板表面，倒置放37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，測量抑菌圈直徑判定菌株對藥物的敏感性。

1.8 細(xì)菌16S rRNA 基因與毒力基因PCR擴(kuò)增與測序 按照DNA抽提試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA提取，進(jìn)行16S rRNA及毒力相關(guān)基因的PCR擴(kuò)增與測序。擴(kuò)增體系：DNA模板5 μL，10× PCR buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，上、下游引物各 1 μL，Taq 酶 0.5 μL，用ddH2O 補(bǔ)至25 μL。PCR 擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性 30 s，56℃/60℃退火 30 s，72℃延伸 60 s，共35個循環(huán)，72℃再延伸10 min。以 1%瓊脂糖核酸凝膠電泳檢測 PCR 產(chǎn)物。并按照DNA凝膠回收試劑盒的操作說明進(jìn)行切膠回收，連接pMD19-T載體并轉(zhuǎn)入JM109感受態(tài)細(xì)胞，將陽性菌液送生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行基因序列測定。將測序結(jié)果與NCBI中GenBank登錄的序列進(jìn)行比對，運(yùn)用DNAStar軟件將所得序列和參考序列進(jìn)行同源性比較并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.9 小鼠致病性試驗 將小鼠隨機(jī)分成5組，每組5只，第1～4組為實驗組，第5組為空白對照組[6]。依次將108、107、106、105CFU/mL化膿隱秘桿菌菌液培養(yǎng)物分別腹腔注射試驗組小鼠，0.1 mL/只。對照組注射相同劑量液體培養(yǎng)基。各組接種后隔離飼養(yǎng)，每12 h觀察小鼠臨床表現(xiàn)。對各組出現(xiàn)癥狀及死亡的小鼠進(jìn)行剖檢，分離細(xì)菌并鑒定及病理組織切片觀察。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果 病料接種鮮血瓊脂平板，置于37℃條件下培養(yǎng)48 h后長出肉眼可見的細(xì)小菌落，菌落呈光滑、濕潤、表面凸起、邊緣整齊、針尖狀乳白色，并呈β溶血現(xiàn)象（圖1）。將分離純化后的菌株進(jìn)行革蘭氏染色。結(jié)果顯示，分離得到的菌株為革蘭氏陽性菌，外形為兩段鈍圓、形態(tài)或曲或直的短小多形態(tài)桿菌（圖1）。

圖1 NF1913在血平板上的菌落形態(tài)與革蘭染色結(jié)果Fig.1 The result of colony morphology and Gram stain of NF1913

2.2 細(xì)菌生化試驗結(jié)果 觀察并記錄不同微量生化培養(yǎng)管內(nèi)顏色的變化，參照試劑盒內(nèi)說明書的判定標(biāo)準(zhǔn)與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》，將實驗結(jié)果進(jìn)行對比，其特性與化膿隱秘桿菌相似，結(jié)果初步判定為化膿隱秘桿菌（表2）。

表2 NF1913的生化試驗結(jié)果Table 2 Biochemical test result of NF1913

2.3 藥敏試驗結(jié)果 結(jié)果顯示，頭孢類藥物（頭孢噻呋、頭孢哌酮、頭孢唑林、頭孢曲松）和部分喹諾酮類（左氧氟沙星、環(huán)丙沙星）高度敏感；對氨基糖苷類藥物（丁胺卡那、慶大霉素、新霉素）、甲硝唑、林可霉素、桿菌肽等耐藥（表3）。

表3 NF1913藥敏試驗結(jié)果Table 3 Drug sensitivity test results of NF1913

2.4 細(xì)菌NF1913 16SrRNA基因擴(kuò)增結(jié)果 通過16S rRNA引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測序結(jié)果顯示，本次分離得到的菌株為化膿隱秘桿菌，該菌株與中國新疆株（GenBank登錄號：JX975440）的基因同源性高達(dá)98%，與國內(nèi)外已發(fā)表的分離自水牛、山羊、豬等動物體內(nèi)的化膿隱秘桿菌的基因同源性達(dá)95%以上。從圖2建立的菌株進(jìn)化樹可以看出，分離菌株NF1913與JX975440（中國新疆）關(guān)系最近；與CP029004與CP033902的關(guān)系相對較遠(yuǎn)。說明本次分離的菌株與國內(nèi)和國外其他分離株存在地域差異。

圖2 基于16S rRNA基因核酸序列遺傳進(jìn)化樹Fig.2 The phylogenetic tree based on the nucleotide sequence of l6S rRNA gene

2.5 毒力基因PCR擴(kuò)增結(jié)果 將NF1913的4種毒力基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，本分離株同時攜帶有Plo、NanH、CbpA三種毒力基因（圖3），與之前報道的同時攜帶Plo基因和NanH基因的菌株的致病性要強(qiáng)于攜帶其他幾種毒力因子的菌株，推測該分離株具有較強(qiáng)致病力。

圖3 毒力基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 The results of virulence genes detection

2.6 小鼠致病性試驗結(jié)果 昆明系小鼠接種NF1913菌株后12 h開始出現(xiàn)死亡，其他小鼠精神沉郁，采食活動減少等臨床癥狀；18 h后攻毒108CFU/mL試驗組小鼠全部死亡，對照組小鼠未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象且精神食欲均正常。按照Reed-Muench法計算出菌株NF1913的LD50為2.04×105CFU。小鼠病理組織切片顯示，正常組織肺泡壁較薄且均勻，其他組織無充血、水腫等病理變化，攻毒小鼠各臟器均出現(xiàn)不同程度的水腫和炎性細(xì)胞浸潤，肺臟組織可見肺泡腔內(nèi)有少量紅細(xì)胞、肺泡壁毛細(xì)血管增厚等病理變化（圖4A～D）。采集死亡小鼠臟器進(jìn)行細(xì)菌分離并進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增及測序，結(jié)果與從病豬體內(nèi)分離到的化膿隱秘桿菌一致。

表4 不同濃度菌株N1913的小鼠毒力試驗Table 4 Mice toxicity test of strain N1913 at different concentrations

圖4 小鼠組織石蠟切片（400×）Fig.4 Paraffin section of mouse tissue （400×）

3 討論

化膿隱秘桿菌作為隱秘桿菌屬中致病力最強(qiáng)的病原體，是常存在于家畜（豬、牛、羊）體內(nèi)的條件致病菌，可引起動物發(fā)生肺炎、乳房炎、子宮內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎及腎臟膿腫等疾病，嚴(yán)重時可因敗血癥引起家畜死亡[9]。該菌能感染的動物種類廣泛，多引起反芻動物（牛、羊）等動物的發(fā)病，但近年來該菌感染豬的病例時有發(fā)生，魯興華等[10-12]分別在上海市、廣東省、四川省等地分離到豬源化膿隱秘桿菌。本試驗從天津一規(guī)模化豬場病死豬體內(nèi)分離出隱秘化膿桿菌，表明該細(xì)菌病的發(fā)病范圍在不斷擴(kuò)大，特別是在規(guī)模化豬場不斷擴(kuò)大的情況下，更應(yīng)該提高對該病的防范意識和采取有效的治療措施。

本試驗將分離到的菌株進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹分析，結(jié)果表明該菌株與JX975440（中國新疆）、KP159746（中國河北）親緣關(guān)系最近；與國外其他分離株的親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)，說明該菌的流傳存在地域差異?；撾[秘桿菌的致病性與其攜帶的毒力因子有關(guān)，本株化膿隱秘桿菌攜帶Plo（溶血素）、NanH（神經(jīng)氨酸酶）、CbpA（膠原結(jié)合蛋白）三種毒力基因，其中Plo對牛多形核粒細(xì)胞具有毒性效應(yīng)[13]，神經(jīng)氨酸酶分為NanH與NanP，具有多種毒力作用，能夠增強(qiáng)細(xì)菌的粘附力和感染力。小鼠致病力試驗結(jié)果顯示，該菌對小鼠具有強(qiáng)致病力，說明分離得到的菌株具有致病性，其中可能與該菌攜帶NanH毒力基因有關(guān)。該菌從豬肺臟膿腫中分離，對豬的致病力尚不清楚，需后續(xù)動物回歸試驗證明。有研究表明從豬膿腫中分離到的化膿隱秘桿菌、金黃色葡萄球菌以及停乳鏈球菌是造成豬表皮膿腫的原因[14]，本試驗從仔豬肺膿腫中分離到的化膿隱秘桿菌沒有其他細(xì)菌混合感染的現(xiàn)象，表明該菌作為病原菌的影響逐步擴(kuò)大。

我國對化膿隱秘桿菌的致病機(jī)理及流行病學(xué)調(diào)查還尚不完全，特別是現(xiàn)代化規(guī)模豬場范圍的擴(kuò)大，化膿隱秘桿菌作為條件致病菌常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病病毒、巴氏桿菌等混合感染引起發(fā)病，豬場飼養(yǎng)人員應(yīng)注意找準(zhǔn)病因，對癥治療，并注意敏感抗生素之間交替用藥防止出現(xiàn)耐藥性。本次試驗通過藥敏試驗篩選出對頭孢噻呋、阿莫西林、左氧氟沙星、頭孢哌酮、頭孢唑林、頭孢曲松等抗生素高度敏感，對新霉素、林可霉素、丁胺卡那等常見抗生素出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。本研究為天津地區(qū)規(guī)?；i場化膿隱秘桿菌的預(yù)防和深入研究提供了試驗依據(jù)和用藥參考。