姚 妹 馮藝杰 夏 雨 周棟明 金佳寧 魏 佳 崔易沁 毛姍姍

浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 國(guó)家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心（浙江杭州 310052）

脊髓性肌萎縮癥[spinal muscular atrophy,SMA,OMIM：#253300(SMA 1)、#253550(SMA 2)、#253400(SMA3)、#271150(SMA4)]是一種以進(jìn)行性、對(duì)稱性肌萎縮和肌無(wú)力為主要特征的常染色體隱性遺傳神經(jīng)肌肉疾病，發(fā)病率為1/10000～1/6000，人群攜帶率約1/50。其致病機(jī)制為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活（spinal muscular neuron gene 1,SMN1）基因純合缺失或變異[1-2]，95%患者為SMN1第7外顯子純合缺失，另5%則為SMN 1第7 外顯子缺失合并雜合性點(diǎn)突變或其他變異類型。SMN2作為SMN1高度同源基因，與之僅有5 個(gè)堿基的差異，其中1 個(gè)堿基位于編碼區(qū)，即SMN2第7號(hào)外顯子第6位氨基酸c.840T，而SMN 1為c.840 C，兩者的高度同源性增加了變異位點(diǎn)的區(qū)分難度[3-6]?，F(xiàn)階段，SMA常規(guī)基因檢測(cè)方法多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA）僅可檢出SMN1純合缺失即0 拷貝，疑似復(fù)合雜合變異患者則需經(jīng)長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增技術(shù)或TA克隆確診點(diǎn)突變，但以上方法無(wú)法有效識(shí)別出SMN1 2拷貝位于同一條染色體，另一條染色體SMN1丟失的“2+0”型隱性遺傳病攜帶者，極易造成診斷延誤，增加家系再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[7]。本研究報(bào)告1例罕見(jiàn)的復(fù)合雜合變異SMA-Ia型患兒的臨床及家系遺傳學(xué)資料，探討排查隱性遺傳病攜帶者重要性，提高疾病認(rèn)知，力爭(zhēng)早期識(shí)別并評(píng)估其子代患病風(fēng)險(xiǎn)，指導(dǎo)遺傳咨詢，保證健康生育。

1 病例資料

患兒，男，2月齡，漢族，因出生后哭聲低弱、四肢無(wú)力就診于浙江大學(xué)兒童醫(yī)院(具體時(shí)間軸見(jiàn)圖1)?；純合礕 1 P 1，足月順產(chǎn)，出生體質(zhì)量3 400 g，生后即哭，哭聲弱，無(wú)窒息史，Apgar 評(píng)分均10 分。父母體健，非近親婚配，否認(rèn)遺傳病家族史，母孕期無(wú)異常。體格檢查：神清，精神可，哭聲低弱，前囟平軟，頸軟，心肺腹無(wú)異常；四肢自發(fā)活動(dòng)少，四肢肌力Ⅱ級(jí)，肌張力低下，雙跟膝腱反射未引出，雙側(cè)巴氏征陰性。輔助檢查：血常規(guī)、血?dú)怆娊赓|(zhì)、生化、血氨均正常。頭顱MRI 未見(jiàn)明顯異常，肌電圖示脊髓前角細(xì)胞病變。綜合患兒典型臨床表現(xiàn)及輔助檢查，高度疑診SMA。

圖1 先證者及其家系診斷、隨訪時(shí)間軸

為明確病因，經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理會(huì)審查批準(zhǔn)（No.2019-IRB-171）及家屬簽署知情同意書(shū)后，采集患兒及其父母外周血行MLPA 檢測(cè)。結(jié)果顯示先證者SMN1為1拷貝，SMN2為2拷貝，其父母SMN1均為2拷貝（圖2）。推測(cè)患兒屬SMA復(fù)合雜合變異，依據(jù)《脊髓性肌萎縮癥遺傳學(xué)診斷專家共識(shí)》診斷流程，應(yīng)用SMN1特異性長(zhǎng)片段PCR結(jié)合巢式PCR探查點(diǎn)突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)患兒SMN 1存在c.22_23 insA變異（圖3）。進(jìn)一步通過(guò)Sanger 測(cè)序?qū)純弘p親進(jìn)行驗(yàn)證，患兒母親存在c.22_23insA變異（圖4），父親未檢出該位點(diǎn)致病變異，確證點(diǎn)突變遺傳自母親。故綜合應(yīng)用MLPA、Sanger 測(cè)序及長(zhǎng)片段PCR 結(jié)合巢式PCR 確診該患兒屬SMN 1“1d+0”型復(fù)合雜合變異（1d：c.22_23insA，ACMG變異分類屬致病性變異），其母親為“1+1d”型隱性遺傳病攜帶者，一代驗(yàn)證明確點(diǎn)突變遺傳于母親。同時(shí)，患兒SMN 1另一條等位基因的缺失原因有待明確，由于患兒父親SMN 1亦為2 拷貝，根據(jù)基因遺傳規(guī)律，考慮父親SMN 1為“1+1”或“2+0”基因型可能。因此采集家系三代其他成員外周血行MLPA 技術(shù)，結(jié)果顯示患兒祖父SMN1拷貝數(shù)為1，祖母及姑姑SMN1均為3拷貝（圖2），進(jìn)一步通過(guò)短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat,STR）的家系連鎖分析法確證患兒父親為SMN 1“2+0”型的特殊隱性遺傳病攜帶者（圖5）。

圖2 先證者及其家系MLPA 結(jié)果

圖3 先證者長(zhǎng)片段PCR 結(jié)合巢式PCR 結(jié)果

圖4 先證者母系家系成員Sanger 測(cè)序驗(yàn)證c.22_23insA 變異結(jié)果

圖5 先證者三代家系10 位成員STR 連鎖分析圖

根據(jù)本例患兒起病年齡及SMN 2拷貝數(shù)，確診其屬型SMA。雖因家庭經(jīng)濟(jì)條件限制，患兒未能接受疾病修正藥物諾西那生鈉注射治療，但我院立即予其多學(xué)科管理與個(gè)體化指導(dǎo)，包括呼吸、消化營(yíng)養(yǎng)及康復(fù)訓(xùn)練等各系統(tǒng)照護(hù)，并對(duì)該家系進(jìn)行隨訪、疾病健康教育及遺傳咨詢。對(duì)該家系隨訪2年，期間患兒發(fā)生肺部感染4次，最終因呼吸道感染、呼吸衰竭于6月齡死亡。先證者去世1個(gè)月后其母親再次妊娠，并于孕8周時(shí)經(jīng)絨毛穿刺行產(chǎn)前診斷，結(jié)果提示胎兒未攜帶變異位點(diǎn)，排除SMA患者可能，于2021年1月生育1名健康女?huà)耄壳耙?1月齡，運(yùn)動(dòng)發(fā)育正常。

2 討論

SMA位居2歲以下嬰幼兒致死致殘性疾病首位，2018年列入我國(guó)《第一批罕見(jiàn)病目錄》。根據(jù)起病年齡和可達(dá)到的最大運(yùn)動(dòng)能力，臨床分為0 型、Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型，兒童期常見(jiàn)Ⅰ、Ⅱ型與Ⅲ型，其中以生后3個(gè)月內(nèi)起病的Ⅰa型病情最為嚴(yán)重，多伴有嚴(yán)重肌無(wú)力、肌張力低下、頭控弱等表現(xiàn)，無(wú)法獨(dú)坐，常因肋間肌薄弱、吞咽吸吮困難、胃食管反流等問(wèn)題并發(fā)吸入性肺炎甚至呼吸衰竭，無(wú)藥物治療及多學(xué)科管理支持下其生存期常低于2年[8-9]。國(guó)內(nèi)外SMA 診斷專家共識(shí)明確指出基因檢測(cè)可確診該疾病,并以MLPA技術(shù)為其診斷金標(biāo)準(zhǔn)。然而MLPA技術(shù)僅可明確診斷SMN 1純合缺失患者，當(dāng)SMN 1拷貝數(shù)≥1 時(shí)，需進(jìn)一步行長(zhǎng)片段PCR 結(jié)合巢式PCR或RT-克隆測(cè)序驗(yàn)證其是否為復(fù)合雜合變異患者[10]。此外，MLPA技術(shù)無(wú)法區(qū)分SMN1均為2拷貝的“1+1”型正常人與“2+0”型隱性遺傳病攜帶者，這亦將增加遺傳咨詢的假陰性，致使SMA 患兒出生，給家庭及社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。因此及早識(shí)別復(fù)合雜合變異，排查隱性遺傳病攜帶者有利于SMA 精準(zhǔn)診治，基于家系框架圖開(kāi)展高質(zhì)量的遺傳咨詢，促進(jìn)健康生育。

本例患兒以生后哭聲低弱、四肢無(wú)力典型臨床特征起病，肌電圖提示脊髓前角細(xì)胞病變，臨床高度疑診SMA。MLPA結(jié)果顯示患兒SMN1拷貝數(shù)為1，進(jìn)一步經(jīng)長(zhǎng)片段PCR結(jié)合巢式PCR確證患兒SMN1存在致病變異位點(diǎn)c.22_23insA(p.Ser8LysfsX23)，診斷該患兒為復(fù)合雜合變異（1d+0）。本例患兒屬型，起病后6 個(gè)月去世，生存時(shí)間短，符合疾病自然病史特點(diǎn)。國(guó)外研究報(bào)道諾西那生鈉可顯著降低型患兒病死率、提高運(yùn)動(dòng)里程碑[11-12]，我國(guó)仍缺乏藥物治療SMA 的真實(shí)世界數(shù)據(jù)，隨著藥物納入國(guó)家醫(yī)保，未來(lái)有望使更多型患兒獲得疾病修正治療機(jī)會(huì)。

本研究對(duì)先證者家系三代共10 位成員進(jìn)行基因檢測(cè)。通過(guò)STR 連鎖分析和Sanger 測(cè)序明確診斷患兒雙親均為隱性遺傳病攜帶者，其母親SMN 1為“1d+1”型1 d:c.22_23 insA(p.Ser 8 LysfsX 23)，父親為罕見(jiàn)的“2+0”型，患兒SMN 1基因第7 號(hào)外顯子缺失遺傳自父親，另一條SMN 1基因突變位點(diǎn)遺傳自母親。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，c.22_23 insA(p.Ser 8 LysfsX 23)位點(diǎn)致病性明確，為中國(guó)人群最常見(jiàn)的變異位點(diǎn)之一，占比37.5%，該變異為編碼肽鏈22 號(hào)及23 號(hào)堿基之間插入1 個(gè)腺嘌呤，進(jìn)而導(dǎo)致絲氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)橘嚢彼?，并在新閱讀框的第23位產(chǎn)生終止密碼子，通過(guò)蛋白質(zhì)截短或無(wú)義介導(dǎo)的mRNA 衰變導(dǎo)致SMN 蛋白功能喪失[13]。而“2+0”基因型屬SMA特殊類別的攜帶者，其人群攜帶率僅為5%～8%[14]，但現(xiàn)階段金標(biāo)準(zhǔn)MLPA 技術(shù)并不能區(qū)分“2+0”基因型與“1+1”基因型。本研究聯(lián)合應(yīng)用MLPA 技術(shù)、長(zhǎng)片段PCR 結(jié)合巢式PCR、Sanger測(cè)序與STR連鎖分析多種檢測(cè)技術(shù)，最終明確先證者及其家系SMN1基因型，確證先證者為SMA復(fù)合雜合變異患者，并發(fā)現(xiàn)其父母雙方均為特殊類型的隱性遺傳病攜帶者，該種家系遺傳物質(zhì)的傳遞組合方式尚未見(jiàn)報(bào)道。Alías等[15]在一項(xiàng)涉及1 562例的SMN1“2+0”基因型攜帶者篩查隊(duì)列中發(fā)現(xiàn)，僅3個(gè)家系雙親中存在“2+0”型，其中2 個(gè)家系父母雙方SMN1基因型均為“2+0”型。Ar Rochmah等[16]檢測(cè)33 例SMA 患者及其家系的SMN1拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)僅2例父母攜帶2個(gè)SMN1拷貝，其中1例純合缺失SMA患者母親基因型為“2+0”型，父親為“1+0”型；另1例則為復(fù)合雜合變異者“0+1d”型，其父親為“1+1d”型，母親為“1+0”型。我國(guó)學(xué)者在一項(xiàng)中國(guó)SMA患者家系SMN 1“2+0”基因型攜帶者研究中共確定了9個(gè)家系中的 10 例個(gè)體為“2+0”基因型攜帶者[17]?？偨Y(jié)國(guó)內(nèi)外有關(guān)隱性遺傳病攜帶者的研究報(bào)告發(fā)現(xiàn)，其報(bào)道的所有“2+0”基因型攜帶者家系內(nèi)均為純合缺失SMA患者。本例患兒的父母雙親為特殊類型隱性遺傳病攜帶者，該家系遺傳特點(diǎn)在常規(guī)SMA攜帶者篩查中極易漏診，明確特殊家系基因遺傳方式，可避免家系再發(fā)SMA患者?；诰珳?zhǔn)的家系遺傳學(xué)診斷與詳盡的遺傳咨詢，先證者母親再次妊娠并行產(chǎn)前診斷未發(fā)現(xiàn)胎兒攜帶相同致病位點(diǎn)，排除胎兒為SMA 患者可能，最終順利孕育1 名健康女?huà)搿?/p>

對(duì)于復(fù)合雜合變異患者，合理應(yīng)用MLPA 聯(lián)合長(zhǎng)片段PCR結(jié)合巢式PCR可實(shí)現(xiàn)疾病早期診斷，縮短患者治療的時(shí)間窗。針對(duì)隱性遺傳病攜帶者，尤其是雙親SMN 1均為2 拷貝而患兒為復(fù)合雜合變異者，更應(yīng)高度警惕特殊家系遺傳可能，為降低SMA隱性遺傳病攜帶者殘留風(fēng)險(xiǎn)，建議應(yīng)用多態(tài)標(biāo)記以提高“2+0”基因型的特殊隱性遺傳病攜帶者檢出率，以真正實(shí)現(xiàn)SMA 三級(jí)預(yù)防，減少出生缺陷，提高人口素質(zhì)。