袁夢嵐, 李承堯, 白潔, 陳旭紅, 劉曉智, 李圃△

天津市第五中心醫(yī)院 1婦產(chǎn)科， 3天津市早產(chǎn)兒器官發(fā)育表觀遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(天津 300450)； 2天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院婦產(chǎn)科(天津 300052)

子宮內(nèi)膜癌是婦科最常見的原發(fā)性腫瘤之一，嚴(yán)重影響女性生命與健康[1]。雖然近年來隨著手術(shù)術(shù)式的革新，放、化療方案的更新，以及基因治療、生物治療等新興技術(shù)的應(yīng)用，子宮內(nèi)膜癌患者的生存期和生活質(zhì)量都有了一定程度的提升，但是截至目前，子宮內(nèi)膜癌的總體生存率仍不容樂觀[2]。小泛素相關(guān)修飾蛋白(Small ubiquitin-related modifier，SUMO)是近些年來新發(fā)現(xiàn)的一類結(jié)構(gòu)與泛素相似但功能迥異的小分子蛋白質(zhì)[3]。它通過與靶蛋白上的特定賴氨酸位點(diǎn)共價(jià)結(jié)合，或者通過相互作用基序與靶蛋白偶聯(lián)，以蛋白復(fù)合體形式調(diào)節(jié)靶蛋白的構(gòu)象、移位及降解等生理、病理反應(yīng)[4]。現(xiàn)已證明，參與腫瘤細(xì)胞遷移的兩個(gè)責(zé)任蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)[5]和MMP-13[6]均接受SUMO1調(diào)控，參與調(diào)節(jié)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。但是在子宮內(nèi)膜癌中，MMP-9和MMP-13介導(dǎo)的腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是否同樣接受SUMO1的修飾和調(diào)控仍未可知。因此，2019年7月至2020年12月將就該問題展開研究，并嘗試通過靶向抑制蛋白質(zhì)SUMO化修飾反應(yīng)中的關(guān)鍵酶泛素連接酶-9(ubiquitin-binding enzyme 9，Ubc9)發(fā)揮阻遏子宮內(nèi)膜癌侵襲和轉(zhuǎn)移的目的，為未來靶向子宮內(nèi)膜癌的精準(zhǔn)治療提供理論依據(jù)。研究經(jīng)過天津市第五中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理審查(倫理號(hào)：TJWZXLL2019029)。

1 材料與方法

1.1 試劑與細(xì)胞 人源性KLE子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株購自美國模式培養(yǎng)物集存庫；胎牛血清、達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium，DMEM)、胰蛋白酶和鼠尾膠均購自美國Gibco公司，磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer，PBS)和青鏈霉素購自美國Sigma公司；壯觀霉素B1購自南京化學(xué)工業(yè)有限公司，N-乙基馬來酰亞胺購自北京太陽能生物科技有限公司；5-乙炔基-2′-脫氧尿苷(5-Ethynyl-2′-deoxyuridine，EdU)細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自北京索萊寶公司；Transwell培養(yǎng)板購自美國康寧公司；Ubc9、SUMO1、MMP-9和MMP-13抗體均購自美國Abcam公司，β-actin抗體購自美國CST公司，二抗購自美國Jackson公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 子宮內(nèi)膜癌KLE細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM中，培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5% CO2，且飽和濕度。每3 d按1∶3比例進(jìn)行細(xì)胞傳代。實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組(加入與壯觀霉素B1等體積的磷酸緩沖液)和壯觀霉素B1組(在常規(guī)DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中加入終濃度為20 μmol/L的壯觀霉素B1)，作用時(shí)間不低于48 h。余細(xì)胞培養(yǎng)條件同前。

1.3 EdU細(xì)胞增殖活性檢測 按照實(shí)驗(yàn)分組將KLE細(xì)胞接種于96孔板中，每孔中加入100 μL終濃度為50 μmol/L的EdU 培養(yǎng)基孵育 2 h，PBS 清洗后繼續(xù)培養(yǎng)48 h；用含 4% 多聚甲醛的 PBS室溫固定30 min，順序加入甘氨酸、TritonX-100后加入Apollo 染色反應(yīng)液，室溫孵育 30 min；最后加入Hoechst 33342 反應(yīng)液，避光、室溫、脫色搖床孵育 30 min；倒置熒光顯微鏡(奧林巴斯CKX41)下觀察EdU陽性細(xì)胞占所有細(xì)胞的百分率。

1.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 按照實(shí)驗(yàn)分組將KLE細(xì)胞接種于12孔板中，待細(xì)胞生長至95%以上融合時(shí)以10 μL槍頭進(jìn)行細(xì)胞劃痕，細(xì)胞倒置顯微鏡下測量劃痕兩側(cè)初始距離，記作S0；繼續(xù)培養(yǎng)48 h后終止實(shí)驗(yàn)，再度測量細(xì)胞間距離，記作S1。根據(jù)公式細(xì)胞遷移距離SΔ=S0-S1計(jì)算細(xì)胞實(shí)際遷移距離。

1.5 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 于實(shí)驗(yàn)前1 d將1∶2稀釋后的鼠尾膠預(yù)先鋪置在Transwell培養(yǎng)皿上室底部，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜；第2天將細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)分組接種于Transwell培養(yǎng)皿上室，下室中加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。然后小心取下Transwell培養(yǎng)皿上室，用結(jié)晶紫在室溫下進(jìn)行染色20 min，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)量。

1.6 Western blot實(shí)驗(yàn) 按照實(shí)驗(yàn)分組將KLE細(xì)胞接種于6孔板中并給予相應(yīng)藥物或PBS對(duì)照處理；48 h后用加有200 mmol/L N-乙基馬來酰亞胺的裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，Bradford 法蛋白定量后，以4%～20%分離膠進(jìn)行蛋白分離，冰浴下120 V轉(zhuǎn)膜60 min，室溫下將膜在5%脫脂奶粉中封閉1 h，然后分別加入抗體Ubc9(1∶1 000)、SUMO1(1∶2 000)、MMP-9(1∶1 000)和MMP-13(1∶500)4℃環(huán)境下孵育過夜，次日以1∶500稀釋的二抗孵育1 h，以超信號(hào)蛋白檢測試劑盒檢測蛋白表達(dá)，凝膠成像系統(tǒng)掃描光密度值，Image J軟件進(jìn)行定量分析。以β-actin(1∶1 000)為內(nèi)對(duì)照，以目的蛋白條帶/β-actin蛋白條帶的比值計(jì)量各蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 EdU細(xì)胞增殖活性檢測結(jié)果 EdU細(xì)胞增殖活性檢測結(jié)果顯示，對(duì)照組和壯觀霉素B1組子宮內(nèi)膜癌KLE細(xì)胞中的EdU陽性細(xì)胞百分率分別為(94.46±4.27)%和(51.33±5.08)%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.654，P<0.01)。見圖1。

圖1 細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn)檢測EdU陽性細(xì)胞比例(×200)

2.2 細(xì)胞遷移能力比較 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組和壯觀霉素B1組子宮內(nèi)膜癌KLE細(xì)胞的遷移距離分別為(44.15±4.07)μm和(22.74±3.95)μm。兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.359，P<0.01)。見圖2。

圖2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力(×200)

2.3 細(xì)胞侵襲能力比較 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組和壯觀霉素B1組子宮內(nèi)膜癌KLE細(xì)胞從Transwell培養(yǎng)皿的上面小室向下面小室遷移的細(xì)胞數(shù)分別為(67.05±6.54)個(gè)和(36.44±4.05)個(gè)。兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.997，P<0.01)。見圖3。

圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力(×200)

2.4 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組和壯觀霉素B1組子宮內(nèi)膜癌KLE細(xì)胞表達(dá)的SUMO1、Ubc9、MMP-9和MMP-13蛋白相對(duì)水平分別為(3.59±0.77)vs(1.08±0.19)、(1.39±0.05)vs(0.21±0.09)、(0.87±0.10)vs(0.44±0.09)和(0.79±0.05)vs(0.19±0.05)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測蛋白相對(duì)表達(dá)水平

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是臨床上最常見的女性生殖系統(tǒng)腫瘤之一，其好發(fā)于圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后女性，是女性非正常死亡及不孕不育的重要原因[7]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，世界上每年有近20萬人的新發(fā)病例，由其導(dǎo)致的女性病死率僅次于卵巢癌和宮頸癌[8]。在我國，隨著飲食習(xí)慣的改善，以及自然環(huán)境和社會(huì)環(huán)境的急劇變化，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率亦呈逐年升高趨勢，是僅次于宮頸癌的婦科生殖系統(tǒng)腫瘤[6,8]。目前針對(duì)子宮內(nèi)膜癌的治療主要以手術(shù)清除為主，術(shù)后輔以放、化療，以及近些年興起的生物治療和基因靶向治療等綜合治療措施[9]。然而，由于人們始終缺乏對(duì)子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展的分子病理機(jī)制的深刻認(rèn)識(shí)，使得當(dāng)前治療手段多僅局限于對(duì)癥處理，基于分子生物學(xué)的靶向治療始終進(jìn)展緩慢。因此從更廣闊的視角和更深的層次認(rèn)識(shí)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制，并尋求更安全和高效的精準(zhǔn)靶向治療策略仍是當(dāng)前醫(yī)學(xué)界的關(guān)注熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

SUMO1是SUMO家族成員之一。與SUMO2/3最常介導(dǎo)細(xì)胞急性應(yīng)激反應(yīng)不同，SUMO1常參與細(xì)胞內(nèi)遲發(fā)反應(yīng)，介導(dǎo)包括腫瘤在內(nèi)的一系列慢性疾病的演變過程[10]。機(jī)制方面，SUMO1介導(dǎo)的SUMO化修飾循環(huán)通路需要E1活化酶、E2結(jié)合酶、E3連接酶及去SUMO化酶共同參與完成[11]。Hirohama等[12]報(bào)道在蛋白質(zhì)SUMO修飾反應(yīng)中唯一的E2結(jié)合酶Ubc9能夠被壯觀霉素B1抑制，從而抑制靶蛋白的SUMO修飾過程。因此壯觀霉素B1可作為一種理性的蛋白質(zhì)SUMO化修飾反應(yīng)抑制劑。

MMP家族是介導(dǎo)細(xì)胞周圍基質(zhì)降解，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的必經(jīng)過程。研究表明，部分類型細(xì)胞的遷移和侵襲離不開蛋白質(zhì)SUMO化修飾反應(yīng)。已知成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞遷移能力的增加和細(xì)胞外基質(zhì)的降解是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中軟骨破壞的關(guān)鍵因素[13]。Lao等[14]研究發(fā)現(xiàn)，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的成纖維樣滑膜細(xì)胞和滑膜組織中SUMO-1和SUMO-2的表達(dá)均升高。抑制SUMO-1可以減少成纖維樣滑膜細(xì)胞的遷移和侵襲以及MMP-1和MMP-3的表達(dá)。Li等[15]研究也證實(shí)，沉默Ubc9能夠抑制人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎-成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞分泌MMP-3和MMP-9，進(jìn)而抑制細(xì)胞遷移。Sun等[16]研究發(fā)現(xiàn)在動(dòng)物和植物組織中合成的α-硫辛酸能夠增加干擾素調(diào)節(jié)因子1的SUMO化修飾，從而減弱其轉(zhuǎn)錄活性，并通過抑制白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)的MMP-3和MMP-13表達(dá)和活性的增加。S100A4是S100蛋白質(zhì)家族的成員，它通過激活晚期糖基化終產(chǎn)物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，刺激MMP-13的產(chǎn)生，誘導(dǎo)Ⅱ型膠原降解酶降解周圍基質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞遷移。Miranda等[6]研究證明，SUMO1通過直接對(duì)S100A4進(jìn)行翻譯后修飾，抑制其核轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而阻止S100A4與MMP-13的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，抑制了白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)的MMP-13的產(chǎn)生。該研究證明了S100A4蛋白的SUMO化修飾是MMP-13基因表達(dá)調(diào)節(jié)的一種新機(jī)制。近期盛鳳等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在肝細(xì)胞癌中沉默Ubc9表達(dá)能夠通過抑制AKT1蛋白的SUMO化修飾抑制MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)，進(jìn)而限制肝細(xì)胞癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。

基于以上發(fā)現(xiàn)，我們想知道參與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的部分MMP家族成員(MMP-9和MMP-13)是否也經(jīng)歷SUMO化修飾反應(yīng)，以及能否通過干預(yù)MMP-9和MMP-13的蛋白質(zhì)SUMO化修飾過程抑制子宮內(nèi)膜癌的轉(zhuǎn)移和侵襲。本研究中，我們以人源性子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株KLE為研究對(duì)象，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的提示加入終濃度為20 μmol/L的壯觀霉素B1，觀察其對(duì)子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移和侵襲的影響。首先來自細(xì)胞核增殖活性檢測結(jié)果顯示，壯觀霉素B1能夠明顯抑制子宮內(nèi)膜癌KLE細(xì)胞的增殖。接下來我們檢測了壯觀霉素B1對(duì)子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移和侵襲的影響。來自細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，壯觀霉素B1能夠明顯抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲(P<0.01)。其中壯觀霉素B1組的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的遷移能力下降至對(duì)照組的51%，而其侵襲能力下降至對(duì)照組的54%。為了進(jìn)一步觀察上述作用是否與MMP-9和MMP-13蛋白的SUMO化修飾有關(guān)，我們接下來用western blot實(shí)驗(yàn)檢測了相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，壯觀霉素B1能夠明顯抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中Ubc9的蛋白表達(dá)，同時(shí)與SUMO1共價(jià)結(jié)合復(fù)合蛋白體數(shù)量也明顯下降，相應(yīng)地，MMP-9和MMP-13的蛋白表達(dá)量也出現(xiàn)了不同程度上的下降。這些結(jié)果表明，通過壯觀霉素B1的確能夠有效抑制蛋白質(zhì)的SUMO化修飾過程，降低與子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān)的MMP家族成員MMP-9和MMP-13的蛋白水平。雖然本研究現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍然不能明確蛋白質(zhì)SUMO化修飾反應(yīng)是通過何種途徑影響了MMP-9和MMP-13的蛋白表達(dá)，但不可否認(rèn)的是壯觀霉素B1直接或間接地降低了MMP-9和MMP-13的蛋白水平，抑制了子宮內(nèi)膜癌的轉(zhuǎn)移和侵襲。

綜上所述，本研究證實(shí)通過干預(yù)蛋白質(zhì)SUMO化修飾反應(yīng)能夠抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中參與周圍基質(zhì)降解的關(guān)鍵蛋白MMP家族成員的蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制子宮內(nèi)膜癌的轉(zhuǎn)移和侵襲。但是由于作為體內(nèi)SUMO化修飾反應(yīng)中唯一的E2結(jié)合酶，Ubc9除了參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以外，也同時(shí)參與機(jī)體內(nèi)眾多生理反應(yīng)過程，因此如何趨利避害地通過干預(yù)蛋白質(zhì)SUMO化修飾過程治療子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移是未來研究的關(guān)鍵所在。

利益相關(guān)聲明：整個(gè)研究期間作者或所在機(jī)構(gòu)和提供支持的實(shí)體之間的關(guān)系無任何利益相關(guān)沖突，為國家基金支持。

作者貢獻(xiàn)說明：袁夢嵐、李承堯、白潔、陳旭紅負(fù)責(zé)具體實(shí)驗(yàn)操作；李承堯、白潔負(fù)責(zé)收集整理圖片和數(shù)據(jù)；陳旭紅負(fù)責(zé)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；袁夢嵐負(fù)責(zé)撰寫論文；劉曉智負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)；李圃負(fù)責(zé)項(xiàng)目設(shè)計(jì)與全面組織實(shí)施。