何巍巍, 周會祥, 王文娟, 袁育珺, 羅彥妮, 黃龍, 段訓新, 黃會金, 胡修全, 代龍文, 徐肖丁, 王波蘭, 陳春輝, 歐陽盛武, 喻文0, 趙德剛, 花蕾, 李建根, 劉峰, 余曉慧, 李年德, 劉文仲, 高明祥, 諶秋華, 趙詠梅0, 冷文學, 何創(chuàng)華, 郭淼生, 胡志堅△

1九江學院附屬醫(yī)院檢驗科(江西九江 332001)； 2九江學院附屬口腔醫(yī)院(江西九江 332099)； 3九江市婦幼保健院檢驗科(江西九江 332001)； 4九江市中醫(yī)院檢驗科(江西九江 332099)； 5九江市濂溪區(qū)人民醫(yī)院檢驗科(江西九江 332020)； 6都昌縣人民醫(yī)院檢驗科(江西九江 332699)； 7都昌縣中醫(yī)院檢驗科(江西九江 332699)； 8九江市第三人民醫(yī)院檢驗科(江西九江 332099)； 9彭澤縣人民醫(yī)院檢驗科(江西九江 332701)； 10湖口縣人民醫(yī)院檢驗科(江西九江 332599)； 11廬山市人民醫(yī)院檢驗科(江西九江 332899)； 12九江經(jīng)濟開發(fā)區(qū)人民醫(yī)院檢驗科(江西九江 332099)； 13武寧縣人民醫(yī)院檢驗科(江西九江 332399)； 14九江市第五人民醫(yī)院檢驗科(江西九江 332004)； 15瑞昌市人民醫(yī)院檢驗科(江西九江 332299)； 16永修縣人民醫(yī)院檢驗科(江西九江 330399)； 17都昌縣婦幼保健院檢驗科(江西九江 332699)； 18德安縣人民醫(yī)院檢驗科(江西九江 330499)； 19廬山康復中心檢驗科(江西九江 332499)； 20共青城市人民醫(yī)院檢驗科(江西九江 332020)； 21修水縣第一人民醫(yī)院檢驗科(江西九江 332499)； 22共青城新市醫(yī)院檢驗科(江西九江 332020)； 23修水縣中醫(yī)院檢驗科(江西九江 332499)

目前在全球范圍肆虐的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)是由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)入侵人體引起的一種急性呼吸道傳染病[1-3]。目前COVID-19診斷的金標準仍然是聚合酶鏈反應(PCR)法檢測病毒核酸，但是由于核酸檢測結果受樣本采集手法、樣本保存條件、PCR 操作過程等因素影響[4]，SARS-CoV-2核酸檢測存在一定的假陰性[5-6]。國家衛(wèi)生健康委員會《新型冠狀病毒肺炎診療方案 (試行第七版)》確診病例增加了SARS-CoV-2特異性免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)和免疫球蛋白 G(immunoglobulin G，IgG)抗體檢測，作為臨床確診標準[7]。與核酸檢測手段相互補充，以彌補核酸檢測時出現(xiàn)的假陰性和假陽性[8]，提高疑似病例檢測的準確率。本研究的目的是對SARS-CoV-2特異性IgM和IgG抗體的檢測陽性結果情況進行分析，特別是針對陽性結果的真陽性、假陽性情況分析以及假陽性產(chǎn)生的原因分析，探討SARS-CoV-2特異性抗體檢測假陽性的可能因素。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性收集2020年3月至2021年1月期間九江地區(qū)23家二級及以上醫(yī)院SARS-CoV-2特異性抗體檢測結果和抗體假陽性血清標本，其中：膠體金法(gold immunochromatography assay，GICA)陰性147 021例，陽性134例；化學發(fā)光法(chemiluminescence immunoassay,CLIA)IgG抗體陰性25 218例，陽性50例；CLIA法IgM抗體陰性25 223例，陽性23例。本研究經(jīng)九江學院附屬醫(yī)院倫理委員會批準實施(批件號：jjuhmer-a-2020-01)。由于所納入試驗的檢測結果及血清樣本檢測均以匿名方式進行，九江學院附屬醫(yī)院倫理委員會批準了予以豁免患者知情同意的申請。

1.2 方法

1.2.1 SARS-CoV-2抗體檢測 所有研究對象均采集空腹靜脈血3 mL，置于含分離膠的黃頭真空采血管內，靜置待血液凝固，4 000×g離心10 min，取血清備用。GICA法測定試劑盒為廣州萬孚生物技術股份有限公司生產(chǎn)的抗新型冠狀病毒總抗體(不區(qū)分IgM和IgG抗體)膠體金試劑，采用膠體金免疫層析技術原理，應用捕獲法檢測人血清新型冠狀病毒抗體；CLIA法測定使用博奧塞斯 Axceed260化學發(fā)光測定儀和安圖A2000化學發(fā)光測定儀及配套SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體檢測試劑，兩種試劑的臨界值(Cut off 值)均為 S/CO ≥ 1 AU/mL。所有標本的采集、處理及檢測嚴格按照試劑說明書要求進行。

1.2.2 SARS-CoV-2核酸檢測 按《醫(yī)療機構新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊》(聯(lián)防聯(lián)控機制醫(yī)療發(fā)〔2020〕271 號)采集受試者口咽拭子或鼻咽拭子，使用達安基因新冠病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)，嚴格按儀器操作規(guī)程和試劑盒說明書進行檢測。

1.2.3 SARS-CoV-2抗體假陽性排查 對1.2.1方法檢測SARS-CoV-2抗體陽性結果，各實驗室首先進行復查，復查及陽性結果確定流程見圖1(GICA法檢測的陽性標本實驗室使用其他廠家GICA法試劑復查，復查陽性結果再經(jīng)CLIA法復查；CLIA法測得的陽性結果實驗室使用CLIA法、CLIA法雙重復查)。復查后陽性結果經(jīng)過受試者SARS-CoV-2流行病學史、臨床表現(xiàn)、SARS-CoV-2核酸檢測、病毒感染后抗體產(chǎn)生規(guī)律及疫苗接種等原因分析，由各醫(yī)院專家組結合《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》排除SARS-CoV-2病例的標本再次確定為假陽性結果。收集再次確定為假陽性結果標本(含分離膠的黃頭真空采血管內，靜置待血液完全凝固，4 000×g離心10 min取血清-70℃保存)，標本均無溶血，通過檢測類風濕因子(RF，BECKMAN IMMAGE 800特定蛋白分析儀及配套試劑)、嗜異性抗體(forssman antibody, F.antibody，羊紅細胞嗜異性凝集試驗)、補體(CH50，SRBC溶血法)、溶菌酶(lysozyme，比濁法)、甲胎蛋白(AFP，BECKMAN DXI800發(fā)光儀及配套試劑)、癌胚抗原(CEA，BECKMAN DXI800發(fā)光儀及配套試劑)分析假陽性原因，各項目檢測均按照檢驗操作規(guī)程進行，復檢流程見圖1。

圖1 SARS-CoV-2抗體檢測初檢陽性結果復查及陽性結果確認流程

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。計算各種檢測方法假陽性比例、造成假陽性各因素比例以及化學發(fā)光法復查陰性和原因不明標本各抗體結果的均數(shù)和標準差。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同檢測方法檢測所得SARS-CoV-2抗體陽性結果情況分析 GICA法檢測陽性結果中假陽性比例為0.03%(41/147 062)；CLIA法檢測IgG抗體、IgM抗體假陽性比例分別為0.08%(21/25 239)、0.06%(15/25 238),見表1。

表1 SARS-CoV-2抗體檢測陽性情況表 例

2.2 SARS-CoV-2抗體結果假陽性原因分析

2.2.1 SARS-CoV-2抗體假陽性標本復檢情況分析 實驗室按照圖1流程對篩檢假陽性標本進行復檢，結果見表2。 41例GICA法IgM/IgG復合抗體初檢陽性結果標本經(jīng)GICA復檢陰性11例、CLIA法定量復檢陰性9例，報告陽性標本21例，經(jīng)CLIA法定量復檢，其中單獨IgG陽性8例、單獨IgM陽性6例、IgG和IgM同時陽性7例；CLIA法IgG和IgM抗體復檢后再次確定IgG抗體、IgM抗體單獨假陽性標本分別為12例、8例，同時為假陽性標本5例。CLIA法IgG抗體和IgM抗體假陽性標本復檢陰性率(19.05%，13.33%)明顯低于GICA法檢復檢陰性率48.78%(2=5.174 6，P<0.05；2=5.785 3，P<0.05)。

表2 SARS-CoV-2抗體假陽性標本復查情況分析 例(%)

2.2.2 SARS-CoV-2抗體再次確定為假陽性標本內源性干擾因素檢測 經(jīng)2.2.1復檢結果最后經(jīng)專家組依據(jù)相關證據(jù)結合《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》確定為假陽性的標本共46例(IgG抗體、IgM抗體單獨假陽性標本分別為20例、14例，IgG和IgM抗體同時假陽性標本12例)，CLIA 法檢測32例IgG抗體假陽性結果濃度值為(12.12±8.95) AU/mL，26例IgM抗體假陽性結果濃度值為(15.61±9.78) AU/mL。

46例假陽性的標本進行RF、CH50、F.antibody、lysozyme、AFP、CEA檢測，檢出RF、CH50、F.antibody、lysozyme、AFP陽性標本分別為27例(58.70%)、7例(15.22%)、7例(15.22%)、3例(6.52%)、1例(2.17%)，其中AFP陽性的樣本同時檢出CH50陽性，另1例(2.17%)均未檢出，結果見表3。不同假陽性因素所致抗體檢測結果詳見表4，經(jīng)分析假陽性因素濃度高低與引起抗體檢測結果的變化差異無統(tǒng)計學意義。

表3 SARS-CoV-2抗體再次確定為假陽性標本內源性干擾因素檢測結果

表4 SARS-CoV-2抗體假陽性因素引起抗體檢測結果表

3 討論

當人體受到SARS-CoV-2感染時，機體免疫細胞受SARS-CoV-2抗原刺激后，被激活而合成、分泌產(chǎn)生特異性IgM、IgG抗體。其中IgM抗體為初次體液免疫應答中最先出現(xiàn)的抗體，一般在急性感染5 d左右產(chǎn)生，可作為機體急性感染早期指標；IgG 抗體為再次免疫應答產(chǎn)生的主要抗體，一般感染14 d左右產(chǎn)生，可作為診斷現(xiàn)癥感染和既往感染的指標。因此，IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測可以監(jiān)測患者整個疾病過程中的抗體表達水平。有研究表明：同時檢測SARS-CoV-2 IgM和IgG 抗體有助于提高檢測的陽性率[9-10]。

自從“新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)”中指出，“血清新型冠狀病毒特異性IgM抗體和IgG 抗體陽性；血清新型冠狀病毒特異性IgG抗體由陰性轉為陽性或恢復期較急性期4倍及以上升高”可以作為確診的血清學證據(jù)以來，作為SARS-CoV-2核酸檢測重要補充的特異性IgM和IgG抗體檢測，在臨床診斷中也被廣泛使用。然而，實踐過程中SARS-CoV-2特異性IgM和IgG抗體檢測與其他抗體檢測一樣存在干擾因素而導致假陽性結果，干擾的因素包括檢測試劑的抗干擾能力、外源性干擾和內源性干擾，為此“新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第八版修訂版)”[11]指出，由于試劑本身陽性判斷值原因、或者體內存在干擾物質(RF、F.antibody、CH50、lysozyme等)、或者標本原因(標本溶血、標本被細菌污染、標本貯存時間過長、標本凝固時間不全等)，抗體檢測可能會出現(xiàn)假陽性，一般不單獨以血清學檢測作為診斷依據(jù)，需要結合流行病學史、臨床表現(xiàn)和基礎疾病等情況進行綜合判斷。

本研究統(tǒng)計各實驗室初次SARS-CoV-2特異性抗體檢測結果：GICA法(IgG/IgM)復合抗體假陽性率為0.03%(41/147 062)，CLIA法IgG抗體假陽性率為0.08%(21/25 239)，CLIA法IgM抗體假陽性率為0.06%(15/25 238)，較肖秀美等[12]報告GICA 法IgG和IgM總抗體3種試劑檢測假陽性率分別為0.55%(3/548)、4.2%(23/548)和0.73%(4/548)均低，可能與本次是大樣本量分析有關。對初次檢測假陽性樣本，通過延長離心時間、選擇不同檢測方法進行復查，可排除GICA法IgG/IgM抗體48.78%的假陽性結果、CLIA法IgG抗體19.05%的假陽性結果、CLIA法IgM抗體13.3%的假陽性結果，表明GICA法較CLIA法檢測試劑的抗干擾能力和抗外源性干擾的能力較差，實驗室通過建立SARS-CoV-2特異性抗體檢測陽性結果復檢與審核規(guī)范，采用延長離心時間和使用不同檢測試劑、方法進行復查可較好排除外源性干擾和檢測試劑因素導致的假陽性結果，減少實驗室發(fā)出假陽性結果的數(shù)量，減輕臨床負擔。

內源性干擾是常規(guī)實驗室抗體檢測較難排除的因素，本研究對46例經(jīng)臨床診斷再次確定為SARS-CoV-2抗體假陽性的標本，檢出RF、CH50、F.antibody、lysozyme、AFP陽性標本分別為27例(58.70%)、7例(15.22%)、7例(15.22%)、3例(6.52%)，RF引起的假陽性肖秀美等[12]報告不同濃度RF致SARS-CoV-2抗體假陽性率分別為9.5%(8/84)～84.6%(11/13)接近，表明RF是SARS-CoV-2抗體檢測最主要的干擾因素，其次為CH50和F.antibody，再次為lysozyme，另有1例未檢出上述干擾物質，說明還有其他因素干擾SARS-CoV-2抗體檢測而出現(xiàn)假陽性。1例孕婦同時檢測出SARS-CoV-2 IgG和IgM抗體呈假陽性，血清AFP陽性，同時CH50升高，本研究中其他SARS-CoV-2抗體假陽性樣本均未檢測出AFP、CEA升高，提示該孕婦(妊娠38周)可能為免疫系統(tǒng)功能活躍，補體升高而導致SARS-CoV-2抗體檢測呈假陽性。在本研究中不同假陽性因素濃度高低與引起抗體檢測結果的變化沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學的差異，可能是不同假陽性因素的例數(shù)較少有關。

在SARS-CoV-2抗體檢測應用評價中，對可疑陽性結果進行間隔一定時間多次(2次以上)檢測，依據(jù)抗體產(chǎn)生規(guī)律分析動態(tài)檢測結果的變化來鑒別單次IgM和IgG抗體檢測陽性結果的真假，從而避免假陽性結果對臨床診斷的誤導[13-14]，同時還要關注不同種冠狀病毒N蛋白或S蛋白存在免疫交叉反應等因素干擾[15-17]。

綜上所述，SARS-CoV-2特異性IgM和IgG抗體檢測作為COVID-19核酸檢測的有益補充，為SARS-CoV-2感染患者的診斷和治療提供有力支持。但應采取適宜的復查和診療路徑以排除外源性干擾、檢測試劑的抗干擾能力和內源性干擾等因素所致的假陽性結果。

利益相關聲明：論文所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻說明：何巍巍論文撰寫；胡志堅對研究的思路及設計有關聯(lián)貢獻；周會祥、王文娟、袁育珺、羅彥妮、黃龍、段訓新、黃會金、胡修全、代龍文、徐肖丁、王波蘭、陳春輝、歐陽盛武、喻文、趙德剛、花蕾、李建根、劉峰、余曉慧、李年德、劉文仲、高明祥、諶秋華、趙詠梅、冷文學、何創(chuàng)華、郭淼生參與研究數(shù)據(jù)的獲取等過程。