胡家奇, 張又祥, 羅梅娟, 黃婉儀

廣州市第一人民醫(yī)院新生兒科(廣東廣州 510180)

N-硝基-左旋精氨酸甲酯(N-nitro-L-arginine methyl ester,L-NAME)是一種非特異性的一氧化氮合酶(NOS)抑制劑，可與左旋精氨酸競爭性結合NOS，抑制NOS的活性，減少一氧化氮(NO)的合成。常用于建立先天性肥厚性幽門狹窄等動物模型[1-3]，但不同研究采用的劑量存在非常大的差異，且對其毒不良反應研究少。本實驗結合前期的研究基礎和國內(nèi)外文獻報道于2015年7月至2017年3月進行了此項研究，本研究采取灌胃的方式為孕鼠給藥，通過統(tǒng)計孕鼠產(chǎn)仔率，新生鼠畸形率，新生鼠出生體重，研究L-NAME對圍生期仔鼠的毒性不良反應，為L-NAME建立動物模型尋找合適劑量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 40只性成熟wistar雌性大鼠，20只性成熟Wistar雄性大鼠，普通級，體重在250～300 g，均由南方醫(yī)科大學實驗動物研究開發(fā)中心提供。本次研究遵循國家有關實驗動物管理和使用的規(guī)定，經(jīng)實驗動物倫理委員會審查批準。L-NAME(N-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride，Sigma，編號 N5751，200 mg/瓶)。

1.2 方法

1.2.1 研究對象與分組 成熟Wistar大鼠，每天下午6:00按雌∶雄2∶1合籠，次日上午7:00分開雌雄鼠，取雌鼠陰道分泌物涂片鏡檢，將發(fā)現(xiàn)精子的時間定義為懷孕第1天。將鏡檢發(fā)現(xiàn)精子的雌鼠隨機分成對照組及L-NAME低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10只。所有大鼠在相同的濕度、溫度、光照、空間等條件下飼養(yǎng)。實驗研究對象為新生仔鼠。

1.2.2 動物模型的建立 在大鼠孕中期(懷孕第13天)至仔鼠出生第1天，通過灌胃的方式分別對不同組的孕鼠給予生理鹽水或L-NAME，低劑量組、中劑量組、高劑量組分別給予L-NAME 60、300、600 mg/(kg·d)；對照組孕鼠給予等量生理鹽水。記錄孕產(chǎn)仔量、新生鼠出生體重、畸形情況。

2 結果

2.1 圍生期母鼠情況 實驗中，一共有36只雌鼠成功懷孕，其中對照組10只、低劑量組8只、中劑量組9只、高劑量組9只。孕鼠在用藥期間未出現(xiàn)死亡、感染。各孕鼠的妊娠期為22～24 d。全部孕鼠都成功產(chǎn)仔。

2.2 各組孕鼠產(chǎn)仔量 實驗期間低劑量組有2只雌鼠將自產(chǎn)仔鼠咬死，故該組只有6只母鼠納入統(tǒng)計；中劑量組有1只雌鼠將自產(chǎn)仔鼠咬死，故該組只有8只母鼠納入統(tǒng)計。與對照組比較，低劑量組和中劑量組產(chǎn)仔數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而高劑量組產(chǎn)仔數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(Bonferroni法P=0.007，LSD-t法P=0.001)，見表1。

表1 各組孕鼠數(shù)量和平均產(chǎn)仔量

2.3 各組新生鼠外觀畸形情況 實驗中，觀察仔鼠四肢，只要肢體出現(xiàn)異常即定義為畸形。本組研究中只發(fā)現(xiàn)后肢缺如畸形，見圖1，未發(fā)現(xiàn)其他肢體畸形。低劑量組與中等劑量組間畸形率差異無統(tǒng)計學意義(P=0.383),高劑量組畸形率顯著高于低劑量組與中劑量組(P=0.000)，見表2。

表2 各組仔鼠畸形情況統(tǒng)計

注：A:左后肢缺如畸形；B：右后肢缺如畸形；C：雙后肢缺如畸形

2.4 各組新生鼠體重情況 低劑量組中因1只母鼠拒絕哺乳致該窩新生鼠餓死，故沒有將該窩新生鼠納入體重統(tǒng)計分析，只納入了5窩新生鼠。各組仔鼠出生體重差異無統(tǒng)計學意義(P=0.062)，見表3。

表3 各組仔鼠出生體重

3 討論

近年來的研究表明，由NOS催化左旋精氨酸產(chǎn)生的內(nèi)源性NO在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中可控制肌肉的舒張、腸蠕動，能調(diào)節(jié)血管舒張、控制血壓、抑制血小板以及白細胞的黏附和聚集。內(nèi)源性NO的合成可導致很多疾病的發(fā)生[4-7]。一氧化氮合酶抑制劑L-NAME可與左旋精氨酸競爭性結合NOS，抑制NOS 的活性，減少NO 的合成，從而建立動物模型[1-3,8-9]。

Diket等[2]通過在飲用水中添加 L-NAME[大約60/(kg·d)]方式在孕鼠妊娠第13～19天給藥時，新生鼠四肢畸形率為23%；Pierce等[3]在孕鼠妊娠第6～19天，通過在飲用水中添加 L-NAME的方式分別給予大約54、180 mg/(kg·d)藥物時，新生鼠四肢畸形率分別為5%、41%。Greenberg等[10]在孕鼠妊娠第13～20天，通過在飲用水中添加 L-NAME的方式給予大約160 mg/(kg·d)藥物時，新生鼠四肢畸形率為48%。Fantel等[11]在孕鼠妊娠第15～20天，通過在飲用水中添加L-NAME的方式給予大約52 mg/d藥物時，新生鼠四肢畸形率為50%；10～19 d進行腹腔注射500 mg/kg 時四肢畸形率100%。以上實驗中，因為孕鼠攝入量的較大差異的影響，各新生鼠攝入L-NAME的量存在較大偏差，且各研究團隊使用的劑量不同畸形率、產(chǎn)仔率存在差異。鑒于此，本實驗在前期的研究基礎和國內(nèi)外文獻報道采取灌胃的方式為孕鼠給藥；孕鼠給藥劑量根據(jù)前期實驗和文獻報道的最低劑量及最高劑量設置藥物梯度劑量，分別為低劑量60 mg/(kg·d)，中劑量300 mg/(kg·d),高劑量600 mg/(kg·d)。

關于L-NAME對胎產(chǎn)率的影響。國內(nèi)外研究表明，大劑量L-NAME會影響宮內(nèi)血供導致宮內(nèi)部分胚胎死亡導致產(chǎn)仔率下降[3，11]。本實驗中，在對各組孕鼠產(chǎn)仔量的分析中發(fā)現(xiàn)，正常組、低劑量組和中劑量組間產(chǎn)仔量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，高劑量組產(chǎn)仔量顯著低于正常組(P<0.05)。我們推測低劑量、中劑量L-NAME不會影響胎盤過度缺血，不會導致孕鼠產(chǎn)仔量降低，而高劑量L-NAME可能會影響宮內(nèi)血供導致宮內(nèi)部分胚胎死亡導致產(chǎn)仔率下降。結合國內(nèi)外研究及本研究結果，我們認為采用L-NAME建立動物疾病模型時，若需要保持動物正常產(chǎn)仔率的情況時可能應用中等及以下劑量時更合理。

各種研究表明L-NAME可導致新生鼠在宮內(nèi)發(fā)生肢端缺如畸形，但劑量不同所產(chǎn)生的畸形率亦不同，進一步研究發(fā)現(xiàn)，L-NAME可以抑制肢體末端血管舒張引起肢端供血不足，導致肢端發(fā)生壞死[1，3，11]。本實驗中，低劑量組和中劑量組之間發(fā)生的畸形率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而高劑量組畸形率顯著高于低劑量組與中劑量組(P<0.05)，這說明低劑量和中劑量L-NAME對宮內(nèi)仔鼠肢端供血的影響可能無差異，高劑量L-NAME可能導致更嚴重的肢端缺血。由此，在應用L-NAME建立動物肢端畸形模型時，雖然畸形率有升高但同時需考慮產(chǎn)仔率降低對實驗造成的影響。

本實驗中各組新生鼠出生體重差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，我們推測因為低劑量和中劑量L-NAME可以影響胎盤供血，但這種影響不足以導致仔鼠在宮內(nèi)體重增長降低，而高劑量組因為胚胎數(shù)的減少抵消了宮內(nèi)供血不足的影響進而使所有新生鼠出生體重差異無統(tǒng)計學意義。

綜上所述，應用L-NAME建立動物模型時應注意L-NAME劑量相關的毒副作用，L-NAME會引起新生鼠產(chǎn)生先天肢體畸形，但不影響出生體重。隨著L-NAME劑量的大量增加會導致孕鼠產(chǎn)仔率降低，新生鼠先天畸形率增加。應用L-NAME建立動物疾病模型時，若需要保持動物正常產(chǎn)仔率的情況時可能應用中等及以下劑量時更合理。而應用L-NAME建立動物肢端畸形模型時，若樣本量足夠大應用大劑量或許更合理。

利益相關聲明：論文所有作者共同認可論文無關利益沖突。

作者貢獻說明：研究設計為胡家奇與張又祥教授，研究方案執(zhí)行與實施為胡家奇，數(shù)據(jù)整理為羅梅娟與黃婉儀，統(tǒng)計分析及論文撰寫為胡家奇，論文審閱為張又祥教授。