劉桂萍，王 宇，李思宇，亢佳彤

(遼寧科技學(xué)院 生物醫(yī)藥與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 本溪 117004)

紫花苜蓿(Medicago sativa Linn)為豆科(Leguminosae)蝶形花亞科(Faboideae)，苜蓿屬(Medicago L.)多年生草本，世界上種植面積最大、種植時(shí)間最久的優(yōu)良豆科牧草，以其營(yíng)養(yǎng)豐富，消化率高，適應(yīng)性好得名“牧草之王”[1-2]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿營(yíng)養(yǎng)豐富，具有較高的利用價(jià)值，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)中均占有一定的地位，是迄今發(fā)現(xiàn)的營(yíng)養(yǎng)最全面的草本植物之一[3-4]。紫花苜蓿含有多種生物活性成分，包括黃酮、皂苷、葉蛋白、多糖等[5-6]，隨著研究的深入，其各種重要成分的提取方法也在不斷完善[7-9]。

本文研究的目的在于探索紫花苜蓿粗提物的抑菌性，為紫花苜蓿的開(kāi)發(fā)及綜合利用提供一定的借鑒。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路為：從紫花苜蓿的根莖葉中分別提取皂苷和黃酮類物質(zhì)的粗提物→設(shè)定不同濃度梯度的粗提液→對(duì)3種常見(jiàn)細(xì)菌展開(kāi)抑菌實(shí)驗(yàn)→分析抑菌性。

1 紫花苜蓿樣品處理與抑菌實(shí)驗(yàn)菌種的選擇

1.1 紫花苜蓿樣品處理

本實(shí)驗(yàn)所需樣品為紫花苜蓿完整植株，于2020年9月采摘于遼寧科技學(xué)院校園內(nèi)。紫花苜蓿采摘后進(jìn)行根、莖、葉分離，再分別稱量其重量得到濕重，然后放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中60 ℃烘干12 h，烘干后稱量并記錄各部位樣品的干重。然后再研磨粉碎，過(guò)2 mm大小的孔篩進(jìn)行過(guò)篩處理得到粉末，稱重后放入藥品瓶中用自封袋封好備用。

1.2 抑菌實(shí)驗(yàn)菌種的選擇

本實(shí)驗(yàn)選用三種常見(jiàn)細(xì)菌，即大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌作為抑菌實(shí)驗(yàn)菌種，所用菌種均由遼寧科技學(xué)院生物醫(yī)藥與化學(xué)工程院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

2 紫花苜蓿根莖葉中兩種成分的粗提取

2.1 紫花苜蓿根莖葉中黃酮類物質(zhì)的粗提取

分別準(zhǔn)確稱取紫花苜蓿根、莖、葉粉末各10 g，轉(zhuǎn)移至500 mL燒杯中，并加人55%乙醇450 mL，用保鮮膜封口靜置，在室溫下浸泡5 h[10]。

浸泡完成后，將燒杯轉(zhuǎn)移至超聲波粉碎機(jī)中，超聲處理20 min(如圖1所示)。

圖1 用超聲波粉碎機(jī)處理浸泡液

超聲結(jié)束后，將燒杯中的液體轉(zhuǎn)入帶有濾紙的漏斗中，用循環(huán)水真空泵將液體和粉末的混合物減壓抽濾得到紫花苜蓿不同部位黃酮類物質(zhì)的粗提液，再將粗提液轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，水溫設(shè)置30 ℃，減壓濃縮成干浸膏(如圖2和圖3所示)，最后稱取干浸膏的質(zhì)量。

圖2 用循環(huán)水真空泵對(duì)樣品進(jìn)行抽濾

圖3 用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)樣品進(jìn)行減壓濃縮

2.2 紫花苜蓿根莖葉中皂苷的粗提取

分別準(zhǔn)確稱取紫花苜蓿根、莖、葉粉末各5 g，用濾紙將粉末包裹嚴(yán)實(shí)，再用白線捆綁緊，然后把包裹著粉末的濾紙包放到索氏提取器的管道中，用試管架將索氏提取器固定在水浴鍋上方，再向底部的燒瓶中加入150 mL 70%乙醇溶液，把底部的燒瓶放到90 ℃的水浴鍋中進(jìn)行水浴加熱，提取液開(kāi)始回流，待回流3次后拿出索氏提取器，取出紫花苜蓿根部樣品的皂苷粗提液[11](如圖4所示)。

圖4 用索式提取器進(jìn)行樣品提取

將各項(xiàng)提取液分別減壓濃縮成干浸膏，再將其溶于蒸餾水中，過(guò)濾掉不溶物后加入相同體積的石油醚進(jìn)行萃取(如圖5所示)，由于石油醚是親脂性溶劑，親脂性雜質(zhì)會(huì)溶解在石油醚中，而皂苷在強(qiáng)親脂性溶劑中幾乎不溶解，仍處于水相中，由于水的密度大于石油醚的密度，所以打開(kāi)閥門，保留下層液體[12]。

圖5 萃取紫花苜蓿葉中皂苷成分

再用正丁醇進(jìn)行萃取，正丁醇的親水性較強(qiáng)，所以一些親水性強(qiáng)的雜質(zhì)便留在了水相中，而皂苷則轉(zhuǎn)溶于正丁醇中，由于正丁醇密度小于水的密度，所以放出下層液體，再將上層液體從分液漏斗的上部倒出。將倒出的提取液減壓濃縮溶液成干浸膏，即獲得紫花苜蓿各部位的皂苷粗品。

3 紫花苜蓿根莖葉中兩種成分的抑菌效果

3.1 紫花苜蓿根莖葉中兩種成分提取物的稀釋及無(wú)菌化處理

黃酮類物質(zhì)的種類繁多，有水溶性和脂溶性兩種，本實(shí)驗(yàn)先用無(wú)菌水進(jìn)行黃酮類物質(zhì)的溶解，通過(guò)攪拌，發(fā)現(xiàn)黃酮類物質(zhì)的粗提物可以溶解于水中。同樣，皂苷也是水溶性物質(zhì)。在無(wú)菌室的超凈工作臺(tái)上將兩種物質(zhì)用無(wú)菌水進(jìn)行溶解，由于濾菌膜過(guò)濾的濃度有限，所以一點(diǎn)點(diǎn)稀釋成濾菌膜所能承受的最大濃度。然后再用二倍梯度稀釋法稀釋粗提液，將紫花苜蓿根莖葉各部分不同成分提取物稀釋成5個(gè)不同的濃度梯度(如表1所示)，再用一次性注射器取稀釋好的粗提液，取下針頭，通過(guò)濾菌膜上部將提取液打入小試劑瓶中，再用瓶塞蓋好。注意操作前要將手用75%的乙醇消毒，并嚴(yán)格按照無(wú)菌操作進(jìn)行，以防粗提液染菌影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表1 紫花苜蓿根莖葉各部分不同成分提取物

續(xù)表1

3.2 抑菌圈直接的判定標(biāo)準(zhǔn)

本實(shí)驗(yàn)采用濾紙片法測(cè)定各成分不同濃度粗提液的抑菌效果，具體操作流程為：制備培養(yǎng)基，涂布菌懸液→放置對(duì)照組及含各成分不同濃度粗提液的濾紙片于上一步的培養(yǎng)皿中→恒溫培養(yǎng)→測(cè)量抑菌圈直徑并做好數(shù)據(jù)記錄。

規(guī)定抑菌直徑≥20 mm為高等靈敏度；抑菌圈直徑15 mm到20 mm為中等靈敏度；抑菌圈直徑11 mm到15 mm為低等靈敏度；抑菌圈≤11 mm為耐藥[12]。

3.3 紫花苜蓿根莖葉粗提物對(duì)三種細(xì)菌抑菌效果

3.3.1 紫花苜蓿根莖葉黃酮類粗提物的抑菌效果

紫花苜蓿根莖葉三個(gè)不同部位所提取的黃酮類物質(zhì)對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)抑制效果如表2所示。

表2 黃酮類物質(zhì)對(duì)大腸桿菌的抑菌效果

紫花苜蓿根莖葉三個(gè)不同部位所提取的黃酮類物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)抑制效果如表3所示。

表3 黃酮類物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果

紫花苜蓿根莖葉三個(gè)不同部位所提取的黃酮類物質(zhì)對(duì)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)抑制效果如表4所示。

表4 黃酮類物質(zhì)對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌效果

3.3.2 紫花苜蓿根莖葉皂苷粗提物的抑菌效果

紫花苜蓿根莖葉三個(gè)不同部位所提取的皂苷對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)抑制效果如表5所示。

表5 皂苷對(duì)大腸桿菌的抑菌效果

續(xù)表5

紫花苜蓿根莖葉三個(gè)不同部位所提取的皂苷對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)抑制效果如表6所示。

表6 皂苷對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果

紫花苜蓿根莖葉三個(gè)不同部位所提取的皂苷對(duì)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)抑制效果如表7所示。

表7 皂苷對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌效果

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紫花苜蓿根莖葉中黃酮類物質(zhì)和皂苷兩種不同成分的粗提物對(duì)三種細(xì)菌的抑菌效果并不十分明顯，其中紫花苜蓿莖中的黃酮類物質(zhì)對(duì)大腸桿菌的抑菌效果優(yōu)于根和葉的抑菌效果；紫花苜蓿根中的黃酮類物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果優(yōu)于莖和葉的抑菌效果；紫花苜蓿莖中的黃酮類物質(zhì)對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌效果優(yōu)于根和葉的抑菌效果；紫花苜蓿根中的皂苷對(duì)大腸桿菌的抑菌效果優(yōu)于葉和莖的抑菌效果；紫花苜蓿葉中的皂苷對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果優(yōu)于根和莖的抑菌效果；紫花苜蓿根中的皂苷對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌效果優(yōu)于莖和葉的抑菌效果?？偨Y(jié)得到最終結(jié)論：紫花苜蓿中的黃酮類物質(zhì)抑菌效果為：莖﹥根﹥?nèi)~；紫花苜蓿中的皂苷物質(zhì)抑菌效果為：根﹥?nèi)~﹥莖。