張晶云，趙園園，劉德水，程玉淵，周 駿，馮雨晴，吳 疆，史宏志*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院/煙草農(nóng)業(yè)減害研究中心，河南 鄭州 450002；2.上海煙草集團(tuán)有限公司 技術(shù)中心 北京工作站，北京 101121；3.河南省煙草公司 南陽(yáng)市公司，河南 南陽(yáng) 473000）

硝酸鹽和生物堿是煙草特有強(qiáng)致癌物質(zhì)亞硝胺(TSNAs)的前體物，煙草特有亞硝胺主要包括4種：N′-亞硝基去甲基煙堿(NNN)、4-(N-甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亞硝基假木賊堿(NAB)和N-亞硝基新煙草堿(NAT)［1］。一般認(rèn)為，TSNAs在進(jìn)入調(diào)制前的鮮煙葉中是不存在的［2］，其形成和積累主要發(fā)生在調(diào)制和貯藏過(guò)程中。Burton等［3-4］對(duì)白肋煙研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，TSNAs的大量積累發(fā)生在煙葉變黃末期，在煙葉進(jìn)入調(diào)制過(guò)程后，隨著煙葉水分的散失、細(xì)胞膜透性的增加、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的外流，微生物迅速繁殖，酶活性增強(qiáng)，煙葉中的硝酸鹽被還原生成亞硝酸鹽，進(jìn)一步與生物堿反應(yīng)生成TSNAs［5-6］，這是白肋煙調(diào)制過(guò)程中TSNAs形成的主要原因。調(diào)制結(jié)束后的貯藏階段亦是TSNAs形成的重要時(shí)期，經(jīng)過(guò)貯藏階段的白肋煙煙葉，其TSNAs含量與調(diào)制結(jié)束時(shí)相比可增加50%以上［7-8］。眾多研究表明［9-10］，在煙葉貯藏過(guò)程中，高硝酸鹽含量、高溫條件與TSNAs的形成密切相關(guān)，其中，在高溫條件下，硝酸鹽產(chǎn)生了大量的氣態(tài)氮氧化物，進(jìn)而與生物堿發(fā)生亞硝化反應(yīng)生成TSNAs，硝酸鹽含量高的主脈更有利于TSNAs的形成。

煙梗是煙葉的有機(jī)組成部分，也是卷煙生產(chǎn)中不可或缺的原料之一，烤煙的含梗率為25% ～35%，由于其具有填充值高、焦油釋放量低的優(yōu)點(diǎn)，在降低卷煙焦油含量和原料成本方面具有獨(dú)特的作用［11］。煙葉葉片和主脈在化學(xué)成分上存在很大差異，白肋煙葉片中的生物堿和蛋白質(zhì)含量高于主脈，而鉀、氯含量則低于主脈［12］；烤煙葉片中的NH4-N、NO2-N、總氮和可溶性蛋白含量顯著高于主脈，而主脈中的NO3-N和TSNAs含量顯著高于葉片［13-14］。李亞飛等［15-17］比較不同類型煙葉的化學(xué)成分差異后得出，白肋煙煙葉總氮、硝酸鹽含量明顯較烤煙高，而糖類物質(zhì)低于烤煙，這種差異在苗期已存在，調(diào)制后的白肋煙煙葉硝酸鹽含量較烤煙高幾十甚至上百倍。不同調(diào)制方式的調(diào)制環(huán)境和時(shí)間，其微生物活性和氣態(tài)氮氧化物的產(chǎn)生都存在顯著差異，進(jìn)而對(duì)TSNAs的形成產(chǎn)生了不同的影響。李宗平等［18］研究表明，晾制煙葉中的特有亞硝胺含量最高，其次是曬制的，烤制的最低。鄭昕等［19］對(duì)曬煙品種萬(wàn)毛9號(hào)的試驗(yàn)表明，晾制條件下的TSNAs含量高于曬制的。

目前，有關(guān)烤煙在烘烤過(guò)程中TSNAs的相關(guān)研究多集中在如何降低TSNAs含量方面，如宮長(zhǎng)榮等［20］研究發(fā)現(xiàn)，在烤煙調(diào)制初期和變黃過(guò)程中使用頻率為2450 MHz的微波處理能降低TSNAs的含量。潘建斌等［21］通過(guò)改變烘烤過(guò)程中變黃溫度和變黃時(shí)間以降低TSNAs含量。而有關(guān)烤煙在不同調(diào)制方式下TSNAs含量的差異以及葉片和主脈不同階段TSNAs含量變化方面的研究較少，烤煙主脈和葉片TSNAs的形成機(jī)理尚不清楚。為此，本試驗(yàn)采用烤煙品種云煙87為材料，設(shè)置正常烘烤、晾制和先烤后晾3種調(diào)制方式，探討了烤煙在不同調(diào)制環(huán)境中不同階段的煙葉葉片和主脈TSNAs及其前體物含量的變化特點(diǎn)，以明確不同調(diào)制方式對(duì)烤煙TSNAs形成和積累的影響，初步探究了烤煙烘烤過(guò)程中TSNAs的形成機(jī)理，為今后降低烤煙TSNAs含量提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)時(shí)間為2019和2020年，試驗(yàn)地點(diǎn)設(shè)在河南省南陽(yáng)市方城縣清河鎮(zhèn)金葉園，供試材料為當(dāng)?shù)刂髟钥緹熎贩N云煙87的上部6片葉。施肥方式為當(dāng)?shù)亓?xí)慣施肥，施氮量為45 kg/hm2，供試肥料包括煙草專用復(fù)合肥(N-P-K=10-10-20)、硝酸鉀、硫酸鉀、液態(tài)鉀肥、芝麻餅肥、沼渣有機(jī)肥。田間管理按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)不同調(diào)制方式設(shè)置3個(gè)處理：正常烘烤、晾制、先烤后晾。正常烘烤：在當(dāng)?shù)貙Ｓ每痉績(jī)?nèi)進(jìn)行，其中，變黃階段的干、濕球溫度分別控制在35～42 ℃、33～37 ℃之間，時(shí)間48～72 h；干葉階段的干、濕球溫度分別控制在45～54 ℃、37～39 ℃之間，時(shí)間36～48 h；干筋階段的干、濕球溫度分別控制在55～68 ℃、40～43 ℃之間，時(shí)間24～36 h；烘烤時(shí)間合計(jì)120～144 h。晾制：在自然條件下的晾架內(nèi)進(jìn)行，晾制時(shí)間保持在25～35 d之間，其中凋萎期的空氣相對(duì)濕度保持在70%～80%之間，持續(xù)3～4 d；變黃期的空氣相對(duì)濕度保持在70%～75%之間，持續(xù)10～15 d；干葉期的空氣相對(duì)濕度保持在60%～65%之間，持續(xù)6～7 d；干筋期的空氣相對(duì)濕度保持在60%以下，持續(xù)6～7 d。先烤后晾：首先進(jìn)行正常烘烤，烤至干葉期后進(jìn)行晾制，時(shí)間大約為11 d，具體工藝流程和技術(shù)操作分別按烤煙烘烤技術(shù)規(guī)程［22］和雪茄茄芯晾制技術(shù)規(guī)程［23］進(jìn)行。各處理分別于調(diào)制前、變黃末、干葉后、干筋后取樣，殺青或烘干后粉碎，磨樣，過(guò)0.25 mm篩子，待測(cè)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 硝酸鹽含量的測(cè)定煙葉和主脈的NO3-N含量采用濃H2SO4-水楊酸法測(cè)定［24］。

1.3.2 生物堿含量的測(cè)定準(zhǔn)確稱取200 mg煙末置于15 mL試管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液100 μL、10% NaOH溶液1.5 mL、甲基叔丁基醚(MTBE)3 mL，旋緊旋蓋，充分振蕩5 min后，室溫放置過(guò)夜(24±2) h，取上層清液進(jìn)行氣相色譜法(GC)分析。每個(gè)樣品應(yīng)平行測(cè)定2次。原理：在堿性條件下，利用甲基叔丁基醚等有機(jī)溶劑提取煙草或煙草制品中的生物堿類物質(zhì)，通過(guò)氣相色譜—?dú)浠鹧骐x子化檢測(cè)器(GC-FID)定量分析4種生物堿的含量。

1.3.3 TSNAs含量的測(cè)定樣品均由上海煙草集團(tuán)北京卷煙廠測(cè)定，測(cè)定方法：在線SPE-液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(SPE-LC-MS/MS)法［SPE-LC：Spark Holland, Symbiosis (Pico)；MS/MS：AB Sciex triple quad 5500］。稱取1.0 g煙樣，將其放入50 mL錐形瓶中，加入40 μL 4種氘代TSNAs(內(nèi)標(biāo))溶液(5000 ng/mL)和30 mL 100 mmol/L乙酸銨水溶液，在室溫下用振蕩器(200 r/min)萃取60 min，萃取液過(guò)0.45 μm水相濾膜后，采用LC-MS/MS法測(cè)定煙葉的NNN、NNK、NAT和NAB含量，其含量之和為TSNAs總量。2020年樣品NAB的含量極低，均未被檢測(cè)到。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019軟件制表繪圖，采用DPS 7.05軟件進(jìn)行方差分析，顯著性檢驗(yàn)用F檢驗(yàn)法，多重比較采用LSD法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同調(diào)制方式對(duì)TSNAs形成和積累的影響

2.1.1 正常烘烤條件下TSNAs的形成和積累動(dòng)態(tài)變化由圖1可知，2019年在正常烘烤條件下，葉片中各TSNAs及其總量隨著烘烤進(jìn)程的推進(jìn)而呈逐漸增加的趨勢(shì)，且各個(gè)時(shí)期間均存在顯著差異，在干筋階段TSNAs含量增加最多，增加量為78.13 ng/g；主脈中TSNAs含量低于葉片，在烘烤過(guò)程中TSNAs含量逐漸增加，變黃期、干葉期和干筋期分別增加了34.08、35.70和41.21 ng/g。

圖1 烤煙正常烘烤條件下TSNAs的形成和積累動(dòng)態(tài)變化

2020年烤煙正常烘烤過(guò)程中葉片NNN、NAT、NNK、TSNAs總量不斷增加，且以干筋階段增加較多，為73.90 ng/g；主脈中各TSNAs的含量也隨著烘烤進(jìn)程的推進(jìn)而呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢(shì)，但其含量整體低于葉片，TSNAs總量在干筋階段的增加量最大，為46.88 ng/g。

2.1.2 烤煙晾制條件下TSNAs的形成和積累動(dòng)態(tài)變化由圖2可知，2019年在晾制條件下，各階段的葉片TSNAs含量均隨著晾制過(guò)程的推進(jìn)而逐漸增加，且以變黃期增加較多，TSNAs總量增加了38.10 ng/g；干筋后的葉片TSNAs含量低于2019年正常烘烤干筋后的含量；晾制前鮮煙葉中主脈TSNAs含量低于葉片，但隨著晾制過(guò)程的推進(jìn)，主脈TSNAs含量逐步增加，在變黃階段即表現(xiàn)出高于葉片的趨勢(shì)，變黃期TSNAs總量增加了186.11 ng/g，增加量是葉片的4.88倍，干筋后TSNAs總量是葉片的2.41倍。

圖2 烤煙晾制條件下TSNAs的形成和積累動(dòng)態(tài)變化

2020年在晾制條件下，各階段的葉片TSNAs含量均隨著晾制過(guò)程的推進(jìn)而持續(xù)增加，在煙葉變黃階段增加量較多，TSNAs總量增加了45.16 ng/g，干筋后葉片TSNAs總量相較于2020年正常烘烤干筋后的少了82.09 ng/g；主脈TSNAs含量自進(jìn)入晾制條件后逐步增加，且在變黃期及變黃之后顯著高于葉片，大幅度增加主要發(fā)生在變黃階段，TSNAs總量的增加量是同時(shí)期葉片的3.83倍，而在變黃期之后增加量急劇下降。

2.1.3 烤煙先烤后晾條件下TSNAs的形成和積累動(dòng)態(tài)變化由圖3可知，2019年葉片中各TSNAs含量及其總量總體上隨著調(diào)制過(guò)程的推進(jìn)而逐漸增加，且在烘烤變黃階段的增加量較高，為56.44 ng/g，煙葉自干葉進(jìn)入晾制條件后，葉片的NNN、NAT、TSNAs總量增加不顯著，干筋后葉片TSNAs總量相比于正常烘烤干筋后的少了82.33 ng/g。主脈中TSNAs含量略低于葉片，但主脈TSNAs含量隨著調(diào)制過(guò)程的推進(jìn)也呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，尤其以變黃階段的增加量最高，為47.08 ng/g，與葉片TSNAs總量在干筋期增加不顯著表現(xiàn)不一致的是，主脈在進(jìn)入晾制條件后的干筋階段仍在增加，但其增加量比變黃階段的少。

圖3 烤煙先烤后晾條件下TSNAs的形成和積累動(dòng)態(tài)變化

2020年葉片中各TSNAs含量及其總量在烘烤條件下隨著烘烤過(guò)程的推進(jìn)而逐漸增加，大量增加的情況發(fā)生在變黃期，其中TSNAs總量增加了60.12 ng/g，而進(jìn)入晾制條件后NNK和TSNAs總量增加不顯著，主脈中TSNAs含量的變化規(guī)律與葉片的表現(xiàn)基本一致，在變黃期TSNAs總量增加較多，為60.67 ng/g，各階段主脈TSNAs含量略低于葉片。先烤后晾調(diào)制結(jié)束后煙葉葉片和主脈的TSNAs總量均低于正常烘烤干筋后葉片和主脈的TSNAs總量。

2.2 調(diào)制方式對(duì)不同調(diào)制階段TSNAs積累比例的影響

2.2.1 不同調(diào)制方式下葉片TSNAs的積累比例由表1可知，在正常烘烤條件下，葉片TSNAs含量在變黃期、干葉期和干筋期3個(gè)階段的增加量逐漸升高，TSNAs總量在干筋期的增加量最高，而增加幅度則在變黃期最高。在晾制條件下，葉片中TSNAs總量的增加量及幅度均隨著晾制過(guò)程的推進(jìn)而呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，TSNAs總量在變黃期的增加量及幅度最高，干筋階段則最小。在先烤后晾條件下，葉片中TSNAs總量在變黃期的增加量及幅度最高，而在干葉期則呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，烘烤結(jié)束進(jìn)入晾制階段后TSNAs總量幾乎不增加，NNN、NAB、NNK在干筋期甚至有下降的趨勢(shì)。

表1 不同調(diào)制方式下葉片TSNAs的積累比例

2.2.2 不同調(diào)制方式下主脈TSNAs的積累比例由表2可知，在正常烘烤條件下，主脈中TSNAs增加量在正常烘烤條件下3個(gè)階段均呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，TSNAs總量在干筋階段增加最多，而增加幅度則呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。在晾制條件下，主脈TSNAs增加量及幅度逐漸降低，在變黃期的增加量及幅度分別是正常烘烤的5.54、5.47倍，且遠(yuǎn)高于同階段葉片的增加量及幅度。在先烤后晾條件下，主脈中TSNAs在變黃期增加量及幅度較高，在烘烤結(jié)束進(jìn)入晾制階段的干筋期則較低。

表2 不同調(diào)制方式下主脈TSNAs的積累比例

2.3 烤煙葉片和煙梗煙草特有亞硝胺前體物的差異性分析

烤煙葉片和主脈在進(jìn)入調(diào)制前的殺青樣中TSNAs的前體物（生物堿和硝酸鹽）含量如表3所示，2019年煙葉葉片中生物堿含量顯著高于主脈，生物堿總量是主脈的3.38倍；主脈硝酸鹽含量顯著高于葉片，是葉片的3.84倍。2020年煙葉葉片和主脈的生物堿和硝酸鹽含量差異與2019年表現(xiàn)一致，即葉片生物堿含量顯著高于主脈，總生物堿含量是主脈的3.51倍；主脈中硝酸鹽含量顯著高于葉片，是葉片的3.24倍。

表3 烤煙調(diào)制前葉片和煙梗中特有亞硝胺前體物含量的比較

3 討論

TSNAs是煙草生物堿與亞硝酸發(fā)生亞硝化反應(yīng)生成并存在于煙葉和煙氣中的有害成分，在鮮煙葉中幾乎不存在，主要形成于調(diào)制和貯藏過(guò)程中。在白肋煙調(diào)制過(guò)程中，TSNAs的形成主要是由于常溫條件有利于微生物活動(dòng)，促使硝酸鹽在硝酸鹽還原酶作用下還原成亞硝酸鹽，進(jìn)而與生物堿發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生TSNAs，有研究認(rèn)為［25］，明火調(diào)制過(guò)程中產(chǎn)生的氣態(tài)氮氧化物與烤煙TSNAs的形成密切相關(guān)。本研究表明，在正常烘烤條件下，烤煙前期TSNAs的增加量少，主要是由于烘烤過(guò)程短，煙葉失水快，高溫下大部分微生物活性較低［26］，不利于硝酸鹽在微生物作用下被硝酸還原酶還原生成亞硝酸，而生物堿對(duì)TSNAs形成的貢獻(xiàn)相對(duì)較大，由于葉片生物堿含量高于主脈，因而葉片的TSNAs含量高于主脈。葉片和主脈的TSNAs含量均在干筋期增加較多，這是由于硝酸鹽具有化學(xué)不穩(wěn)定性，葉片和主脈中的硝酸鹽在干筋期的高溫條件下產(chǎn)生了大量的氣態(tài)氮氧化物，進(jìn)而促進(jìn)了TSNAs的形成，由于主脈中硝酸鹽含量顯著高于葉片，導(dǎo)致干筋期主脈TSNAs含量的增加幅度更高。在晾制條件下，葉片和主脈TSNAs在變黃期增加量及幅度較高，這與溫度和變黃時(shí)間有關(guān)，相比于正常烘烤，晾制時(shí)的溫度低和變黃時(shí)間長(zhǎng)，有利于微生物活動(dòng)，促進(jìn)了硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，進(jìn)一步與生物堿反應(yīng)生成TSNAs，這與潘建斌等［21］的研究結(jié)果一致。烤煙在晾制條件下，溫度低，失水慢，微生物活性較強(qiáng)，TSNAs含量明顯升高，加之主脈硝酸鹽含量顯著高于葉片，造成主脈的TSNAs在變黃期大量積累；干葉期和干筋期微生物活性逐漸減弱，煙葉水分逐漸散失，且在晾制條件下，溫度相對(duì)較低，不利于硝酸鹽產(chǎn)生氮氧化物，因此調(diào)制后期TSNAs生成較少?？緹熛瓤竞罅罈l件下，調(diào)制結(jié)束后的葉片和主脈TSNAs總量均低于正常烘烤，主要是由于進(jìn)入晾制條件后的干筋階段，葉片和主脈TSNAs總量的增加量及幅度均顯著低于正常烘烤，前期正常烘烤溫度高，微生物活性弱，不利于TSNAs總量的生成，干葉后進(jìn)入晾制條件煙葉水分大量減少，且溫度較低，不利于硝態(tài)氮產(chǎn)生氮氧化物，因而在變黃期和干筋期TSNAs的形成均較少。

TSNAs的形成始于調(diào)制階段，因此選用適當(dāng)?shù)恼{(diào)制方式，控制調(diào)制過(guò)程中的反應(yīng)條件對(duì)降低烤煙TSNAs含量是非常重要的。改變傳統(tǒng)的明火調(diào)制方式，采用熱交換式烤房，能減少氮氧化物與煙葉生物堿的反應(yīng)，這是降低烤煙TSNAs含量的有效方式［27］。除了調(diào)制設(shè)備外，調(diào)制過(guò)程中的溫度、濕度、微生物等都會(huì)影響TSNAs的生成，烤煙烘烤過(guò)程中處于較高的溫度條件下，微生物活性弱，主要是高溫條件致使硝酸鹽產(chǎn)生的大量氣態(tài)氮氧化物與生物堿反應(yīng)形成TSNAs，因此干筋期是烤煙TSNAs形成和積累的關(guān)鍵時(shí)期，通過(guò)控制烘烤后期環(huán)境、農(nóng)業(yè)和生物措施來(lái)降低煙葉和煙梗硝酸鹽含量是降低烤煙TSNAs含量的有效途徑之一。

4 結(jié)論

烤煙在正常烘烤時(shí)，葉片的TSNAs含量高于主脈，在干筋期的增加量較大，這可能與高溫低濕條件下硝態(tài)氮生成氣態(tài)氮氧化物有關(guān)；在晾制條件下，整體上主脈的TSNAs含量顯著高于葉片，變黃期TSNAs的形成和積累顯著高于烤制煙葉，干筋期則低于烤制煙葉；在先烤后晾條件下，葉片的TSNAs含量高于主脈，變黃期的TSNAs含量低于晾制煙葉，干筋期的TSNAs含量低于正常烘烤煙葉。因此，干筋期是降低烤煙TSNAs形成的關(guān)鍵時(shí)期。