王潤(rùn)超, 陳佳瑞， 王國(guó)梁

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 水土保持研究所, 陜西 楊凌712100; 2.中國(guó)科學(xué)院 水利部 水土保持研究所, 陜西 楊凌712100)

近些年隨著現(xiàn)代技術(shù)手段的發(fā)展與相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，對(duì)森林根系活動(dòng)和根際微區(qū)域的認(rèn)識(shí)不斷深入，根際研究得到了進(jìn)步和發(fā)展。眾所周知，根際在化學(xué)、物理和生物學(xué)上都是復(fù)雜的[1]，植物可以通過根系主動(dòng)或被動(dòng)地向周圍土壤釋放一系列化合物，即根系分泌物，根系分泌物由低分子量 (糖、有機(jī)酸和氨基酸)和高分子(蛋白質(zhì)、黏液等)等有機(jī)物質(zhì)組成[2]，它們主動(dòng)或被動(dòng)地從根細(xì)胞中向周圍土壤釋放，這些滲出物中低分子化合物對(duì)微生物至關(guān)重要[3]，因?yàn)樗鼈儾恍枰铣砂饷妇湍鼙晃?，所以這些化合物是土壤異養(yǎng)生物的有效碳源[4]，而且根系分泌物對(duì)土壤微生物區(qū)系組成和活性影響的研究由于根系分泌物中含有復(fù)雜的有機(jī)化合物混合物而變得復(fù)雜[5]。因此森林根系分泌物對(duì)所在根際微區(qū)域內(nèi)的根系-土壤-微生物的影響成為了全球生態(tài)系統(tǒng)碳氮循環(huán)研究過程中一個(gè)重要環(huán)節(jié)[6]，亟待我們研究其中的機(jī)理[7]。

目前，在根系分泌物對(duì)森林生態(tài)系統(tǒng)的激發(fā)效應(yīng)和碳氮循環(huán)方面已有研究，但根系分泌物中單個(gè)組分在多大程度上影響驅(qū)動(dòng)土壤物質(zhì)循環(huán)和微生物群落變化的生物和非生物過程目前仍不清楚[8]。此外，有關(guān)森林根系分泌物研究大都僅關(guān)注了根系碳源輸入，而忽略了根系分泌物中碳源濃度梯度變化對(duì)森林生態(tài)系統(tǒng)土壤養(yǎng)分循環(huán)的影響，這種忽略將極大地限制對(duì)森林根系-土壤-微生物互作機(jī)制的深入認(rèn)識(shí)[9]。因此開展根系分泌物碳源濃度梯度變化對(duì)森林土壤微生物及酶化學(xué)計(jì)量特征的影響成為一個(gè)十分重要但又極度缺乏的研究課題，尤其在不同森林生態(tài)系統(tǒng)中。

黃土高原地處黃河中游，位于我國(guó)由東南濕潤(rùn)、半濕潤(rùn)氣候向干旱、半干旱氣候過渡的中間地帶，該地區(qū)面臨退化生態(tài)系統(tǒng)植被恢復(fù)的問題[10]。加速黃土高原地區(qū)森林生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)與重建，對(duì)改善西北地區(qū)生態(tài)環(huán)境具有極其重要的意義。因此本研究以黃土高原不同森林生態(tài)系統(tǒng)土壤為研究對(duì)象，通過人工添加不同濃度的葡萄糖于山楊、油松和遼東櫟土壤中，研究不同森林生態(tài)系統(tǒng)中酶化學(xué)計(jì)量對(duì)根系分泌物中糖類的響應(yīng)機(jī)制，為更加科學(xué)闡明土壤碳輸入增加對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的影響提供理論支持。

1 研究區(qū)域與研究方法

1.1 研究區(qū)概況

實(shí)驗(yàn)樣地位于陜西省宜川縣鐵龍灣村，屬于黃土丘陵區(qū)。該地屬于暖溫帶半濕潤(rùn)易旱氣候區(qū)[11]，全年氣候變化受制于季風(fēng)環(huán)流，夏季炎熱多雨，降水量312.3 mm，7月最高氣溫29.7℃，1月最低氣溫-6.4℃。山楊林和遼東櫟林為當(dāng)?shù)卦甲匀恢脖?，油松林為人工林?963年植造。土壤主要以灰褐色森林土為主。

1.2 研究方法

1.2.1 土壤采樣 每種林地中設(shè)置5塊立地條件相同的樣方，大小為20 m×10 m，相同植物樣地內(nèi)樣方至少相距20 m。在每個(gè)樣方內(nèi)使用土鉆“S”型隨機(jī)取10～15個(gè)位點(diǎn)的0—20 cm土層土壤，放入自封袋中，做好標(biāo)記后放入低溫(4℃左右)冰箱中，盡快運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)。回到實(shí)驗(yàn)室后將新鮮土壤樣品過2 mm篩，立即進(jìn)行室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)。每種植物土壤分別稱取80 g土放入500 ml梅森瓶中，每個(gè)土樣設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)培養(yǎng)瓶土壤水分含量保持在最大田間持水量的60 %，培養(yǎng)溫度為25℃。試驗(yàn)共4個(gè)處理，分別添加葡萄糖為0.1，0.5，1 g/kg干土，分別表示為C0.1，C0.5，C1，以及無添加物的對(duì)照處理(CK)。每隔7 d添加一次葡萄糖，對(duì)照組添加等量蒸餾水，培養(yǎng)35 d后進(jìn)行破壞性取樣。

1.2.3 微生物生物量測(cè)定 微生物量碳(MBC)和微生物氮(MBN)用氯仿熏蒸提取法測(cè)定。每種濃度下均稱取四份土壤樣品，每份2.5 g，其中2份用40 ml 0.5 mol/L的K2SO4溶液萃取，另外2份樣品在真空干燥器中用氯仿避光熏蒸24 h，采用與未熏蒸樣品相同的提取過程。用總有機(jī)碳分析儀測(cè)定浸提液中的總?cè)芙庥袡C(jī)碳和總?cè)芙獾?。微生物量碳和氮值乘以轉(zhuǎn)換系數(shù)(kC=0.38，kN=0.45)。土壤微生物量磷(MBP)通過氯仿熏蒸提取法測(cè)定。稱取四份土壤樣品，每份土壤樣品2.5 g，其中2份直接用50 ml的0.5 mol/L的NaHCO3(pH=8.5，用NaOH調(diào)節(jié))提取，另外兩份熏蒸過程與上述MBC和MBN一致，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定浸提液中的總?cè)芙饬?kP轉(zhuǎn)換系數(shù)為0.4)。MBC，MBN和MBP均為熏蒸樣品和未熏蒸樣品的差值。

1.2.4 酶測(cè)定 稱取3 g鮮土置于125 ml pH=8.2 Tris-HCl溶液中，并用磁選攪拌器攪拌5 min，充分混勻漿水，邊攪拌邊將150 μl土壤懸浮液和50 μl底物溶液加入到96微孔培養(yǎng)板中；陰性對(duì)照為150 μl Tris-HCl和50 μl底物溶液；標(biāo)準(zhǔn)微孔為50 μl 10 μmol/L的4-甲基傘形酮(MUB)或7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)和150 μl Tris-HCl緩沖液；淬火微孔為50 μl標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和150 μl土壤懸浮液；空白微孔加入50 μl不同酶底物溶液和150 μl Tris-HCl的緩沖液。用German[13]的方法計(jì)算酶活性，分別將加完溶液的微孔板放在25℃溫度下培養(yǎng)0.5 h(AP)，2 h(LAP和BG)和4 h(NAG)。培養(yǎng)結(jié)束后，加入10 μl lmol/LNaOH終止反應(yīng)，使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定熒光值，激發(fā)波長(zhǎng)為365 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為450 nm。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 利用SPSS 24.0和Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)同一植被類型不同處理下、同一濃度不同植被類型下各土壤指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析((one-way ANOVA)并采用最小顯著性差異法(LSD)進(jìn)行多重比較；使用Canoco 5.0進(jìn)行冗余分析(RDA)，揭示各土壤因子對(duì)土壤酶及其化學(xué)計(jì)量的影響。所有圖形均使用Origin 9.0進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖添加對(duì)不同演替階段森林土壤理化性質(zhì)的影響

2.2 葡萄糖添加對(duì)不同演替階段森林土壤微生物量及化學(xué)計(jì)量特征的影響

葡萄糖添加顯著改變了不同演替階段森林土壤微生物量C，N，P及其化學(xué)計(jì)量(圖2)。隨著森林演替，山楊林和遼東櫟林微生物碳(MBC)和微生物氮(MBN)的值顯著大于油松林，均為先減小后增加。隨著森林演替，山楊林和遼東櫟林微生物碳(MBC)和微生物氮(MBN)的值顯著大于油松林，均為先減小后增加。MBN，MBP含量為遼東櫟林顯著大于山楊林，大于油松林。MBC，MBC/MBP含量為山楊林顯著大于遼東櫟林，遼東櫟林顯著大于油松林。MBC/MBN含量為山楊林大于油松林和遼東櫟林，MBN/MBP則與此完全相反。

注：圖中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，不同小寫字母代表不同濃度相同植物間的顯著差異，不同大寫字母代表不同植物相同濃度間的顯著差異，下同。

隨著葡萄糖濃度的增加，3種植物MBC和MBN均呈增加趨勢(shì)，山楊林MBC在C1增幅最大為14.9%，油松林在C0.5增幅最大為28%，遼東櫟林在C0.1增幅最大為30%。3種森林土壤MBN均在26.2～40.2之間波動(dòng)。山楊林的MBC/MBN先增加后減小，油松林與之相反，遼東櫟林則一直增加。

山楊林的MBC/MBN與MNC/MBP顯著大于油松林和遼東櫟林。沿葡萄糖濃度梯度山楊林的MBN/MBP一直增加，油松林為先減少后增加，遼東櫟林則為先增加后減小。

圖2 微生物量及化學(xué)計(jì)量隨葡萄糖濃度增加的變化

2.3 葡萄糖添加對(duì)不同演替階段森林土壤酶活性及其化學(xué)計(jì)量特征的影響

由圖3看出，演替不同階段的林地BG，LAP，NAG，BG/(LAP+NAG)、BG/AP、(LAP+NAG)/AP含量均為遼東櫟林大于山楊林，大于油松林。而AP含量則為山楊林大于遼東櫟林，大于油松林。隨葡萄糖濃度的增加，山楊林AP和NAG活性先減小后增加，BG和LAP活性均呈持續(xù)下降。油松林AP和NAG活性先增加后減小，BG活性呈波動(dòng)趨勢(shì)，LAP活性先減小后增加。遼東櫟林AP，BG，LAP和NAG活性均先增加后減小，且遼東櫟林4種酶活性均顯著高于其他兩種植物。BG/(LAP+NAG)中，山楊林持續(xù)減少，油松林先增加后減少，遼東櫟林為一定范圍內(nèi)波動(dòng)。BG/AP中山楊林和遼東櫟林均為持續(xù)下降，油松林在一定范圍內(nèi)波動(dòng)。遼東櫟林BG/(LAP+NAG),BG/AP顯著高于其他油松林和山楊林。山楊林和遼東櫟林的(LAP+NAG)/AP均先增加后減小，油松林則為先減小后增大。在對(duì)土壤酶活性數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，遼東櫟林lnBG/ln(LAP+NAG)，lnBG/lnAP在各個(gè)濃度均顯著大于油松林與山楊林。

2.4 土壤微生物量、酶與影響因子之間的關(guān)系

圖3 土壤酶活性及化學(xué)計(jì)量隨葡萄糖濃度增加的變化

3 討 論

3.1 葡萄糖對(duì)土壤理化性質(zhì)、微生物量及土壤酶活性的影響

圖4 土壤酶化學(xué)計(jì)量隨葡萄糖濃度增加的變化

細(xì)胞外酶化學(xué)計(jì)量學(xué)(酶的相對(duì)豐度)反映了微生物對(duì)養(yǎng)分的需求和環(huán)境對(duì)養(yǎng)分的供給[18]，在生態(tài)系統(tǒng)的生物地球化學(xué)平衡過程中起著關(guān)鍵作用。然而，不同土壤養(yǎng)分對(duì)酶活性的影響仍有爭(zhēng)議，本試驗(yàn)中3種林分土壤酶活性與CK相比，均隨葡萄糖濃度增加而升高。根系分泌物C源輸入中小分子化合物為易于土壤微生物直接利用的含碳有機(jī)物，C源添加改變了土壤C/N與N/P，研究結(jié)果表明C源輸入改變土壤養(yǎng)分的有效性，進(jìn)而調(diào)節(jié)微生物的生理代謝，并最終反映在生態(tài)酶的表達(dá)中。土壤養(yǎng)分狀況影響生態(tài)酶的產(chǎn)生和活性這可以用“資源配置理論”解釋[19]，即資源的可獲得性調(diào)節(jié)微生物和植物合成和分泌生態(tài)酶。

圖5 土壤酶及微生物量與各因子之間的關(guān)系

3.2 葡萄糖對(duì)不同森林生態(tài)系統(tǒng)土壤酶化學(xué)計(jì)量特征及微生物養(yǎng)分限制的影響

在本研究中，RDA結(jié)果表明，土壤酶、微生物量及其化學(xué)計(jì)量比分別與AP，TN，AMN有著顯著性正相關(guān)關(guān)系，此外與土壤SOC和MBC呈顯著正相關(guān)，說明不同林地在P元素水平一致的情況下，SOC，TN的變化顯著影響土壤酶活性。隨著葡萄糖濃度增加，土壤MBC含量增加，土壤酶C/P比值增加，土壤N和P的有效性改變，土壤微生物會(huì)增加參與N和P循環(huán)的酶的產(chǎn)生，以滿足他們對(duì)這些營(yíng)養(yǎng)元素的需求[20]。在各葡萄糖濃度，遼東櫟林和山楊林土壤N/P及土壤酶N/P均顯著大于油松林土壤，說明油松林比山楊林和遼東櫟林具有更強(qiáng)的N顯著。此外，3種林地土壤酶活性中，遼東櫟林在C0.5的N/P減小的幅度最大，為35%，且AP活性在C0.5,C1增加最多，說明高濃度葡萄糖加劇了遼東櫟林土壤的P限制。此外，隨葡萄糖濃度增加，遼東櫟林微生物增加量顯著大于山楊林與遼東櫟林，微生物的增加也加劇了P限制。這與Ren等[21]研究結(jié)果一致，P是一種“巖石衍生”元素，很難從大氣中大量獲取。堿性土壤中植物的消耗以及鈣和鎂離子的吸附導(dǎo)致植被演替過程中磷的生物利用度顯著下降[22]，從而導(dǎo)致P限制。

土壤pH值也與土壤生態(tài)酶活性和化學(xué)計(jì)量顯著相關(guān)，因?yàn)槊糠N土壤生態(tài)酶都有自己的最佳pH值[23]。在本研究中，土壤pH值與AP呈負(fù)相關(guān)，但與土壤C/P和N/P呈正相關(guān)。低pH值條件會(huì)增強(qiáng)P的地球化學(xué)吸附并阻止P在土壤中的遷移[24]，導(dǎo)致土壤P的有效性下降。這種現(xiàn)象最終刺激土壤微生物響應(yīng)磷的需求而合成更多的AP酶[20]。然而，土壤pH值與BG和NAG+LAP呈負(fù)相關(guān)，這與Xu等獲得的結(jié)果相反。這些差異可能是由于兩項(xiàng)研究之間的土壤pH值范圍差異引起的。例如，在我們的研究中，高濃度葡萄糖添加均增加了3種林分土壤pH值，使得pH值的范圍在7.42～8.41，在Xu等的研究中，pH值的范圍為5.43～6.93。總而言之，外源性碳添加對(duì)生態(tài)酶活性和化學(xué)計(jì)量的影響是通過影響土壤物理性質(zhì)，間接影響植物和微生物的細(xì)胞代謝以及間接調(diào)節(jié)環(huán)境養(yǎng)分利用率來實(shí)現(xiàn)的。

本文研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖顯著影響了3種植物土壤酶化學(xué)計(jì)量C/N和N/P與土壤C/P和N/P，這與前人的研究一致[25]。添加葡萄糖能使微生物數(shù)量增加，微生物量數(shù)量與葡萄糖濃度呈正比，土壤酶活性化學(xué)計(jì)量會(huì)隨土壤和微生物量化學(xué)計(jì)量的變化而發(fā)生變化。這說明土壤胞外酶活性并不是處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)之中，而是依賴于土壤和微生物生物量的化學(xué)計(jì)量。因此，葡萄糖影響不同演替階段的植物土壤酶活性化學(xué)計(jì)量是通過土壤-微生物反饋與土壤養(yǎng)分循環(huán)共同影響。

4 結(jié) 論

總之，葡萄糖添加處理促進(jìn)了3種林分土壤激發(fā)效應(yīng)而降低了土壤TN含量，且增加了油松林的N限制和遼東櫟林的P限制。因此植物根系分泌物中碳的輸入可能降低了森林土壤養(yǎng)分活性，增加微生物數(shù)量的同時(shí)，增加土壤N，P元素的限制，進(jìn)而影響根際土壤有機(jī)質(zhì)分解和養(yǎng)分代謝等過程。但需要說明的是，我們的研究中模擬根系分泌物葡萄糖添加處理時(shí)間僅持續(xù)35 d，為進(jìn)一步探究根系分泌物碳輸入對(duì)森林演替過程的長(zhǎng)期影響，需要我們進(jìn)一步深入開展根系分泌物對(duì)森林生態(tài)系統(tǒng)根際范圍內(nèi)的長(zhǎng)期野外碳原位添加的研究。