劉耕苑, 肖 杰, 高明霞, 孫本華,4, 張樹蘭, 楊學云, 馮 浩,3,4, 張彤勛

(1.西北農(nóng)林科技大學 資源環(huán)境學院/農(nóng)業(yè)部西北植物營養(yǎng)與農(nóng)業(yè)環(huán)境重點實驗室,陜西 楊凌 712100; 2.西北農(nóng)林科技大學 水利與建筑工程學院, 陜西 楊凌 712100;3.西北農(nóng)林科技大學 水土保持研究所, 陜西 楊凌 712100; 4.中國旱區(qū)節(jié)水農(nóng)業(yè)研究院, 陜西 楊凌 712100)

不同生態(tài)系統(tǒng)中，N2O排放與土壤性質(zhì)和nirS反硝化細菌之間的關系已有不少報道[8-9]。土壤性質(zhì)會影響N2O排放[10]，N2O排放量與土壤有機碳和土壤硝態(tài)氮含量正相關，與土壤pH負相關[5,11-12]。有研究表明，N2O排放量與nirS反硝化細菌豐度和群落結(jié)構(gòu)無關[7]；但也有研究發(fā)現(xiàn)，N2O排放量與nirS基因豐度密切相關[13]。這些不同可能主要是由于土壤類型和性質(zhì)以及施肥方式不同造成的，研究和明確不同土壤類型和土壤性質(zhì)下nirS反硝化細菌豐度、多樣性和群落結(jié)構(gòu)特征及其與N2O排放之間的關系，對于全面理解土壤反硝化過程具有重要意義。

全球60%的N2O排放量來自于農(nóng)業(yè)土壤[14]，其中施肥是影響土壤N2O排放的關鍵因素。許多研究表明，長期不同施肥方式可引起土壤性質(zhì)的改變并導致nirS細菌豐度、多樣性和群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著差異[15-16]。土是人為長期土糞堆墊而形成的典型土壤，是關中地區(qū)主要土壤類型[17]，長期施肥對土壤理化性質(zhì)產(chǎn)生了巨大影響[18]，并且對農(nóng)田N2O的排放產(chǎn)生影響[19]，但其N2O排放產(chǎn)生差異的原因和微生物機制尚不明確。本研究以20世紀90年代初建立的旱作雨養(yǎng)農(nóng)田長期施肥定位試驗為基礎[19]，通過分析長期不同施肥對旱作雨養(yǎng)農(nóng)田土壤理化性質(zhì)、N2O排放和nirS型反硝化細菌豐度和群落結(jié)構(gòu)的影響及其相互關系，以期為旱作雨養(yǎng)農(nóng)田制定合理的肥料管理措施來減緩農(nóng)田N2O排放提供理論和實踐依據(jù)[20]。

1 材料與方法

1.1 試驗地點和基本情況

長期肥料定位試驗位于中國陜西楊凌農(nóng)業(yè)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)示范區(qū)(北緯34°17′、東經(jīng)108°00′)的“國家黃土肥力和肥料效益監(jiān)測基地”內(nèi)。氣候類型為暖溫帶大陸性季風氣候，年平均氣溫為12.9 ℃，年平均降水量為550～600 mm，主要集中在7—9月，蒸發(fā)量為993 mm，無霜期184～216 d，沒有明顯的年變化。土壤類型為土(土墊旱耕人為土)，黃土母質(zhì)[21]。

1.2 試驗設計

長期試驗始于1990年秋，種植體系為冬小麥—夏休閑。長期肥料試驗共7個處理，本研究選取其中不施肥(CK)、單施氮肥(N)、施氮鉀肥(NK)和施氮磷鉀肥(NPK)共4個處理，小區(qū)面積為399 m2(19 m×21 m)[21]。氮肥用量為135 kg/hm2，磷肥用量為108 kg/hm2，鉀肥用量為67.5 kg/hm2。氮、磷和鉀肥分別采用尿素、過磷酸鈣和硫酸鉀。所有肥料均在小麥播前一次性全部施入。

1.3 氣體樣品采集和測定

氣體樣品采用靜態(tài)箱法采集，每個處理隨機設置3個靜態(tài)箱底座，于2017年6月至2018年6月，每隔7 d采集氣體樣品一次，采用氣相色譜法測定N2O濃度，并計算獲得年度N2O排放量[19]。

1.4 土壤樣品采集

2018年6月小麥收獲后采集0—20 cm耕層混合土樣，每靜態(tài)箱附近隨機采集9個點組成一個混合樣品，樣品裝入塑封袋并置于冰盒中運回實驗室。新鮮樣品剔除動植物殘體，過2 mm篩后分成三部分[21]。一部分樣品風干并保存于室溫下用于土壤理化性質(zhì)分析；一部分保存在<5℃冰箱冷藏并于一周內(nèi)測定土壤硝態(tài)氮；一部分土壤樣品保存在-80℃超低溫冰箱里用于土壤nirS基因豐度、nirS型反硝化細菌的多樣性和群落結(jié)構(gòu)的測定。

1.5 土壤理化性質(zhì)測定

土壤基本理化性質(zhì)的測定方法參照土壤農(nóng)化分析[22]。土壤pH測定采用電極法(水∶土=1∶1)；土壤有機碳采用重鉻酸鉀容量法；全氮采用硫酸消煮-凱氏定氮法；土壤硝態(tài)氮采用KCl浸提-流動注射分析儀測定；土壤有效磷采用NaHCO3浸提-分光光度法；土壤速效鉀采用NH4OAC浸提-原子吸收光譜法。

1.6 土壤DNA的提取、qPCR和高通量測序

稱取相當于0.5 g干土的鮮土，使用E.Z.N.A.?soil分離試劑盒(Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.)進行土壤DNA的提取，使用百分之一的瓊脂糖凝膠電泳檢測[23]。使用nirS-cd3aF(5′-GTSAACGTSAAGGARACSGG-3′)和nirS-R3cd(5′-GASTTCGGRTGSGTCTTGA-3′)引物通過ABI GeneAmp?9700型PCR儀進行擴增[24-25]。nirS基因豐度利用QuantiFluorTM-ST(Promega，USA)進行檢測定量[26]。利用Illumina公司的MiseqPE300平臺進行測序[23]。共獲得了118,932條有效序列，在97%相似度下聚類得到864個OTU。所有處理覆蓋率均為99%，說明樣品被檢出的概率很高。

1.7 數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計

使用QIIME管道分析原始的焦磷酸測序讀數(shù)，以去除低質(zhì)量的讀數(shù)，并從序列讀數(shù)中去除接頭，條形碼和引物。對每個樣品分別進行反硝化細菌序列的分類學分類(OTU)。使用UPARSE軟件(version7.1, http:∥drive5.com/uparse/)，根據(jù)97%的相似度下進行OTU聚類[23]。使用RDP classifier(http:∥rdp.cme.msu.edu/)注釋每個OTU的代表性序列。比對Silva(Release115, http:∥www.arb-silva.de)數(shù)據(jù)庫，設置比對閾值為70%[27]。

利用美吉的I-Sanger生信云平臺(https:∥www.i-sanger.com/)進行α-多樣分析(包括Shannon，Chao1和OTUs等指數(shù))、Heatmap分析和冗余分析[23]。使用SPSS 21軟件進行單因素方差分析(LSD法，p<0.05)和Pearson相關性分析。使用Origin Pro 9.0軟件進行作圖。圖表中數(shù)據(jù)為3個重復的平均值±標準差。

2 結(jié)果與分析

2.1 長期施肥對土壤N2O累積排放量和土壤性質(zhì)的影響

注：不同字母表示5%水平上差異顯著(p<0.05)。

表1 不同施肥處理土壤性質(zhì)

2.2 長期施肥對土壤nirS基因豐度、nirS型反硝化細菌的α-多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響

每克干土的nirS基因豐度為7.28×106～11.79×106個。與CK相比，所有施肥處理的nirS基因豐度無顯著變化。所有施肥處理的nirS型反硝化細菌群落的Shannon指數(shù)與CK均無顯著差異，但NK顯著高于NPK。相比CK，NK顯著提高了Chao1指數(shù)，而其他處理間沒有顯著差異。NK測得的OUT數(shù)量最高達420個，且顯著高于CK和NPK。所有處理土壤nirS型反硝化細菌物種數(shù)(species)無顯著差異(表2)。

表2 不同施肥處理土壤的nirS基因豐度和細菌α-多樣性

不同施肥處理土壤nirS型反硝化細菌種水平的分布比例(將相對豐度<1%的部分合并為others)見圖2，豐富度最高的4個優(yōu)勢種為unclassified_k_norank_d_Bacteria，Uncultured_bacterium_2303，unclassified_p_Proteobacteria和Rhodanobacter_sp._D206a。unclassified_k_norank_d_Bacteria的相對豐度，CK，N和NK差異不顯著，但均顯著高于NPK處理。unclassified_p_Proteobacteria的相對豐度，CK，N和NK差異不顯著，其中CK和N顯著高于NPK。uncultured_bacterium_2303的相對豐度NPK最高，顯著高于CK和N。Rhodanobacter_sp._D206a的相對豐度，CK，N和NK差異不顯著，但均顯著低于NPK。CK和N的nirS型反硝化細菌群落結(jié)構(gòu)組成最接近，其次是NK，而與NPK差別較大(圖2)。

圖2 不同施肥處理土壤nirS型反硝化細菌種水平相對豐度和聚類分析結(jié)果

2.3 N2O累積排放量、nirS型反硝化細菌群落和土壤性質(zhì)之間的關系

SOC，AP和TN含量對土壤nirS型反硝化細菌群落結(jié)構(gòu)組成具有顯著影響(p<0.05)，而土壤pH具有極顯著影響(p<0.01)。uncultured_bacterium_2303和Rhodanobacter_sp._D206a的相對豐度與SOC，AP和TN含量極顯著正相關，而unclassified_p_Proteobacteria和unclassified_k_norank_d_Bacteria呈顯著負相關。uncultured_bacterium_2303和uncultured_bacterium_888的相對豐度與土壤pH值極顯著負相關，而unclassified_p_Proteobacteria和unclassified_k_norank_d_Bacteria呈極顯著正相關(圖3)。

3 討 論

注：所有的排序軸由蒙特卡羅算法檢驗，*代表環(huán)境因子與群落結(jié)構(gòu)在0.05水平上顯著相關，**代表在0.01水平上極顯著相關。

許多研究表明，N2O排放量與nirS基因豐度(多度)呈正相關[13,31]。本研究中，Pearson相關分析表明，EN2O與nirS基因豐度之間的相關系數(shù)為0.057，相關性不顯著。這表明長期不同化肥施用下土nirS基因豐度對土壤N2O排放并沒有顯著影響。nirS基因豐度僅代表nirS型反硝化細菌的數(shù)量，而不能代表nirS基因的表達以及亞硝酸鹽還原酶的活性，并且極易受外界環(huán)境的影響而發(fā)生變化。本研究中，長期施用化肥對土nirS型反硝化細菌豐度并沒有顯著影響(表2)，黑土、灌淤土和黑壚土上進行的長期施肥試驗結(jié)果也同樣表明，長期施氮磷鉀化肥對土壤nirS基因豐度沒有顯著影響[5,16,32]?？梢姡底饔牮B(yǎng)條件下，長期施肥后土N2O累積排放量的變化并不能通過nirS型反硝化細菌豐度的變化來解釋。

對比不施肥處理，長期施肥對土壤nirS型反硝化細菌α-多樣性無顯著影響，但是長期施NK肥顯著高于長期施NPK肥(表2)。相較于NK處理，NPK處理的nirS型反硝化細菌的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，部分優(yōu)勢種(uncultured_bacterium_2303和Rhodanobacter_sp._D206a)的相對豐度顯著提高，未找到分類信息細菌(unclassified_p_Proteobacteria和unclassified_k_norank_d_Bacteria)的相對豐度顯著降低，這可能導致了nirS細菌群落α-多樣性的降低(圖2和表2)。此外，NPK處理的OTUs指數(shù)和物種數(shù)量(species)較NK少也說明了這一點(表2)。長期施肥對土壤nirS型反硝化細菌α-多樣性的影響可能與施用磷肥有關。有研究表明，土壤磷含量較高會降低土壤微生物的α-多樣性[33]。由于長期施用磷肥，NPK的土壤有效磷含量達到了26.6 mg/kg，顯著高于不施肥處理和不施磷處理(表1)。本研究中，通過Pearson相關分析表明，EN2O與反映nirS型反硝化細菌α-多樣性的Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)、OTUs指數(shù)和物種數(shù)之間的相關系數(shù)分別為-0.299，0.248，-0.004和-0.069，均沒有顯著相關性。這表明長期不同化肥施用下土nirS型反硝化細菌多樣性對土壤N2O排放也沒有顯著影響。因此，nirS型反硝化細菌群落α-多樣性亦不是影響長期施肥后土N2O累積排放量的關鍵因素。

越來越多的研究表明，對N2O排放起關鍵作用的是nirS型反硝化細菌中的某些優(yōu)勢菌，比如Rhodanobacter，Azospirillum，Bradyrhizobium和Paracoccus等[3,34]。雨養(yǎng)旱作條件下，土nirS型反硝化細菌的主要優(yōu)勢種為uncultured_bacterium_2303，Rhodanobacter_sp._D206a，unclassified_p_Proteobacteria和unclassified_k_norank_d_Bacteria(圖2)。長期不同化肥施用導致土的nirS型反硝化細菌群落結(jié)構(gòu)組成產(chǎn)生了顯著差異，其中長期平衡施用化肥提高了uncultured_bacterium_2303和Rhodanobacter_sp._D206a的相對豐度，降低了unclassified_p_Proteobacteria和unclassified_k_norank_d_Bacteria的相對豐度；而長期非平衡施肥(N和NK)對unclassified_p_Proteobacteria，unclassified_k_norank_d_Bacteria和Rhodanobacter_sp._D206a的相對豐度沒有顯著影響(圖2)。冗余分析進一步表明，nirS型反硝化細菌群落結(jié)構(gòu)組成對N2O排放的影響與關鍵優(yōu)勢種的相對豐度有關。EN2O與uncultured_bacterium_2303和Rhodanobacter_sp._D206a相對豐度顯著正相關，而與unclassified_p_Proteobacteria和unclassified_k_norank_d_Bacteria的相對豐度顯著負相關(圖3)。因此，雨養(yǎng)旱作條件下，長期施肥改變了土nirS型反硝化細菌的群落結(jié)構(gòu)組成,從而影響了N2O排放。

土壤SOC能夠通過礦化作用間接為反硝化細菌提供電子供體，從而可以促進反硝化作用；土壤pH值會影響nirS型反硝化細菌的生長環(huán)境，而AP提高可以為nirS型細菌生長代謝提供所需要的磷素營養(yǎng)[35]。許多研究表明，長期不同施肥方式導致nirS型細菌群落結(jié)構(gòu)組成發(fā)生改變的主要原因是長期施肥導致的SOC，TN，全磷和pH值等土壤因子的改變[36-37]。本研究中，長期非平衡施肥與不施肥處理土壤性質(zhì)較接近，而長期平衡施用化肥顯著提高了SOC，TN和AP，并降低了土壤pH值(表1)。相較于其他處理，長期平衡施用NPK化肥后土壤nirS型細菌優(yōu)勢種中的uncultured_bacterium_2303和Rhodanobacter_sp._D206a的相對豐度顯著增加，而unclassified_k_norank_d_Bacteria和unclassified_p_Proteobacteria的相對豐度顯著下降(圖2)。冗余分析也表明，SOC，AP，TN和pH值等土壤性質(zhì)是影響nirS型細菌群落結(jié)構(gòu)組成的主要環(huán)境因素(圖3)。

4 結(jié) 論