馬明婕 韋彩玲 朱駿凱 劉棋琴 駱其君 陳海敏 楊 銳

(1. 寧波大學(xué)浙江省海洋生物工程重點實驗室， 寧波 315823; 2. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院， 寧波 315823)

大型海藻是海洋中重要的初級生產(chǎn)者和生態(tài)工程師， 具有食品、藥物、飼料和肥料等經(jīng)濟價值[1]。海洋環(huán)境惡化使得海藻種群的生存和多樣性受到多種壓力的威脅[2，3]。收集并保存藻類種質(zhì)資源成為保護生物多樣性和藻類育種的重要工作。組織活體繼代培養(yǎng)是海藻種質(zhì)保存古老且常規(guī)的手段，亦是多數(shù)藻類種質(zhì)庫的主要保種方式。于-196—-40℃進(jìn)行冷凍保存則是藻類學(xué)家關(guān)注的另一種質(zhì)保藏方法。其最大的優(yōu)點在于：在凍存保護劑的作用下， 生物組織和細(xì)胞能夠在低溫導(dǎo)致代謝停滯的同時保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性及遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性[4]；并且， 凍存期間可以避免產(chǎn)生新的微藻、細(xì)菌或真菌污染[5]。因此， 開發(fā)和優(yōu)化低溫凍存方法， 提高海藻種質(zhì)的冷凍存活率一直受到藻類學(xué)家的關(guān)注。目前， 海帶、紫菜、江蘺和萱藻等很多大型經(jīng)濟海藻都進(jìn)行過孢子體或配子體的低溫凍存嘗試， 但大型海藻的冷凍保存普遍存在效率偏低且凍存后期恢復(fù)困難等問題[6—8]。

紫菜(Porphyrasensu lato)[9]是潮間帶重要的底棲海藻， 亦是東亞廣泛栽培的經(jīng)濟藻類。與其他大型栽培海藻的情況相似， 種質(zhì)退化和良種使用率不高是紫菜栽培產(chǎn)業(yè)面臨的主要問題[10]。保護紫菜種質(zhì)資源， 擴大其收藏， 提高保種效率， 對紫菜多樣性保護、遺傳育種及產(chǎn)業(yè)發(fā)展至關(guān)重要。在生產(chǎn)中， 農(nóng)戶會收集當(dāng)年的成熟紫菜葉狀體作為種菜，晾干脫水后于-20℃冷凍；次年取出， 常溫復(fù)水后收集果孢子用于培育絲狀體苗。這些自然生長的紫菜群體遺傳混雜嚴(yán)重， 且冷凍大量種菜需要較多空間和能耗， 對紫菜種質(zhì)的質(zhì)量控制具有相當(dāng)?shù)木窒扌訹11]。紫菜自由絲狀體是由果孢子發(fā)育而來的二倍體微觀世代， 體積小、耐受性強和遺傳性質(zhì)穩(wěn)定， 且易于培養(yǎng)和誘導(dǎo)調(diào)控；因此， 自由絲狀體是紫菜種質(zhì)的最佳保存形式[12]， 也是紫菜種質(zhì)低溫凍存的重點研究對象。

影響生物組織低溫凍存的主要因素為細(xì)胞滲透壓失衡、細(xì)胞溶質(zhì)濃度過度增加[13]和胞內(nèi)冰晶生成[14]。凍存方法、凍存保護劑的種類、濃度和處理時間[15，16]、降溫速率、解凍溫度[12，17]及不同物種的低溫耐受能力都會影響凍存效率[18]?？茖W(xué)家通過凍存保護劑置換出細(xì)胞內(nèi)水， 或者優(yōu)化凍存程序， 其基本目的都是為了減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，促使細(xì)胞形成玻璃化狀態(tài)， 以減緩凍存對細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)的損傷[14，19]。此外， 對植物組織進(jìn)行冷馴化或在低濃度玻璃化培養(yǎng)液中預(yù)培養(yǎng)也可以加強生物本身的抗冷能力， 調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓、應(yīng)對氧化脅迫，進(jìn)而提高凍存效率[20—23]。對藻類凍存方案中凍存保護劑和凍存程序的研究已有較多報道， 而利用冷適應(yīng)提高大型海藻凍存效率方案的報道則較少。

脫落酸(Abscisic acid， ABA)是一種半倍萜羧酸類植物激素， 在植物中最典型的功能為：在干旱、寒冷、高溫和失水等脅迫條件下可提高植物的抗逆能力[24]。在藻類中， ABA可以通過誘導(dǎo)抗氧化酶表達(dá)， 增加植物對氧化應(yīng)激的耐受性以減緩失水、滲透及鹽脅迫的傷害[25]。是否可以利用ABA處理及低溫適應(yīng)性培養(yǎng)來提高紫菜絲狀體對冷凍的耐受性， 進(jìn)而提高種質(zhì)冷凍保存的效率？為驗證這一假設(shè)， 本文以壇紫菜自由絲狀體為實驗材料， 擬采用ABA處理和4℃低溫誘導(dǎo)紫菜絲狀體自身的抗冷能力， 以期提高冷凍保存效率， 為改進(jìn)紫菜種質(zhì)凍存方案提供新思路和實驗參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及培養(yǎng)

壇紫菜(Pyropia haitanensis)浙東1號(ZD-1)自由絲狀體， 由浙江省海洋生物工程重點實驗室提供。挑選色澤紅潤， 健康松散的藻團備用。培養(yǎng)條件：溫度20℃， 光照強度40 μmol·photons/(m2·s)， 光周期12L∶12D， 寧大Ⅲ號培養(yǎng)液培養(yǎng)[26]。寧大Ⅲ號母液：990 nmol/L KNO3、57 nmol/L K2HPO4、9 nmol/L FeSO4·7H2O、54 nmol/L Na2EDTA、1 nmol/L MnSO4·H2O、0.5 mg/L VB12和5 mg/L VB1。培養(yǎng)液由母液與滅菌海水按1∶1000比例配置而成。

滅菌海水：鹽度為25的天然海水由0.22 μm的水系濾膜過濾并高壓蒸汽滅菌。

1.2 凍存方法

凍存保護劑由基礎(chǔ)溶液(0.5 mol/L山梨醇和0.01 mol/L HEPES溶于稀釋滅菌海水[12])和20%DMSO混合配置。

操作：將壇紫菜絲狀體(約1 mg鮮重)懸浮在0.75 mL的0℃的基礎(chǔ)溶液中。用等體積冰浴后的20%DMSO(w/v)于15min內(nèi)緩慢加入懸浮液中， 使DMSO終濃度達(dá)到10%， 在4℃平衡4h。將裝有絲狀體懸液的凍存管置于程序降溫盒(Biosharp， 美國)中， 以-1℃/min的速度冷卻至-80℃， 保存24h。

解凍：在40℃水浴中迅速解凍， 管內(nèi)還留有少量冰時將凍存管置于冰水浴中， 用0℃的海水在30min內(nèi)逐漸稀釋7倍， 然后用200目篩絹篩去凍存液， 將絲狀體以80 mg/L的密度重懸于寧大Ⅲ號培養(yǎng)液中培養(yǎng)。解凍后1周內(nèi)每天更換1次培養(yǎng)液。其后， 按檢測周期(10d、20d和35d)更換培養(yǎng)液。檢測并記錄存活率。

以此程序凍存的樣本， 作為實驗對照。

1.3 ABA和4℃冷適應(yīng)處理

ABA溶液配置及處理先用無菌海水配置成1 mmol/LABA母液， 經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后稀釋成0、25、50、100、200和400 μmol/LABA溶液。取(0.1±0.02) g壇紫菜絲狀體在500 mL不同濃度的ABA溶液中恒溫?fù)u床培養(yǎng)3d， 培養(yǎng)條件同1.1。設(shè)置3個生物學(xué)平行。

冷適應(yīng)0.5 g/L壇紫菜絲狀體在4℃冰箱內(nèi)黑暗處理6d， 設(shè)置3個生物學(xué)平行。

預(yù)處理后凍存實驗通過2.2的結(jié)果最終確定以100 μmol/L的ABA處理48h和4℃暗培養(yǎng)6d預(yù)處理后的樣本為材料， 根據(jù)1.2的凍存方法進(jìn)行實驗。凍存程序完成后， 按上文進(jìn)行指標(biāo)的測定。設(shè)置3個生物學(xué)平行。

1.4 生理生化及分子指標(biāo)檢測

藻體相對日生長率(RGR)測量不同處理組壇紫菜絲狀體初始和結(jié)束時的重量， 計算各樣品的相對日生長速率RGR， 其計算公式為[27]：

式中，ST為第T天藻體鮮重，ST-3為前一次稱量時的藻體鮮重。

PSⅡ最大光量子效率(Fv/Fm)用葉綠素?zé)晒鈨xPAM(德國WAIZ公司)測定藻體的PSⅡ最大光量子效率Fv/Fm[28]。

存活率以伊文思藍(lán)染色法檢測絲狀體的存活率[29]。死細(xì)胞被染成藍(lán)色， 活細(xì)胞保持紅色。觀察統(tǒng)計存活的細(xì)胞(紅色)和死細(xì)胞(藍(lán)色)， 計算絲狀體的存活率。

抗冷相關(guān)基因的Realtime qPCR分析參照Plant RNA Kit (OMEGA)總RNA抽提試劑盒說明書提取每個樣品的總RNA， 用TaKaRa PrieScript RT reagent Kit (TaKaRa， 中國)試劑盒反轉(zhuǎn)成cDNA。以18S rRNA基因作為內(nèi)參基因， 在Light Cyber 96 System (Roche， 瑞士)儀器中檢測壇紫菜絲狀體中質(zhì)膜轉(zhuǎn)運蛋白P(H+)-ATPase、酰基脂質(zhì)去飽和酶(Acyl-lipid desaturase，ald)、錳超氧化物歧化酶(Mn-superoxide dismutase A，Mn-sodA)、銅/鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-superoxide dismutase 1， Cu/Znsod 1)、抗壞血酸過氧化氫酶(Ascorbate peroxidase-2，apx-2)、熱激蛋白70(Heat shock protein70-4，hsp70-4)、八氫番茄紅素合成酶(Phytoene synthase-2，psy-2)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，gapdh)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathioneperoxidase-1，gpxha-1)等編碼基因的相對表達(dá)量(表1)。不同處理設(shè)置3個生物學(xué)平行， 每個平行做3次技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)體系20 μL，擴增程序：95℃預(yù)變性3min；95℃變性5s， 60℃/55℃退火18s， 72℃延伸13s， 50個循環(huán)；在總延伸結(jié)束后， 加入溶解曲線的制備(60—95℃)步驟。用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

表1 目標(biāo)基因的RT-qPCR引物序列Tab. 1 RT-qPCR primer sequence of the target genes

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗數(shù)據(jù)和統(tǒng)計作圖采用Origin 2018軟件， 利用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)或雙因素方差分析(Two-way ANOVA)， 采用Tukey多重比較檢驗來確定各處理間的差異顯著性。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 ABA對壇紫菜絲狀體相對日生長率的影響

ABA預(yù)處理會降低壇紫菜自由絲狀體的相對日生長率RGR(圖1)， 且高濃度ABA(≥100 μmol/L)的抑制作用更為強烈(P＜0.01)， 當(dāng)ABA濃度為200和400 μmol/L時， 絲狀體出現(xiàn)死亡的情況。

圖1 不同濃度ABA處理壇紫菜絲狀體的相對日生長率Fig. 1 Relative growth rate (RGR) of P. haitanensis conchocelis at treatments of different ABA concentration

2.2 ABA對壇紫菜絲狀體最大光量子效率Fv/Fm的影響

ABA抑制了壇紫菜自由絲狀體的最大光量子效率Fv/Fm(圖2)?？傮w看， ABA對壇紫菜的抑制作用在24h之后表現(xiàn)得比較明顯， 抑制強度也隨著ABA濃度的升高而加強(P＜0.05)。當(dāng)ABA濃度≤100 μmol/L時， 去除ABA 72h后，F(xiàn)v/Fm均可恢復(fù)至正常水平(P＞0.05)， 但高濃度ABA(＞200 μmol/L)的抑制作用則難以恢復(fù)。

圖2 ABA對壇紫菜絲狀體的最大光量子效率Fv/Fm的影響Fig. 2 Effect of ABA on Fv/Fm of P. haitanensis conchocelis

根據(jù)既能抑制藻體生長但又不會從根本上傷害藻體生理功能的原則， 選擇100 μmol/L作為壇紫菜絲狀體凍存前預(yù)處理的ABA作用濃度。

2.3 不同處理對冷凍保存的壇紫菜絲狀體存活率的影響

在不同處理中， 壇紫菜絲狀體經(jīng)-80℃凍存后的存活率及顯微形態(tài)如圖3和圖4所示。結(jié)果顯示：經(jīng)4℃冷適應(yīng)6d和常溫下添加外源ABA(100 μmol/L)處理48h后， 絲狀體經(jīng)凍存和解凍復(fù)蘇后的實時存活率顯著高于常規(guī)凍存組(CK;P＜0.05)。ABA組存活率穩(wěn)定在59%， 冷適應(yīng)組存活率平均穩(wěn)定在89%(圖3)。反觀常規(guī)凍存組， 隨著培養(yǎng)時間的延長， 存活率不斷下降， 到35d時存活率僅為17%?？梢娂词褂斜Ｗo劑的保護， 冷凍仍舊會對藻體產(chǎn)生傷害。這些傷害會在后續(xù)培養(yǎng)中逐漸顯現(xiàn)， 最終導(dǎo)致種質(zhì)衰亡。經(jīng)過4℃冷適應(yīng)和ABA處理的壇紫菜絲狀體在存活率和細(xì)胞狀態(tài)等表現(xiàn)上均明顯優(yōu)于常規(guī)凍存組(P＜0.01)， 4℃冷適應(yīng)組又顯著優(yōu)于ABA處理組(P＜0.05)， 4℃冷適應(yīng)6d的絲狀體細(xì)胞在凍存中受到的傷害最小， 恢復(fù)最快(圖4)。

圖3 不同處理下壇紫菜絲狀體的凍存存活率Fig. 3 Survival rate of P. haitanensis conchocelis under different treatments

圖4 不同處理下壇紫菜絲狀體的顯微觀察Fig. 4 Microscopic observation of P. haitanensis conchocelis under different treatments

2.4 ABA和冷適應(yīng)處理及凍存后壇紫菜絲狀體的最大光量子效率Fv/Fm

壇紫菜絲狀體經(jīng)-80℃冷凍保存及解凍后， 在20℃恢復(fù)培養(yǎng)并測量PSⅡ最大光量子效率(Fv/Fm；圖5)。隨著培養(yǎng)時間的延長， 所有樣本的Fv/Fm均逐步回升， 說明凍存過的絲狀體在適宜條件下可以恢復(fù)光合作用。F: 0表明凍存完全抑制了壇紫菜絲狀體的光合作用。經(jīng)ABA和冷適應(yīng)處理的絲狀體在恢復(fù)過程中， 光合作用的恢復(fù)速率顯著高于對照組(P＜0.05)。在培養(yǎng)35d時， 4℃冷適應(yīng)組Fv/Fm完全恢復(fù)正常。

圖5 不同處理組壇紫菜絲狀體最大光量子效率Fv/FmFig. 5 Fv/Fm of P. haitanensis conchocelis under different treatments

2.5 ABA和冷適應(yīng)處理對壇紫菜絲狀體抗冷相關(guān)基因表達(dá)的影響

我們以正常培養(yǎng)的絲狀體為對照， 對9個冷適應(yīng)及抗逆相關(guān)基因進(jìn)行了qRT-PCR的檢測(圖6)。結(jié)果顯示：在ABA處理組和4℃冷適應(yīng)組的絲狀體中P(H+)-ATPase、Mn-sod A、Cu/Zn-sod 1、psy-2和gapdh等基因的表達(dá)均顯著上調(diào)(P＜0.01)， 且冷適應(yīng)組上調(diào)的幅度遠(yuǎn)大于ABA處理組(P＜0.01)。2個處理組ald的表達(dá)量均顯著高于對照組(P＜0.01)， 但ABA處理組和冷適應(yīng)組的差異不明顯(P＞0.05)。ABA處理組中的hsp70-4表達(dá)量顯著高于對照組和4℃冷適應(yīng)組(P＜0.01)。ABA也上調(diào)了藻體apx-2基因的表達(dá)(P＜0.01)， 但在4℃冷適應(yīng)組中該基因則表現(xiàn)為下調(diào)(P＜0.05)。在所有組別中，gpxha表達(dá)量均無顯著變化。

圖6 不同處理下壇紫菜絲狀體抗冷相關(guān)基因的相對表達(dá)量Fig. 6 Relative expression of cold-resistance genes of P. haitanensis conchocelis under different treatments

3 討論

3.1 強化藻體抗冷能力可提高冷凍保存的存活率

在已報道的紫菜冷凍保存研究中， 多種紫菜絲狀體凍存復(fù)蘇后的存活率最高達(dá)77%[30，31]， 也有部分研究表明凍存的絲狀體存活率可達(dá)80%以上[15]，葉狀體的冷凍存活率更是高達(dá)94.6%[32]。然而， 我們重復(fù)了這些方法， 發(fā)現(xiàn)經(jīng)解凍復(fù)蘇后， 絲狀體的實時存活率雖然可以達(dá)到70%以上， 但是隨著恢復(fù)培養(yǎng)時間的延長， 絲狀體存活率呈顯著下降的趨勢?？梢妰龃鎸υ弩w的傷害可能會在復(fù)蘇后期逐漸顯現(xiàn)。馬寧寧等[33]報道， 生長旺盛的紫菜絲狀體凍存后存活率較低， 冷馴化的絲狀體有一定的存活率， 低光高溫誘導(dǎo)形成的殼孢子囊枝(即膨大藻絲)的冷凍存活率最高， 可達(dá)60%以上。然而， 在低溫和低光照的保種條件下， 殼孢子囊枝的狀態(tài)難以長期維持；且從細(xì)胞結(jié)構(gòu)上看， 此階段的藻細(xì)胞液泡增大、線粒體體積增大且數(shù)量增多[34]， 并不適于作為種質(zhì)保存的材料。此外， 初始的藻體狀態(tài)及操作中的物理傷害(如剪碎絲狀體)也可能會影響藻體的冷凍存活率。因此， 對于提高凍存效率， 增強藻體自身對冷凍脅迫的適應(yīng)能力與改善凍存方法同等重要。

采用冷馴化(-1—4℃黑暗培養(yǎng)8—12h)可以提高植物在液氮中冷凍的存活率[35]。Ben-Amotz等[20]發(fā)現(xiàn)在4℃暴露4周以上可以誘導(dǎo)出微藻的抗寒性，光周期和光強改變或者營養(yǎng)鹽缺乏也可以增強藻的抗凍能力及提高存活率。ABA對植物抵御非生物逆境脅迫起著極其重要的作用， 通過外源添加ABA可以顯著提高植物的抗逆能力[36]。例如ABA可以誘導(dǎo)水稻(Oryza sativaL.)[37]和萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)[38]體內(nèi)抗氧化基因的表達(dá)和抗氧化防護酶的活性， 來緩解滲透脅迫導(dǎo)致的氧化損傷， 從而提高整體的抗氧化防護能力。在本實驗中， 4℃低溫的抗寒鍛煉和ABA預(yù)處理使得壇紫菜絲狀體的生理狀態(tài)得到了調(diào)整， 藻體的存活率較常規(guī)凍存組提高了35%—72%。

3.2 ABA和冷適應(yīng)促進(jìn)了紫菜抗冷相關(guān)基因的表達(dá)

在低溫下， 細(xì)胞膜由液晶相過渡到凝膠相(玻璃化狀態(tài))， 伴隨著膜流動性降低、離子滲漏和膜蛋白失活等現(xiàn)象， 最終會導(dǎo)致細(xì)胞冷休克死亡[39]。研究發(fā)現(xiàn)， 嗜冷微生物和南極微藻可通過增加膜轉(zhuǎn)運蛋白和不飽和脂肪酸的含量及提高抗氧化防護酶的合成等， 達(dá)到提升細(xì)胞膜流動性、降低細(xì)胞質(zhì)冰點和增強抗氧化防護， 最終降低冷凍對細(xì)胞影響的目的[40，41]。也有研究報道， 增加膜轉(zhuǎn)運蛋白P(H+)-ATPase含量和使膜脂中的脂肪酸去飽和可以提高細(xì)胞膜流通性并調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外離子的平衡[42]， 最終提高紅藻的抗寒能力[43]。?；|(zhì)去飽和酶(Acyl-lipid-desaturase， ALD)在植物的抗寒性中亦有重要作用， 被認(rèn)為是適應(yīng)溫度變化時最有效的調(diào)節(jié)膜脂不飽和程度的酶[44]。在擬南芥(Arabidopsis thaliana)和煙草(Nicotiana tabacum)中，ald基因上調(diào)能夠增強植物的抗寒性[45，46]。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)不僅在糖酵解和光合作用中起重要作用， 還參與膜融合和膜轉(zhuǎn)運等多種亞細(xì)胞水平的活動[47]。植物中的gapdh基因參與抑制氧化脅迫下活性氧的積累， 控制電子傳遞鏈中的電子轉(zhuǎn)運應(yīng)答氧化脅迫等， 幫助抵御不良環(huán)境對植物造成的傷害[48]。在本研究中， 經(jīng)過ABA和冷適應(yīng)處理， 壇紫菜絲狀體的P(H+)-ATPase基因、ald基因及gapdh基因均顯著上調(diào)；由此推測， 在壇紫菜絲狀體中， 可能通過調(diào)控膜脂的飽和度和跨膜離子運輸效率來調(diào)節(jié)藻體的滲透性， 從而增強抗凍能力。

類胡蘿卜素是重要的光合色素， 在植物逆境調(diào)控中起重要作用。例如， 極地微藻可大量合成和積累類胡蘿卜素來提高抗逆能力[49]。八氫番茄紅素合成酶(PSY)是類胡蘿卜素——番茄紅素合成的關(guān)鍵酶之一[50]， 已有研究表明，PSY的過表達(dá)可以提高類胡蘿卜素的含量[51]。劉欣[52]發(fā)現(xiàn)外源ABA(100 μmol/L)處理壇紫菜48h， 對壇紫菜類胡蘿卜素的積累有積極作用。在本研究中， ABA和冷適應(yīng)均可以顯著促進(jìn)壇紫菜絲狀體psy-2基因的表達(dá)， 有助于提高絲狀體的抗凍能力。

植物在非脅迫狀態(tài)下， 自由基處于動態(tài)平衡。當(dāng)脅迫發(fā)生， 植物體內(nèi)積累大量的活性氧(ROS)， 導(dǎo)致膜脂過氧化， 造成細(xì)胞損傷[53]。植物中的抗氧化酶防御系統(tǒng)由超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化氫酶(POD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)及抗壞血酸過氧化氫酶(APX)等多種成分參與， 與非酶保護系統(tǒng)共同調(diào)節(jié)氧自由基代謝的平衡[54]。植物的抗寒能力與抗氧化酶系統(tǒng)的活性成正比[55]。藻類的SOD分為4種同工型：Fe-SOD、Mn-SOD、Cu/Zn-SOD和Ni-SOD。其中， Mn-SOD主要與光系統(tǒng)Ⅱ和線粒體相關(guān)聯(lián)， Cu/Zn-SOD主要存在于葉綠體中[54]。SOD和APX是植物葉綠體中主要的ROS清除酶， 有研究表明ABA對光系統(tǒng)Ⅱ復(fù)合體有保護作用， 而且能夠提高SOD、APX等抗氧化酶的活性[56]， 這與我們的實驗結(jié)果是一致的。谷胱甘肽過氧化物酶在很多動植物中起自由基清除作用。壇紫菜的gpx基因在高溫脅迫下表現(xiàn)為先上調(diào)后下調(diào)的趨勢， 當(dāng)壇紫菜失水達(dá)到40%時， 該基因也明顯下調(diào)[57]。然而， 在本研究中g(shù)pxha-1的表達(dá)未發(fā)生顯著性變化。APX是利用抗壞血酸為電子供體的H2O2的清除劑， 在壇紫菜葉狀體的光脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[58]， 在高等植物中， APX也常用以提高植物對強光、極端溫度和鹽脅迫等的抗性[59]。但在本研究中，apx-2基因在冷適應(yīng)后下調(diào)， 可能是因為冷適應(yīng)是在黑暗條件下進(jìn)行所導(dǎo)致， 具體原因有待進(jìn)一步驗證。

熱激蛋白hsp70也是常見的抗逆相關(guān)基因， 在植物體內(nèi)發(fā)揮分子伴侶的作用， 幫助合成防御及修復(fù)所需的各類物質(zhì)， 增強植物的抗逆性[60]。ABA可以促進(jìn)龍須菜hsp70大量表達(dá)， 幫助龍須菜應(yīng)對高溫脅迫， 而且在壇紫菜中hsp70基因?qū)τ跓峒っ{迫的反應(yīng)非常敏感[61]。在本研究中， ABA顯著上調(diào)了壇紫菜絲狀體hsp70-4的表達(dá)。但在冷適應(yīng)組，hsp70-4基因表達(dá)變化不明顯。這說明壇紫菜絲狀體的hsp70基因?qū)溥m應(yīng)并不敏感。

hsp70-4和apx-2基因的表現(xiàn)提示， 壇紫菜絲狀體對ABA和冷適應(yīng)的響應(yīng)機制是不同的。但綜合而言， ABA處理和4℃冷適應(yīng)均可提高壇紫菜絲狀體的冷凍存活率。推測， 經(jīng)兩種方法預(yù)處理后， 壇紫菜絲狀體可能通過提高質(zhì)膜的離子運輸效率及抗氧化酶的活性、促進(jìn)細(xì)胞膜脂肪酸去飽和和增加保護色素的合成等方式調(diào)整藻體自身狀態(tài)， 提前適應(yīng)即將進(jìn)入的超低溫冷凍環(huán)境， 并在解凍后迅速恢復(fù)正常生理狀態(tài)， 從而提高凍存藻體的存活率。

4 結(jié)論

利用ABA(100 μmol/L)和4℃冷適應(yīng)預(yù)處理壇紫菜絲狀體， 然后進(jìn)行-80℃常規(guī)凍存， 能夠顯著提高紫菜絲狀體種質(zhì)保存的效率。4℃冷適應(yīng)法操作簡單， 效果顯著， 易于推廣， 具有較好的應(yīng)用潛力。