簡祈盼 朱映睿 鄭宇錕 成煥波 涂濟源 王光忠

中圖分類號 R283.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2022）05-0569-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.05.10

摘 要 目的 比較虎杖產(chǎn)地加工與炮制一體化（簡稱“一體化”）制備的飲片與傳統(tǒng)飲片的指紋圖譜及體外抗氧化活性差異。方法 根據(jù)一體化工藝和傳統(tǒng)工藝分別制備10批虎杖一體化飲片和10批傳統(tǒng)飲片。采用高效液相色譜法建立虎杖兩種飲片的指紋圖譜，并進行比較;檢測虎杖兩種飲片對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基、ABTS自由基、超氧自由基、羥自由基的清除率以及對Fe3+的還原能力，比較這兩種飲片的體外抗氧化活性。結(jié)果 虎杖兩種飲片共有11個共有峰，其中一體化飲片共有17個共有峰，傳統(tǒng)飲片共有13個共有峰;虎杖一體化飲片中6號峰（虎杖苷）和15號峰（大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷）的峰高明顯高于傳統(tǒng)飲片，傳統(tǒng)飲片中13號峰（白藜蘆醇）、17號峰（大黃素）和19號峰（大黃素甲醚）的峰高明顯高于一體化飲片。體外抗氧化活性結(jié)果顯示，虎杖一體化飲片和傳統(tǒng)飲片對DPPH自由基、ABTS自由基、超氧自由基和羥基自由基均具有清除能力，對Fe3+也均具有還原能力。結(jié)論 虎杖一體化炮制工藝較傳統(tǒng)炮制工藝可更好地保留虎杖的有效成分，且虎杖一體化飲片的體外抗氧化活性強于傳統(tǒng)飲片。

關(guān)鍵詞 虎杖;產(chǎn)地加工與炮制一體化;指紋圖譜;抗氧化活性

Comparison of the fingerprints and in vitro antioxidant activity of decoction pieces of Polygonum cuspidatum by integrated processing and traditional processing

JIAN Qipan1，ZHU Yingrui2，ZHENG Yukun1，CHENG Huanbo1，TU Jiyuan1，WANG Guangzhong1（1.School of Pharmacy，Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan 430065， China;2. Dept. of Pharmacy， Hubei Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Wuhan 430021， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE To compare the differences of the fingerprint and in vitro antioxidant activity? between decoction pieces of Polygonum cuspidatum by integrated technology of habitat processing and processing （short for IPDP） and traditional processing decoction pieces （short for TPDP）. METHODS Ten batches of IPDP and ten batches of TPDP were prepared by integrated technology and traditional technology， respectively. HPLC method was used to establish and compare the fingerprints of IPDP and TPDP. The scavenging rates of DPPH free radical， ABTS free radical， superoxide free radical and hydroxyl free radical and reducing activity of Fe3+ were detected for IPDP and TPDP. In vitro antioxidant activities were compared between IPDP and TPDP. RESULTS There were 11 common peaks in the fingerprints of IPDP and TPDP， among which 17 came from IPDP and 13 came from TPDP. The peak heights of peak 6 （polydatin） and peak 15 （emodin-8-O-β-D-glucoside） in IPDP were significantly higher than those in the TPDP， and the peak heights of peak 13 （resveratrol）， peak 17 （emodin） and peak 19 （physcion） in the TPDP were significantly higher than those in the IPDP. The results of in vitro antioxidant test showed that IPDP and TPDP had a certain scavenging capacity on DPPH free radical， ABTS free radical， superoxide free radical and hydroxyl free radicals， and also had a certain reducing capacity on Fe3+. CONCLUSIONS The integrated processing technology of P. cuspidatum has a good retention effect on the glycosides in P. cuspidatum， and the in vitro antioxidant activity of IPDP is stronger than that of TPDP.

KEYWORDS? ?Polygonum cuspidatum; integrated technology of habitat processing and processing; fingerprint; antioxidant activity

虎杖為蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根和根莖，歸肝、膽、肺經(jīng)，具有清熱解毒、散瘀止痛、止咳化痰、利濕退黃的功效[1]，多用于治療血癥、濕熱黃疸、淋癥、閉經(jīng)、跌打損傷、肺熱咳嗽、毒蛇咬傷及外傷出血等[2]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，虎杖具有抗血栓、調(diào)血脂、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒以及抗腫瘤等藥理活性[3-8]。

虎杖在制成飲片時，需要經(jīng)過藥材采挖→凈制→干燥（制成藥材）→軟化→切制→再干燥（制成飲片）的加工過程，這不僅耗時較長，而且在干燥和軟化的過程中可能會造成有效成分損失和藥材霉變。為了保證中藥飲片質(zhì)量，解決藥用植物到中藥飲片生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的加工復雜、摻雜、摻假等問題，相關(guān)專家學者提出了藥材產(chǎn)地加工與炮制一體化（簡稱“一體化”）的想法[9-10]。本課題組前期調(diào)研發(fā)現(xiàn)，將虎杖進行一體化工藝處理能顯著減少加工時間，提高生產(chǎn)效率。但是，虎杖經(jīng)一體化工藝處理后是否與傳統(tǒng)工藝處理后的質(zhì)量和藥效存在差異，尚不明確?；诖?，本研究擬采用高效液相色譜（HPLC）法建立虎杖一體化飲片與傳統(tǒng)飲片的指紋圖譜，并以抗氧化活性為藥效指標進行比較，以期為虎杖飲片一體化生產(chǎn)工藝的可行性研究及其臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有1260型HPLC儀（美國Agilent公司）、ES225SM-DR型十萬分之一天平（上海精科天美科學儀器有限公司）、BS224型分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]、DTC-8J型超聲波清洗機[鼎泰（湖北）生化科技設(shè)備制造有限公司]、DFY-800C型搖擺式高速粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）、Epoch型全波長酶標儀（美國BioTek公司）

1.2 主要藥品與試劑

本課題組所采集的虎杖鮮藥材，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學藥學院劉義梅教授鑒定為蓼科植物虎杖P. cuspidatum Sieb. et Zucc.的干燥根和根莖，然后在湖北省中藥炮制工程技術(shù)研究中心中試車間按本課題組前期優(yōu)選工藝條件，將每批新鮮虎杖（具體樣品信息見表1）分別制成虎杖一體化飲片（編號Y1～Y10）和傳統(tǒng)飲片（編號C1～C10）?；⒄溶諏φ掌罚ㄅ朒-012-171216）、白藜蘆醇對照品（批號B-002-170426）、大黃素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品（批號D-018-171216）均購于成都瑞芬思生物科技有限公司，純度均大于98.0%;大黃素對照品（批號T17A10F95418）、大黃素甲醚對照品（批號T26A8F34784）均購于上海源葉生物科技有限公司，純度均大于98.0%;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，批號C11362866）、1，10-菲羅啉（無水）（批號C11526129）均購于上海麥克林生化科技有限公司;焦性沒食子酸（批號20171127）、過氧化氫、乙二胺四乙酸二鈉、三氯乙酸、氯化鐵、七水合硫酸亞鐵、L（+）-抗壞血酸均購于國藥集團化學試劑有限公司;總抗氧化能力比色法測試盒（ABTS化學法）（批號4571TBLLSB）購于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;甲醇、乙腈為色譜純，乙醇為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 虎杖飲片的制備

根據(jù)課題組前期預實驗，確定小檔虎杖（直徑≤2.5 cm）傳統(tǒng)飲片的制備工藝為：將虎杖新鮮藥材浸泡 30 min 后，于 20 ℃下潤制 24 h，切制成厚片，然后在60 ℃下干燥 4 h（使切片厚度約為3 cm），干燥期間翻動1次。大檔虎杖（直徑>2.5 cm）傳統(tǒng)飲片的制備工藝為：將虎杖新鮮藥材浸泡 30 min 后，于 20 ℃下潤制45 h，切制成厚片，然后在 60 ℃下干燥 4 h（使切片厚度約為4 cm），干燥期間翻動1次?；⒄纫惑w化飲片的制備工藝為：將虎杖新鮮藥材用18倍水（L/kg）洗滌3次后，干燥至含水量為35%～45%時進行切片，再于60 ℃下干燥7 h（藥材攤鋪厚度為3 cm），干燥期間中翻動1次。

2.2 虎杖一體化飲片與傳統(tǒng)飲片的HPLC指紋圖譜比較

2.2.1 供試品溶液的制備 參考文獻[11]方法進行制備。取虎杖一體化飲片或傳統(tǒng)飲片，粉碎，過三號篩，精密稱定0.2 g，置于錐形瓶中，精密加入60%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）提取30 min;冷卻至室溫后再次稱定質(zhì)量，并用60%乙醇補足缺失質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液的制備 分別稱取虎杖苷5 mg、大黃素3 mg、大黃素甲醚4 mg，精密稱定，分別置于5 mL量瓶;分別取白藜蘆醇4 mg、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷4 mg，精密稱定，分別置于10 mL量瓶;再以甲醇定容后制成各單一對照品溶液。精密吸取上述5種單一對照品溶液各1 mL于10 mL量瓶中，以甲醇定容后，即得到混合對照品溶液。

2.2.3 色譜條件 參考文獻[12]的色譜條件，以Agilent Extend C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）為流動相（梯度洗脫：0～14 min，10%A→20%A;14～21 min，20%A→29%A;21～45 min，29%A→35%A;45～54 min，35%A→70%A;54～70 min，70%A→84%A），檢測波長為290 nm，柱溫為40 ℃，進樣量為10 μL，流速為1.0 mL/min。

2.2.4 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液（編號Y1）10 μL，按“2.2.3”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，選取15號峰為參照峰，記錄其余共有峰的保留時間和峰面積。結(jié)果顯示，19個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液（編號Y1），于室溫放置0、2、4、6、8、12 h后，按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，選取15號峰為參照峰，記錄其余共有峰的保留時間和峰面積。結(jié)果顯示，19個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%，表明供試品溶液在室溫放置12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6 重復性試驗 取虎杖飲片粉末（編號Y1），按“2.2.1”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，選取15號峰為參照峰，記錄其余共有峰的保留時間和峰面積。結(jié)果顯示，19個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%，表明該方法重復性較好。

2.2.7 指紋圖譜比較 取“2.2.1”項下虎杖一體化飲片供試品溶液和傳統(tǒng)飲片供試品溶液適量，按“2.2.3”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。然后將兩種虎杖飲片的HPLC圖譜均導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004A版）軟件中，采用中位數(shù)法，將時間窗寬度設(shè)置為0.1 min，分別建立10批虎杖一體化飲片的疊加指紋圖譜、10批虎杖傳統(tǒng)飲片的疊加指紋圖譜以及這兩種虎杖飲片的疊加指紋圖譜（圖1、圖2、圖3）。結(jié)果顯示，兩種虎杖飲片共有19個色譜峰，11個共有峰。10批虎杖一體化飲片共有17個共有峰，10批虎杖傳統(tǒng)飲片共有13個共有峰，由此可見，虎杖兩種飲片間存在一定差異，其中一體化工藝較傳統(tǒng)工藝可更好地保留虎杖的成分。取“2.2.2”項下混合對照品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖（圖4）。將圖3與圖4進行比對，指認出6號峰為虎杖苷，13號峰為白藜蘆醇，15號峰為大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷，17號峰為大黃素，19號峰為大黃素甲醚。另外，結(jié)合虎杖一體化飲片和傳統(tǒng)飲片的鏡面對比圖譜（圖5）可知，虎杖一體化飲片中6號峰（虎杖苷）和15號峰（大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷）的峰高明顯高于傳統(tǒng)飲片，傳統(tǒng)飲片中13號峰（白藜蘆醇）、17號峰（大黃素）和19號峰（大黃素甲醚）的峰高明顯高于一體化飲片。

2.2.8 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004A版）分別對10批虎杖一體化飲片、10批虎杖傳統(tǒng)飲片的指紋圖譜進行相似度分析。結(jié)果顯示，10批虎杖一體化飲片的相似度為0.801～0.988，10批虎杖傳統(tǒng)飲片的相似度除C7號樣品（4年生虎杖）為0.699外，其余均大于0.850，說明年限不同的虎杖之間存在一定差異;20批虎杖一體化飲片和傳統(tǒng)飲片的相似度均為0.800～0.993，說明虎杖一體化飲片和傳統(tǒng)飲片的相似度較高，但存在一定差異。結(jié)果見表2～表4。

2.3 虎杖一體化飲片與傳統(tǒng)飲片的抗氧化活性比較

2.3.1 樣品溶液的制備 取虎杖一體化飲片粉末0.2 g，精密稱定，放入錐形瓶中，精密加入60%乙醇25 mL，稱質(zhì)量;超聲（功率250 W，頻率40 kHz）提取30 min，冷卻至室溫后稱定質(zhì)量，用60%乙醇補足缺失質(zhì)量，搖勻，過濾，即得樣品母液;然后取樣品母液稀釋成質(zhì)量濃度分別0.125、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL的系列樣品溶液（以生藥量計算）。同法制備虎杖傳統(tǒng)飲片和L（+）-抗壞血酸的系列濃度樣品溶液，備用。

2.3.2 DPPH自由基清除率的測定 參考文獻[13]方法，分別取虎杖一體化飲片、傳統(tǒng)飲片以及L（+）-抗壞血酸的不同質(zhì)量濃度樣品溶液200 μL、甲醇400 μL、DPPH溶液400 μL加入1.5 mL EP管中，上下顛倒混勻10次，金屬浴25 ℃條件下避光反應(yīng)20 min。另設(shè)以磷酸鹽緩沖液（pH7.4）代替藥液的空白組，同法操作。取200 μL混合反應(yīng)液置于96孔板中，采用酶標儀于515 nm處檢測吸光度值。每個樣品平行測定3次。按公式計算DPPH自由基清除率[DPPH自由基清除率=（1-A/A0）×100%，其中A為實驗組吸光度值，A0為空白組吸光度值]，再根據(jù)結(jié)果進行回歸分析，計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。結(jié)果顯示，虎杖一體化飲片、傳統(tǒng)飲片以及L（+）-抗壞血酸對DPPH自由基清除作用的IC50分別為0.42、0.61、0.15 mg/mL。結(jié)果見圖6。

2.3.3 ABTS自由基清除率的測定 參考文獻[14]方法，取虎杖一體化飲片、傳統(tǒng)飲片以及L（+）-抗壞血酸的不同質(zhì)量濃度樣品溶液適量，使用總抗氧化能力比色法測試盒（ABTS化學法）檢測其對ABTS自由基的清除能力。每個樣品平行測定3次。按公式計算ABTS自由基清除率[14]，再根據(jù)結(jié)果進行回歸分析，計算IC50。結(jié)果顯示，虎杖一體化飲片、傳統(tǒng)飲片以及L（+）-抗壞血酸對ABTS自由基清除作用的IC50分別為0.47、0.54、0.000 3 mg/mL。結(jié)果見圖7。

2.3.4 超氧自由基清除率的檢測 參考文獻[15]方法，取虎杖一體化飲片、傳統(tǒng)飲片以及L（+）-抗壞血酸的不同質(zhì)量濃度樣品溶液12 μL、磷酸鹽緩沖液（pH8.2）264? μL置于96孔板中，于25 ℃條件下孵育10 min;加入1.25 mmol/L鄰苯三酚溶液24 μL，快速振蕩搖勻，采用酶標儀于320 nm波長處每隔30 s測定1次吸光度值，連續(xù)5 min。另設(shè)以乙醇代替藥液的空白組，同法操作。每個樣品平行測定3次。按公式計算超氧自由基清除率[15]，再根據(jù)結(jié)果進行回歸分析，計算IC50。結(jié)果顯示，虎杖一體化飲片、傳統(tǒng)飲片以及L（+）-抗壞血酸對超氧自由基清除作用的IC50分別為0.99、1.52、0.35 mg/mL。結(jié)果見圖8。

2.3.5 Fe3+還原能力的檢測 參考文獻[16]方法，取虎杖一體化飲片、傳統(tǒng)飲片以及L（+）-抗壞血酸的不同質(zhì)量濃度樣品溶液1 000 μL和1%鐵氰化鉀125 μL加入1.5 mL EP管中，置于50 ℃水浴條件下反應(yīng)20 min后，再加入10%三氯乙酸溶液125 μL終止反應(yīng);以3 000 r/min離心2 min，取60 μL上清液加入96孔板中，加入0.1%氯化鐵溶液90 μL，快速振蕩搖勻，采用酶標儀于700 nm波長處檢測吸光度值。另設(shè)置以磷酸鹽緩沖液（pH6.6）代替藥液的空白組，同法操作。每個樣品平行測定3次。按公式計算其對Fe3+的還原能力[Fe3+還原能力=A1-A0，其中A1為實驗組吸光度值，A0為空白組吸光度值;所得差值越大，表明樣品的Fe3+還原能力越強]。結(jié)果顯示，虎杖一體化飲片和傳統(tǒng)飲片均對Fe3+具有一定的還原能力，且隨著樣品質(zhì)量濃度升高，其對Fe3+的還原能力越強。結(jié)果見圖9。

2.3.6 羥自由基清除率的檢測 參考文獻[17-18]方法，將4.950 mL 1，10-菲羅啉溶液、4.95 mL FeSO4溶液、4.95 mL乙二胺四乙酸溶液和3.3 mL 磷酸鹽緩沖液（pH7.4）混合，制成混合液。將混合液置于37 ℃條件下孵育15 min后，按137.5 μL/孔加入96孔板中，再向相應(yīng)孔中分別加入37.5 μL 虎杖一體化飲片、傳統(tǒng)飲片以及L（+）-抗壞血酸的不同質(zhì)量濃度樣品溶液或水，再向相應(yīng)孔加入50? ?μL 1% H2O2溶液或水;輕輕搖晃，于37 ℃條件下孵育 30 min后，采用酶標儀于536 nm波長處檢測吸光度值，每個樣品平行測定3次。按公式計算羥自由基清除率[17]，再根據(jù)結(jié)果進行回歸分析，計算IC50。結(jié)果顯示，虎杖一體化飲片、傳統(tǒng)飲片以及L（+）-抗壞血酸對羥自由基清除作用的IC50分別為0.53、0.76、0.25 mg/mL。結(jié)果見圖10。

3 討論

相關(guān)文獻報道，在一定條件下，虎杖中虎杖苷與白藜蘆醇會發(fā)生一定程度的轉(zhuǎn)化[19-22]。本文通過HPLC法建立了虎杖一體化飲片和傳統(tǒng)飲片的指紋圖譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，虎杖傳統(tǒng)飲片中13號峰（白藜蘆醇）的峰高明顯高于一體化飲片，由此可知，虎杖傳統(tǒng)炮制工藝可使虎杖苷向白藜蘆醇轉(zhuǎn)化。筆者推測其原因可能是虎杖苷發(fā)生了水解，從而使白藜蘆醇的含量升高，但具體的轉(zhuǎn)化機制還有待進一步驗證。

現(xiàn)代藥理研究表明，虎杖中的虎杖苷[23]、白藜蘆醇[24]等均具有良好的抗氧化活性，因此，本文選擇抗氧化活性作為比較虎杖一體化飲片與傳統(tǒng)飲片藥效的評價指標。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，虎杖一體化飲片和傳統(tǒng)飲片對DPPH自由基、ABTS自由基、超氧自由基和羥自由基均具有一定的清除能力，對Fe3+也具有一定的還原能力，且虎杖一體化飲片的抗氧化活性強于虎杖傳統(tǒng)飲片。

綜上所述，一體化炮制工藝較傳統(tǒng)炮制工藝可更好地保留虎杖的成分，且虎杖一體化飲片的體外抗氧化活性強于傳統(tǒng)飲片。

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（收稿日期：2021-09-14 修回日期：2021-12-31）

（編輯：唐曉蓮）

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