柴 念

（武漢市龜山風(fēng)景管理，湖北 武漢 430050）

1.研究的目的和意義

核桃（Juglans regia L）是胡桃科核桃屬落葉落果喬木，分早實核桃與晚實核桃兩大類群。早、晚實核桃是核桃分類中的兩大類群。由于晚實核桃播種結(jié)果需要10多年時間，嚴(yán)重影響了核桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。如何縮短幼年期，促進早熟是核桃研究者難以解決的問題。

自然條件下，核桃的雌花在成熟期必須經(jīng)具有活力的花粉粒傳送到雌蕊柱頭上完成授精，才能發(fā)育成果實。不同核桃品種的雌雄花花期相遇及花粉親和性，是配置授粉樹、提高核桃產(chǎn)量的重要研究內(nèi)容。通過對模式植物擬南芥的多年研究，已知MADS-box基因家族在開花時間調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起著重要作用。其中的Supperssor of overexpression of CO基因是開花途徑的整合子，在四種開花途徑中受調(diào)控（陳方芳等 2009）。研究表明，SOC是一種多功能蛋白，主要調(diào)節(jié)開花時間，但也調(diào)節(jié)花型和花分生組織發(fā)育（Liu et al., 2009; Koornneef et al.,1998; Hepworth et al., 2002）。SOC基因與許多其他基因蛋白相互作用，在植物生長發(fā)育中起著重要作用。

本研究對核桃的SOC基因進行了克隆和同源性分析，利用qRT-PCR技術(shù)分析了SOC基因在植物不同部位和不同階段的具體表達情況，為分子育種研究和高產(chǎn)栽培提供理論依據(jù)。

2.選題依據(jù)

花是植物最重要的經(jīng)濟器官。花卉的發(fā)育受到環(huán)境因素影響，本質(zhì)上其實是環(huán)境因素在影響基因調(diào)控?；ㄆ鞴傩纬芍苯佑绊懝麑嵁a(chǎn)量。從現(xiàn)有的文獻來看，對在核桃開花中起重要作用的SOC基因的研究很少。本研究將對核桃SOC基因進行功能分析，為進一步的克隆核桃開花同源基因奠定基礎(chǔ)，進一步解釋木本植物開花相關(guān)機制。

3.技術(shù)路線及擬解決問題

3.1 擬解決問題

本研究利用分子生物學(xué)的技術(shù)手段研究核桃內(nèi)開花基因的功能和作用，以期從分子水平揭示核桃早實特性的機理。

3.2 技術(shù)路線

4.核桃JrSOC基因的克隆及序列分析

4.1 試驗材料

以香玲嫁接苗葉片為供試材料，在四月中旬核桃苗發(fā)芽時，采取新鮮綠色的核桃葉片。

4.2 試驗藥品

CTAB、硼砂、醋酸、LiCL3、NaCL、水飽和酚、巰基乙醇、氨芐青霉素、氯仿、無水乙醇購于楊陵化玻站。

反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNase1試劑、T4連接酶、膠回收試劑盒均購于TaKaRa寶生物公司；DEPC處理水、DNAMarker（DL500、2000）、Loadding buffer均購自小白生物科技有限公司。

4.3 試劑的配制

4.3.1 RNA提取液。

4.3.2 LiCL3試劑。

4.3.3 NaAc試劑。三種試劑均需要高壓滅菌后方可使用。

4.3.4 TAE緩沖液。

4.3.5 瓊脂糖凝膠。

4.4 試驗儀器與設(shè)備

振蕩儀、液氮、研缽、小藥匙、移液槍與槍頭、1.5ml離心管、離心機、PCR儀、水浴鍋、高壓滅菌鍋、鑷子、電子天平、廢液缸、橡膠手套、玻璃棒、微波爐、電泳槽、制冰機等。

4.5 核桃JrSOC家族基因的序列特征

以“Supperssor of overexpression of CO”為關(guān)鍵詞在核桃轉(zhuǎn)錄組cDNA序列庫中檢索到幾個SOC基因序列，比較分析軟件不同基因的結(jié)構(gòu)特征。使用ORF查找程序確定每個基因的開放閱讀框，用以O(shè)RF基因為模板設(shè)計的PCR擴增引物進行菌液PCR，回收產(chǎn)物與T載體連接并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，出來正確條帶的目的基因序列經(jīng)菌液測序證實。

4.6 總 RNA 的反轉(zhuǎn)錄即 cDNA 的合成

使用Takara公司的試劑盒，按說明書操作，反轉(zhuǎn)錄得到核桃葉片的cDNA。

4.7 JrSOC1-1、JrSOC1-2、JrSOC3 基因的擴增

按照J(rèn)rSOC1-1、JrSOC1-2、JrSOC3 基因序列設(shè)計引物，用其進行菌液PCR。

PCR產(chǎn)物經(jīng)過電泳檢測后，對于出現(xiàn)正確條帶使用膠回收試劑盒進行膠回收。

4.8 大腸桿菌轉(zhuǎn)化及鑒定

4.8 1 PCR純化后產(chǎn)物與載體連接。

4.8.2 轉(zhuǎn)化大腸桿菌。

4.8.3 隨機選擇幾個單菌落進行菌液PCR鑒定是否為陽性。

用凝膠電泳檢測反應(yīng)產(chǎn)物，用甘油保存菌液PCR與預(yù)測長度一致的產(chǎn)物于冰箱零下二十?dāng)z氏度。送去公司測序后序列比對合格的菌液提取質(zhì)粒，保存?zhèn)溆?，為接下來的基因結(jié)構(gòu)分析做準(zhǔn)備。

5.結(jié)果與分析

在核桃轉(zhuǎn)錄組中獲得了JrSOC1-1、JrSOC1-2、JrSOC3蛋白家族基因的序列，通過多序列比對分析、BLAST、進化分析，對這些蛋白的序列特征進行了初步分析。得到以下結(jié)論：

這三個基因的序列特征是不同的。基因的全長是不同的。JrSOC1-1基因的序列長度為576bp，理論等電點為5.21，編碼蛋白的分子量為22.37kd，氨基酸數(shù)為188；JrSOC1-2基因的序列長度為626bp，理論等電點為9.10，編碼蛋白的分子量為24.02kd，氨基酸數(shù)分別為208；JrSOC3基因的序列長度為699bp，理論等電點為9.00，編碼蛋白的分子量為26.77kd，氨基酸數(shù)為232。

6.核桃JrSOC基因過量表達載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)化擬南芥

6.1 試驗內(nèi)容

核桃JrSOC基因表達載體構(gòu)建；轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌；擬南芥植株的種植。

6.2 目的基因JrSOC表達載體構(gòu)建

通過分析JrSOC1-1、JrSOC1-2、JrSOC3基因的CDS序列，選擇Sal I和Xba I為雙酶切位點，和目標(biāo)表達載體pCAMBIA2300-35SN一起進行雙酶切，回收片段用T4連接酶連接，最后成功構(gòu)建JrSOC表達載體pCAMBIA2300-JrSOC1-1、pCAMBIA2300-JrSOC1-2和pCAMBIA2300-JrSOC3。將表達載體進行雙酶切鑒定，并轉(zhuǎn)入到EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞后，分別用其特異性引物進行PCR擴增檢測。

6.3 JrSOC基因超表達載體的遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因陽性檢測

采用蘸花轉(zhuǎn)化法將已構(gòu)建完成的JrSOC超表達載體導(dǎo)入受體材料野生型擬南芥中，收獲T0代種子并繼續(xù)在含KANA的1/2 MS培養(yǎng)基上進行篩選，如圖（6-1）所示。

圖6-1 篩選后得到的T1代幼苗與野生型擬南芥

為了確定JrSOC基因是否成功導(dǎo)入擬南芥中，提取T1代擬南芥幼苗幼葉的DNA，采用特異引物進行PCR鑒定。圖（6-2）為T1代轉(zhuǎn)基因部分植株P(guān)CR檢測結(jié)果，出現(xiàn)了合適位置的清晰條帶，表明轉(zhuǎn)基因植株能檢測出大小一樣的基因片段，說明這些幼苗為JrSOC的陽性個體。

圖6-2 T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥DNA的PCR檢測鑒定

觀察統(tǒng)計T1代植株中優(yōu)良長勢的30株轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型，發(fā)現(xiàn)JrSOC基因的過表達植株從移栽入穴盤到開花經(jīng)過了10天，野生型植株從移栽入穴盤到開花經(jīng)過了14天，轉(zhuǎn)基因植株開花時間明顯早于野生型植株，猜測JrSOC基因可能會提早開花。

圖6-3 JrSOC基因過表達擬南芥T1植株表型

6.4 結(jié)論

將構(gòu)建過的表達載體pCAMBIA2300-JrSOC1-1、pCAMBIA2300-JrSOC1-2和pCAMBIA2300-JrSOC3分別轉(zhuǎn)化到野生型擬南芥中，收取T0代種子，抗生素篩選后得到抗性植株，提起抗性植株葉片的DNA經(jīng)PCR檢測，最終得到T1代擬南芥共37株。觀察統(tǒng)計T1代植株中優(yōu)良長勢的30株轉(zhuǎn)基因植株的表型，發(fā)現(xiàn)JrSOC基因的過表達植株從移栽入穴盤到開花經(jīng)過了10天，野生型植株從移栽入穴盤到開花經(jīng)過了14天，轉(zhuǎn)基因植株開花時間明顯早于野生型植株，猜測JrSOC基因可能會提早開花。

7.結(jié)論

7.1 提取“香玲”葉片總RNA，利用RT-PCR技術(shù)克隆出JrSOC1-1、JrSOC1-2、JrSOC3基因，連接載體pCambia2300、轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞、菌落PCR后進行測序。利用生物學(xué)分析軟件對JrSOC1-1、JrSOC1-2、JrSOC3基因序列進行分析，結(jié)果如下：JrSOC1-1基因的序列長度為576bp，理論等電點為5.21，編碼蛋白的分子量為22.37kd，氨基酸數(shù)為188；JrSOC1-2基因的序列長度為626bp，理論等電點為9.10，編碼蛋白的分子量為24.02kd，氨基酸數(shù)分別為208；JrSOC3基因的序列長度為699bp，理論等電點為9.00，編碼蛋白的分子量為26.77kd，氨基酸數(shù)為232。

7.2 構(gòu)建過表達載體pCAMBIA2300-JrSOC1-1、pCAMBIA2300-JrSOC1-2和pCAMBIA2300-JrSOC3，轉(zhuǎn)化野生型擬南芥觀察統(tǒng)計T1代植株中長勢較好的30株轉(zhuǎn)基因植株的表型，發(fā)現(xiàn)JrSOC基因的過表達植株開花時間明顯早于野生型，推測SOC基因與植株提早開花有關(guān)。

8.討論

通過構(gòu)建表達載體pCAMBIA2300-JrSOC1-1、pCAMBIA2300-JrSOC1-2和pCAMBIA2300-JrSOC3，導(dǎo)入受體材料野生型擬南芥后觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株開花時間明顯早于野生型植株，猜測JrSOC基因可能會提早開花，說明SOC1-1、SOC1-2和JrSOC3對于核桃的早實具有非常重要的作用?？赏茰y，將這3個基因作為今后提升核桃早實率的基因之一。