張紗紗，蔣剛，王茜，龍方懿，王婷

610041 成都，四川省腫瘤醫(yī)院·研究所，四川省癌癥防治中心，電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)部(張紗紗、蔣剛、王茜、王婷)；610031成都，四川省婦幼保健院 實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心(龍方懿)

宮頸癌是女性最常發(fā)生的腫瘤之一，是女性癌癥相關(guān)性死亡的第4大原因，2018年全球新發(fā)病例57萬，有31萬婦女死于該腫瘤[1]。人類乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)被認(rèn)為是導(dǎo)致宮頸癌的主要因素，雖然目前已有HPV疫苗用于宮頸癌的預(yù)防，但其仍然威脅著女性的生命健康且呈現(xiàn)出年輕化趨勢(shì)[2]。目前針對(duì)宮頸癌的主要治療包括基于鉑類的化療和局部放療及聯(lián)合治療。雖然近年來其他治療手段如分子靶向、免疫治療也發(fā)揮著重要作用[3]，但是宮頸癌的臨床治療仍然存在較大的挑戰(zhàn)，所以迫切需要開辟新的治療靶點(diǎn)。

環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)早在40年前被首次報(bào)道，但由于其表達(dá)量低，常被認(rèn)為是信使RNA(messenger RNA，mRNA)錯(cuò)誤剪切的產(chǎn)物，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，人們發(fā)現(xiàn)circRNA在人類腫瘤組織中表達(dá)豐富，在腦部等組織中的表達(dá)甚至高于相應(yīng)的mRNA[4-5]。不同于以往的線性RNA，circRNA是一類具有共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，具有高度的穩(wěn)定性和保守性，且在不同的疾病和疾病的不同階段表現(xiàn)出特異性。目前大量研究發(fā)現(xiàn)其可以調(diào)控腫瘤的增殖、遷移、侵襲和提高治療的敏感性[5-7]。既往有報(bào)道將GEO數(shù)據(jù)庫中發(fā)表過的宮頸癌組織和宮頸癌細(xì)胞系基因芯片聯(lián)合分析[8-9]尋找差異表達(dá)的circRNA，然而由于體外建立的細(xì)胞系因生存環(huán)境的不同可能會(huì)發(fā)生基因的丟失、漂移等，和其在體內(nèi)腫瘤組織內(nèi)的表達(dá)存在一定的差異，兩者聯(lián)合分析會(huì)導(dǎo)致最后獲得的差異表達(dá)circRNA存在偏差。本研究基于GEO數(shù)據(jù)庫中兩個(gè)宮頸癌組織芯片篩選差異表達(dá)顯著的circRNA，為宮頸癌診斷和治療尋找更多有意義的信號(hào)通路，從而希望為宮頸癌的診斷和治療提供更多策略。

1 資料與方法

1.1 資料來源

以“cervical cancer”“circRNA”為關(guān)鍵詞在GEO數(shù)據(jù)庫中檢索，排除非人類組織及宮頸癌細(xì)胞系芯片，共獲得兩個(gè)人類宮頸癌組織芯片數(shù)據(jù)GSE90737[10]和GSE102686[11]，GSE90737包含10個(gè)宮頸癌組織及10個(gè)癌旁組織，通過GPL22722 Agilent-075784 CapitalBio Human CircRNA Array V1.0芯片平臺(tái)分析；GSE102686包含5個(gè)宮頸癌組織和5個(gè)癌旁組織，通過GPL19978 Agilent-069978 Arraystar Human CircRNA Microarray V1芯片平臺(tái)分析。

1.2 差異表達(dá)circRNA的篩選

通過Strawberry perl 5.32軟件將探針矩陣轉(zhuǎn)換成circbase數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)的circRNA名稱，并將兩個(gè)芯片數(shù)據(jù)合并以便進(jìn)一步分析。通過R 4.1軟件的sva包和limma包對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行校正和歸一化，使用limma包(采用Benjamini-Hochberg方法對(duì)P值進(jìn)行校正)進(jìn)行差異表達(dá)circRNA的篩選，設(shè)定篩選條件為癌組織相對(duì)正常組織表達(dá)量變化|logFC|≥1倍(相當(dāng)于差異表達(dá)2倍)且校正后P<0.05，得到差異表達(dá)的circRNA，并利用R 4.1軟件的limma包和pheatmap包構(gòu)建差異表達(dá)circRNA的火山圖和熱圖。

1.3 差異表達(dá)circRNA結(jié)合的miRNA

分別選取5個(gè)上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)最顯著(以|logFC|排序)的circRNA，利用circinteractome預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)差異表達(dá)最顯著的circRNA結(jié)合的miRNA，將評(píng)分大于80的miRNA定義為潛在靶點(diǎn)。利用Cytoscape 3.9軟件構(gòu)建差異表達(dá)的circRNA/miRNAs相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.4 mRNA預(yù)測(cè)及功能分析

通過3個(gè)生物信息學(xué)網(wǎng)站：miRDB、TargetScan及miRTarBase，預(yù)測(cè)每個(gè)miRNA的下游mRNA，結(jié)果以3個(gè)數(shù)據(jù)庫均能預(yù)測(cè)即評(píng)分為3分的mRNA定義為靶mRNA。利用Metascape數(shù)據(jù)庫對(duì)靶mRNA進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology，GO)、京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，篩選條件為P<0.01。

1.5 靶mRNA蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)分析及關(guān)鍵mRNA篩選

將靶mRNA導(dǎo)入STRING在線工具獲得PPI網(wǎng)絡(luò)，并得到靶mRNA節(jié)點(diǎn)關(guān)系，再利用R 4.1軟件進(jìn)行整合，將獲得節(jié)點(diǎn)數(shù)最多的mRNA作為宮頸癌的關(guān)鍵mRNA。

1.6 關(guān)鍵mRNA表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系分析

利用Kaplan-Meier Plotter 在線數(shù)據(jù)庫，在 pan-cancer 里選中包含 304 例宮頸癌患者的數(shù)據(jù)庫，輸入關(guān)鍵mRNA，分析關(guān)鍵mRNA表達(dá)水平與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系。

1.7 獲得宮頸癌預(yù)后相關(guān)circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控路徑

追蹤預(yù)后相關(guān)mRNA的上游miRNA和circRNA，獲得相應(yīng)的circRNA-miRNA-mRNA 調(diào)控路徑。

2 結(jié) 果

2.1 差異表達(dá)的circRNA

通過對(duì)宮頸癌組織和正常癌旁組織的差異分析，共篩選出75個(gè)差異表達(dá)的circRNA，其中在宮頸癌組織中表達(dá)上調(diào)的有54個(gè)，表達(dá)下調(diào)的有21個(gè)?；鹕綀D和熱圖能更直接地顯示circRNA 的差異(圖1)。分別選取上調(diào)和下調(diào)組中差異表達(dá)最顯著的5個(gè)circRNA(表1)進(jìn)行后續(xù)分析。

圖1 差異表達(dá)的circRNA的篩選

表1 宮頸癌組織中差異表達(dá)上調(diào)/下調(diào)前5的circRNA

2.2 預(yù)測(cè)差異表達(dá)circRNA結(jié)合的miRNA

通過circinteractome預(yù)測(cè)網(wǎng)站獲得上述10個(gè)顯著差異表達(dá)circRNA結(jié)合的miRNA共202個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)circRNA結(jié)合的miRNA為75個(gè)、表達(dá)下調(diào)circRNA結(jié)合的miRNA為127個(gè)，利用cytoscope 3.9軟件構(gòu)建的circRNA/miRNAs的相互作用網(wǎng)絡(luò)見圖2，從圖中可以看出上調(diào)circRNA里hsa_circ_0079557、hsa_circ_0000467結(jié)合的miRNA最多，都為19個(gè)，下調(diào)circRNA里hsa_circ_0001446結(jié)合的miRNA最多，為34個(gè)，其次為hsa_circ_0008144,結(jié)合31個(gè)。

圖2 差異表達(dá)最顯著的10個(gè)circRNA及其結(jié)合的miRNA的網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 mRNA預(yù)測(cè)及功能分析

通過3個(gè)生物信息學(xué)網(wǎng)站(miRDB、TargetScan、miRTarBase)均能預(yù)測(cè)到且得分為3分的miRNA靶mRNA共935個(gè)。Metascape在線數(shù)據(jù)庫分析上述935個(gè)mRNA的GO和KEGG功能，顯示這些mRNA富集于mRNA代謝調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄分子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合物及肌肉的形成、細(xì)胞器組織調(diào)節(jié)，以及特異性蛋白質(zhì)結(jié)合、腫瘤形成調(diào)控等生物學(xué)過程(圖3)。

圖3 靶mRNA的GO和KEGG功能富集圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析及宮頸癌關(guān)鍵mRNA

將上述935個(gè)靶mRNA導(dǎo)入STRING在線工具，得到PPI網(wǎng)絡(luò)(圖4)，再通過R 4.1軟件篩選出6個(gè)關(guān)鍵mRNA(POLR2D、JUN、CTNNB1、H2AFZ、RBBP7、UBE2D1)。

圖4 預(yù)測(cè)mRNA的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 關(guān)鍵mRNA表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

將關(guān)鍵mRNA導(dǎo)入Kaplan-Meier Plotter 在線數(shù)據(jù)庫后發(fā)現(xiàn)POLR2D、JUN、CTNNB1、H2AFZ、RBBP7五個(gè)mRNA表達(dá)均與宮頸癌患者總生存率有關(guān)(P<0.05)(圖5)。

圖5 6個(gè)關(guān)鍵mRNA與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系

2.6 獲得宮頸癌預(yù)后相關(guān)circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控路徑

上述結(jié)果表明POLR2D、JUN、CTNNB1、H2AFZ、RBBP7與宮頸癌患者總生存率有關(guān)，基于宮頸癌預(yù)后相關(guān)mRNA追溯上游miRNA和circRNA，從而構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控路徑。POLR2D對(duì)應(yīng)的上游miRNA和circRNA分別是hsa-miR-421，hsa_circ_0068894，JUN對(duì)應(yīng)的上游miRNA和circRNA分別是hsa-miR-139-5p，hsa_circ_0027821，構(gòu)建獲得hsa_circ_0068894/hsa-miR-421/POLR2D，hsa_circ_0027821/hsa-miR-139-5p/JUN等circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控路徑。其余基于宮頸癌預(yù)后相關(guān)基因的circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控路徑見表2。

表2 關(guān)鍵mRNA對(duì)應(yīng)的上游miRNA和circRNA

3 討 論

近年來，基于RNA等轉(zhuǎn)錄組學(xué)探索腫瘤診斷和預(yù)防新靶點(diǎn)已成為研究熱點(diǎn)。既往發(fā)現(xiàn)基因的突變驅(qū)動(dòng)著癌癥的發(fā)生，而調(diào)控基因的上游通路是十分復(fù)雜的，miRNA和circRNA是近幾年發(fā)現(xiàn)的上游靶點(diǎn)[12]。miRNA是一類具有短核苷酸的非編碼RNA，可以參與多種細(xì)胞生物學(xué)途徑，包括細(xì)胞增殖、侵襲、分化和凋亡，并扮演致癌基因或抑癌基因的作用，所以miRNA被認(rèn)為是癌癥的重要生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)[13]。circRNA是一類具有閉環(huán)結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，具有高度穩(wěn)定性和保守性，可與RNA結(jié)合蛋白相互作用并充當(dāng)?shù)鞍字Ъ?，還可以調(diào)控基因的剪切、轉(zhuǎn)錄和翻譯，充當(dāng)自噬調(diào)節(jié)劑等[7]，除此之外，circRNA最重要的作用是可以充當(dāng)miRNA的海綿并調(diào)節(jié)miRNA參與的各種細(xì)胞途徑，circRNA可以吸附大量miRNA從而影響相關(guān)miRNA及mRNA的表達(dá)，并通過circRNA-miRNA-mRNA 通路影響多種惡性腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程[7,14]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大量的miRNA及circRNA對(duì)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展具有重要的調(diào)控作用。如miR-491-5p可通過調(diào)節(jié)人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶、丙酮酸激酶調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[15]。Juan等[16]研究表明 miR-489可調(diào)控PI3K/AKT/p53信號(hào)通路，抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖并刺激細(xì)胞凋亡，被認(rèn)為是宮頸癌治療的生物標(biāo)志物。Nahand等[17]綜述了目前發(fā)表的各種miRNA如miR-21、miR-218、miR-143、miR-886-5p等在宮頸癌發(fā)生發(fā)展、治療中的作用，證明miRNA已成為診斷、治療和檢測(cè)宮頸癌治療反應(yīng)的關(guān)鍵生物標(biāo)志物。CircRNA在宮頸癌中的研究相比miRNA較少，既往已經(jīng)報(bào)道過hsa_circ_101996在宮頸癌組織中的表達(dá)水平與TNM分期、腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，且hsa_circ_101996高表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后較差相關(guān)。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明hsa_circ_101996高表達(dá)的細(xì)胞miR-8075表達(dá)下調(diào)，而miR-8075的下游mRNA TPX2上調(diào)，從而介導(dǎo)了宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[18]。此外，hsa_circ_0075341表達(dá)上調(diào)可調(diào)節(jié)miR-149-5p/AURKA軸促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲[19]。靶向hsa_circ_0000263/miR-150-5p/MDM4/p53調(diào)控網(wǎng)絡(luò)也可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移[20]。這些研究表明異常表達(dá)的circRNA可通過circRNA-miRNA-mRNA通路調(diào)控宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，但目前對(duì)宮頸癌circRNA及其通路的認(rèn)識(shí)仍不夠充分。

本研究通過GEO數(shù)據(jù)庫挖掘的兩個(gè)circRNA芯片數(shù)據(jù)，獲得在宮頸癌組織中75個(gè)差異表達(dá)的circRNA，包括54個(gè)上調(diào)circRNA和21個(gè)下調(diào)circRNA，分別選取上、下調(diào)最顯著的5個(gè)circRNA并進(jìn)一步通過預(yù)測(cè)網(wǎng)站獲得202個(gè)下游miRNA和953個(gè)靶mRNA，再篩選出了蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)數(shù)目最多的6個(gè)關(guān)鍵mRNA，并通過Kaplan-Meier Plotter在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)了關(guān)鍵mRNA和患者總生存率之間的關(guān)系，然后利用5個(gè)預(yù)后相關(guān)mRNA追蹤上游miRNA和circRNA，從而確定了8條circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控路徑。同時(shí)，在下調(diào)的circRNA中，hsa_circ_0001446吸附的miRNA最多，可以推測(cè)hsa_circ_0001446具有較強(qiáng)的吸附力，預(yù)示著其可能是一個(gè)重要的調(diào)控因子。此外，根據(jù)8條circRNA-miRNA-mRNA路徑發(fā)現(xiàn),hsa_circ_0027821可以調(diào)節(jié)JUN,CTNNB1,H2AFZ三個(gè)宮頸癌預(yù)后相關(guān)mRNA的表達(dá)，表明其可能與宮頸癌預(yù)后相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0027821的下游miRNA hsa-miR-139-5p可以通過靶向T細(xì)胞因子來抑制Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)，是宮頸癌發(fā)病機(jī)制中至關(guān)重要的腫瘤抑制因子[21]。而在宮頸癌組織中表達(dá)上調(diào)最顯著的hsa_circ_0084927還可以通過充當(dāng)hsa-miR-634的海綿調(diào)節(jié)mRNA TPD52的表達(dá)，所以靶向hsa_circ_0084927/hsa-miR-634/TPD52調(diào)控通路也可能是診斷和治療宮頸癌的潛在通路[22]。而circRNA下游預(yù)后相關(guān)mRNA CTNNB1被報(bào)道可以被其他癌癥相關(guān)基因結(jié)合和激活來上調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性，從而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖和腫瘤形成[23]。這些發(fā)現(xiàn)表明circRNA及其下游miRNA和mRNA可以通過影響Wnt/β-catenin通路及細(xì)胞因子等影響宮頸癌的發(fā)生及預(yù)后。此外，circRNA調(diào)控下游mRNA功能富集分析表明，circRNA可以通過調(diào)節(jié)mRNA代謝及結(jié)合轉(zhuǎn)錄分子和特異性蛋白質(zhì)等過程影響宮頸癌的發(fā)生和預(yù)后。所以circRNA影響宮頸癌的發(fā)生和預(yù)后是多因素、多途徑的，認(rèn)識(shí)更多的circRNA及其調(diào)控通路對(duì)宮頸癌的診斷和治療及其重要。

綜上，通過GEO數(shù)據(jù)庫兩個(gè)宮頸癌組織芯片分析獲得hsa_circ_0068894、hsa_circ_0027821、hsa_circ_0079557、hsa_circ_0008144等在宮頸癌組織中差異表達(dá)顯著，并預(yù)測(cè)得到了8條circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控通路。該研究通過生物信息學(xué)方法挖掘到了更多的circRNA及其調(diào)控通路，加深了目前對(duì)宮頸癌circRNA及其調(diào)控通路的認(rèn)識(shí)，有助于找到治療宮頸癌的新方法。盡管一部分circRNA的調(diào)控通路已經(jīng)闡明，但是大部分circRNA的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，期待研究結(jié)果有助于發(fā)現(xiàn)宮頸癌臨床診斷和治療的新靶點(diǎn)，為宮頸癌患者提供更多診斷和治療策略。

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