張士妍，劉曉瑜，沈 倩

（無錫市藥品安全檢驗檢測中心，江蘇 214028）

心榮顆粒是由黃芪、地黃、麥冬、五味子、赤芍及桂枝共6 味傳統(tǒng)中藥材經(jīng)過提取、濃縮成一定密度的清膏后，與蔗糖、糊精等輔料制備而成的中藥顆粒劑，因其具有助陽、益氣、養(yǎng)陰等功效，被廣泛用于心陽不振、氣陰兩虛型冠心病。黃芪作為該方君藥，具有補氣升陽，益腎活血等功效［1-3］。黃芪甲苷作為黃芪的主要活性成分，具有強心降壓、抗心肌細(xì)胞缺氧缺血、改善新生血管、增強機體免疫功能等功效，心榮顆?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3-015（Z-015）-2005（Z），該標(biāo)準(zhǔn)未對黃芪甲苷含量進行控制，對藥品質(zhì)量體現(xiàn)不足。因此建立一種快速準(zhǔn)確測定心榮顆粒中黃芪甲苷含量的方法，對心榮顆粒產(chǎn)品質(zhì)量控制有重要意義［4-6］。

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器與設(shè)備 Agilent1260 高效液相色譜系統(tǒng)（Agilent Technologies Inc.）；蒸發(fā)光散射檢測器（Agilent Technologies Inc.）；XPE56 電 子 天 平（METTLER TOLEDO）；XSE205 電子天平（METTLER TOLEDO）；Elmasonic 超聲儀（Elma）；Millipore 超純水機（美國Millipore 公司）。

1.2 主要試藥 黃芪甲苷對照品（純度96.9%，批號110781-201717，中國食品藥品檢定研究院）；心榮顆粒（安徽某制藥有限公司，批號分別為200502、200602、200702，規(guī)格：10 g/袋）；心榮顆粒陰性對照（自制，缺黃芪）。乙腈（色譜純，Merck），試驗用水為超純水（自制），甲醇、正丁醇等其他試劑均為分析純（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Waters X-Bridge BEH Shield RP18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（32∶68）；流速：1.0 ml/min；進樣量：20 μl；蒸發(fā)光散射檢測器，設(shè)置漂移管溫度:70 ℃，載氣流速:2.0 L/min。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取15.294 mg 黃芪甲苷對照品，放置于20 ml 棕色量瓶中，緩慢加入10 ml甲醇輕輕振搖使其溶解，并且用甲醇定容至刻度，振搖至均勻，制得濃度為0.741 0 mg/ml 的黃芪甲苷對照品儲備液。精密量取黃芪甲苷對照品儲備液適量，稀釋成濃度為0.370 5 mg/ml 的對照品溶液，即得到對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取10 袋供試品，將內(nèi)容物混合均勻，然后研磨成粉末狀，精密稱取9.887 9 g，放置于100 ml 的具塞錐形瓶中，緩慢加入甲醇40 ml，蓋緊瓶塞，輕輕振搖錐形瓶，使內(nèi)容物完全被甲醇浸潤，超聲處理 30 min（200 W，40 kHz），待溶液冷卻到室溫后再濾過，將所得濾液用水浴緩緩加熱濃縮至稠膏狀，加溫水10 ml，邊加熱邊輕輕攪拌使浸膏溶解，使用正丁醇（水飽和）振搖提取，每次40 ml，共3 次；將提取液全部合并，用新制的氨試液充分洗滌4 次以去除酸性及弱酸性雜質(zhì)，每次40 ml，將氨液全部棄去。在沸水浴上將洗滌后的正丁醇液蒸發(fā)近干，用適量的甲醇把殘渣充分溶解，并且轉(zhuǎn)移到5 ml 量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖至均勻，使用0.45 μm 濾膜進行過濾，取續(xù)濾液即為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 除黃芪外，取處方中的其余5 種中藥材，制備陰性顆粒劑，按“2.2.2”項的方法制備成無黃芪的陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗 依照“2.1”項下色譜條件，分別精密量取對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各20 μl，依次進行色譜分析測定。結(jié)果顯示黃芪甲苷峰形良好，主成分峰與雜質(zhì)峰分離良好，供試品中雜質(zhì)不干擾樣品測定，在黃芪甲苷相應(yīng)的保留時間處陰性樣品溶液無色譜峰出現(xiàn)，表示無陰性干擾，見圖1。

圖1 對照品（A）供試品（B）陰性對照（C）HPLC 色譜圖

2.4 線性范圍試驗 精密量取“2.2.1”項下黃芪甲苷對照品儲備液適量，配制成濃度分別為0.370 5、0.185 2、0.092 6 和0.046 3 mg/ml 的溶液，將上述溶液與原濃度對照品儲備液各精密量取20 μl，分別注入液相色譜儀，依照“2.1”項下色譜條件進行測定分析，記錄黃芪甲苷峰面積，以對照品溶液濃度的對數(shù)（lgC）為橫坐標(biāo)，黃芪甲苷峰面積的對數(shù)（lgA）為縱坐標(biāo)，進行線性回歸分析，得到線性回歸方程為：lgA=1.897lgC+3.850（r=0.999）。試驗結(jié)果表明，在 0.046 3～0.741 0 mg/ml 范圍內(nèi)，黃芪甲苷濃度與峰面積取對數(shù)后呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗 依照“2.1”項下應(yīng)用的色譜條件，精密量取黃芪甲苷對照品溶液（0.370 5 mg/ml）20 μl，進行色譜分析測定，重復(fù)進樣6 次，記錄色譜圖。黃芪甲苷峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.56%。試驗結(jié)果表明，儀器精密度良好，能滿足試驗要求。

2.6 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批號樣品6 份（批號為200702），依照“2.2.2”項下的試驗方法平行制備供試品溶液，依照“2.1”項下應(yīng)用的色譜條件進行測定分析，記錄主成分峰峰面積，分析檢測重復(fù)性。根據(jù)“2.4”項下所得標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算黃芪甲苷含量。結(jié)果表明，平均含量為 0.154 9 mg/g，RSD 為 1.08%，本試驗方法測定黃芪甲苷的含量重復(fù)性較好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取本品內(nèi)容物一份，精密稱定，依照“2.2.2”項下的試驗方法制備供試品溶液，依照“2.1”項下應(yīng)用的色譜條件，于 0、2、4、6、8 和 12 h 分別進行測定分析，記錄主成分峰峰面積，分析黃芪甲苷穩(wěn)定性。結(jié)果表明，黃芪甲苷在12 h 內(nèi)峰面積RSD為0.39%，穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取6 份供試品（已知含量），分別加入濃度為0.741 0 mg/ml 的黃芪甲苷對照品儲備液2 ml，依照“2.2.2”項下的試驗方法制成供試品溶液，依照“2.1”項下應(yīng)用的色譜條件進行分析測定，計算回收率。結(jié)果表明，平均回收率為97.60%，RSD 為1.04%（n=6）。該試驗方法準(zhǔn)確可靠，可用于心榮顆粒中黃芪甲苷的含量測定。見表1。

表1 黃芪甲苷回收率試驗結(jié)果（n=6）

2.9 樣品含量測定 取3 批樣品，依照“2.2.2”項下的試驗方法制成供試品溶液，依照“2.1”項下應(yīng)用的色譜條件進行分析測定，記錄主成分峰峰面積，并計算黃芪甲苷含量。批號為200502、200602、200702 的心榮顆粒，黃芪甲苷檢測結(jié)果分別為1.542 5、1.520 3和1.502 5 mg/袋。見表2。

表2 心榮顆粒樣品中黃芪甲苷的含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 測定黃芪甲苷方法的選擇 近年來，對黃芪甲苷含量主要通過TLCS 法、HPLC-UV 法或HPLCELSD 法［7］進行測定。TLCS 法易受薄層板條件等多種外界因素影響、且操作步驟繁雜、重現(xiàn)性差。因黃芪甲苷最大紫外吸收波長僅在200 nm 附近，不適用于HPLC-UV 法準(zhǔn)確測定黃芪甲苷含量［8］。而 HPLC-ELSD法準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，常應(yīng)用于如人參皂苷、黃芪甲苷等紫外吸收較弱的天然皂苷類活性物質(zhì)。結(jié)合查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料［9-12］，本文采用 HPLC-ELSD 法測定心榮顆粒中黃芪甲苷含量，可為心榮顆粒中黃芪甲苷的測定提供可靠參考。

3.2 提取方式及時間的選擇 前期試驗顯示，將供試品進行加熱回流提取3 h 與超聲提取30 min 黃芪甲苷含量無明顯區(qū)別，超聲提取相比于加熱回流提取，時間短，效率高、節(jié)能環(huán)保，還對超聲處理時間進行了考查，超聲提取30、45 與60 min 效果相當(dāng)，所以確定超聲處理30 min 為供試品溶液的處理方法。

3.3 純化方式的選擇 預(yù)試驗比較了將供試品在正丁醇液蒸干后，殘渣加水溶解并通過大孔吸附樹脂柱進行凈化，洗脫液蒸干，殘渣用甲醇溶解定容后再進樣與正丁醇液殘渣直接用甲醇溶解定容后進樣的效果，結(jié)果表明，本檢測方法省去大孔吸附樹脂凈化步驟，黃芪甲苷峰的分離度及檢測仍可滿足要求。

3.4 流動相的選擇 HPLC-ELSD 法所采用流動相一般為乙腈-水或者甲醇-水系統(tǒng)。預(yù)試驗中，本文分別采用不同配比的乙腈-水系統(tǒng)和甲醇-水系統(tǒng)作為流動相，進行多次篩選，經(jīng)考查比較，乙腈-水（32∶68）為流動相，流速為1.0 ml/min 時，供試品溶液中黃芪甲苷出峰時間適中、峰形理想、與相鄰雜質(zhì)峰分離度良好，專屬性好。

3.5 載氣流速和漂移管溫度的選擇 采用ELSD 檢測器時，檢測結(jié)果會受到載氣流速和漂移管溫度的影響，不同的流速將會影響峰面積和保留時間；不同的漂移管溫度將會影響基線的穩(wěn)定性［13-14］。文獻(xiàn)中多采用較高的載氣流速與漂移管溫度進行黃芪甲苷的測定［15-16］。經(jīng)過多次優(yōu)化，確定載氣流速為2.0 L/min，漂移管溫度為70 ℃時峰形良好無干擾，為最佳色譜條件。

黃芪甲苷為心榮顆粒的有效成分，但目前未見有關(guān)心榮顆粒中黃芪甲苷的有效測定方法的報道。試驗證明，本研究采用HPLC-ELSD 法測定心榮顆粒中黃芪甲苷的含量，黃芪甲苷可與其他成分有效分離，測定結(jié)果重復(fù)性好，測定方法簡單，高效，節(jié)能環(huán)保，可作為評價該藥品中黃芪質(zhì)量的有效方法。