段麗杰，王立新

（天津市第二人民醫(yī)院，天津 300192）

我國是“乙肝大國”，實施乙型肝炎免疫預(yù)防策略近30 年，一般人群乙肝病毒表面抗原攜帶率仍高達7.18%［1-2］。慢性乙型肝炎人群由于反復(fù)的炎癥損傷及修復(fù)，極易出現(xiàn)肝臟纖維化，逐漸發(fā)展為肝硬化、肝癌，嚴重影響生活質(zhì)量，甚至危及生命。肝纖維化作為慢性乙肝病毒感染疾病進程的中間環(huán)節(jié)，是臨床有效改善防控疾病進展、延長壽命、降低經(jīng)濟負擔的重要靶點。本實驗運用CCl4所致肝纖維化模型作為研究對象，采用甘草酸二銨作為受試藥物，求證該藥在調(diào)控氧化應(yīng)激損傷、延緩肝纖維化疾病發(fā)展進程中的作用。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 成年雄性C57BL/6 小鼠50 只，體重（20±2）g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供［SYXK（京）2019-0022］，小鼠飼養(yǎng)于SPF 級清潔環(huán)境中，自由進食。

1.2 實驗藥品 甘草酸二銨膠囊（正大天晴集團藥業(yè)股份有限公司，批號210317110）；水飛薊賓（上海源葉生物科技有限公司，批號R10F11Y108464）；CCl4（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司，批號20190828）；橄欖油（山東魯花集團有限公司，批號20190507）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT，批號20191031）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST，批號20191028）、白蛋白（ALB，批號 20191020）、總蛋白（TP，批號20190803）均來源于南京建成生物工程研究所有限公司；α 平滑肌動蛋白［α-SMA，abcam（上海）貿(mào)易有限公司，批號ab7817］；總RNA提取試劑盒（#DP419，批號 #DP419）、cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（#KR116-02，批號 #R6906）、SYBR 擴增試劑盒 （#P205-02，批號#S7516），均來源于天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 實驗儀器 高性能通用臺式冷凍離心機（Thermo Scientific，型號：Thermo Sorvall ST16R）；多功能酶標儀（Thermo Fisher Scientific，型號：Multiskan FC）；光學(xué)顯微鏡（Nikon，型號：ECLIPSE TS100）；熒光定量PCR 儀（Bio-RAD，型號：iQTM5）。

2 實驗方法

2.1 肝纖維化小鼠模型的建立 通過腹腔注射CCl4建立肝纖維化小鼠模型。選取雄性C57BL/6 小鼠，體重（20±2）g，將CCl4溶于橄欖油中制備20%的CCl4橄欖油溶液，每只小鼠腹腔注射20%的CCl4橄欖油溶液2 ml/kg，2 次/周，連續(xù)注射 6 周（每周一、周四注射）。

2.2 實驗分組及給藥方案 選取雄性C57BL/6 小鼠50 只，體重（20±2）g，隨機分成 5 組，每組 10 只，具體分組方案如下：正常組：腹腔注射橄欖油0.2 ml，2 次/周，連續(xù)注射6 周；模型組：腹腔注射CCl4建立肝纖維化模型，造模2 周后，灌胃生理鹽水0.2 ml/d，連續(xù)灌胃4 周；陽性藥組：腹腔注射CCl4建立肝纖維化模型，造模2 周后，灌胃100 mg（/kg·d）水飛薊賓，連續(xù)灌胃4周；甘草酸二銨低劑量組：腹腔注射CCl4建立肝纖維化模型，造模2 周后，灌胃甘草酸二銨68 mg（/kg·d），連續(xù)灌胃4周；甘草酸二銨高劑量組：腹腔注射CCl4建立肝纖維化模型，造模2 周后，灌胃甘草酸二銨136 mg（/kg·d），連續(xù)灌胃4 周。

2.3 指標觀察 造模及給藥結(jié)束后檢測各組小鼠體重，稱取肝臟重量，計算肝指數(shù)。肝指數(shù)公式為：肝指數(shù)（%）=肝臟重量（g）/體重（g）×100%。

2.4 血清肝功能指標檢測 造模給藥后，小鼠目內(nèi)眥取血，常溫靜置 30 min，于 4 ℃、3 500 r/min 離心，取上清液，-80 ℃保存待測。使用生化試劑盒測定各組小鼠血清中血清ALT、AST、ALB 及 TP 的含量。

2.5 病理學(xué)觀察 造模給藥后收集各組小鼠肝臟組織，用福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，制成3 μm 切片，常規(guī)HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肝組織病理學(xué)改變，同時對肝臟進行masson 及天狼星紅染色，觀察各組小鼠肝臟纖維化程度，masson 染色結(jié)果：膠原纖維呈藍色，細胞核呈藍黑色；天狼星紅染色結(jié)果：膠原纖維呈紅色，細胞核呈綠色。在200×視野下隨機選取3 個視野，運用Image Pro Plus 6.0 對纖維染色陽性區(qū)域進行量化，檢測積分光密度（IOD），計算陽性表達區(qū)域。

2.6 免疫組化檢測 將肝組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)，封閉，α-SMA（0.034 μg/ml）4 ℃ 孵育過夜，滴加二抗，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染。顯微鏡下拍照，運用Image Pro Plus 6.0 對纖維染色陽性區(qū)域進行量化，檢測積分光密度（IOD），計算陽性表達區(qū)域。

2.7 肝組織勻漿抗氧化指標檢測 稱取0.1 g 凍存的肝組織，置于900 μl 生理鹽水中，渦旋30 s，之后3 000 r/min 離心15 min 制備10%的肝組織勻漿。按試劑盒說明書分別測定SOD、MDA 和GSH-Px 抗氧化指標水平。

2.8 熒光定量PCR 檢測 造模給藥結(jié)束后，提取各組小鼠肝組織中總RNA，利用轉(zhuǎn)錄酶將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA 為模板進行PCR 擴增，檢測各組小鼠肝組織中抗氧化相關(guān)基因SOD、MDA、GSH-Px表達以β-actin 為內(nèi)參，運用2-△△CT方法計算基因相對表達量。具體引物序列見表1。

表1 引物序列

2.9 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗結(jié)果采用SPSS Statistics 20.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以表示，采用t 檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 體重和肝指數(shù)水平比較 造模給藥后，與正常組比較，模型組小鼠體重顯著降低（P＜0.01），肝指數(shù)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組（P＜0.05）、甘草酸二銨低劑量組（P＜0.05）和甘草酸二銨高劑量組（P＜0.01）小鼠體重顯著上升，肝指數(shù)顯著下降（P＜0.01）。見表 2。

表2 造模給藥后各組小鼠體重及肝指數(shù)水平比較

3.2 血清肝功能指標比較 造模給藥后，與正常組比較，模型組小鼠血清中ALT 和AST 水平顯著升高（P＜0.01），ALB 和 TP 水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組、甘草酸二銨低劑量組和甘草酸二銨高劑量組血清ALT 及AST 水平顯著降低（P＜0.01），ALB 及 TP 水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。見表 3。

表3 造模給藥后各組小鼠血清ALT、AST、ALB 及TP 水平比較

3.3 HE 染色結(jié)果 肝組織HE 染色結(jié)果表明，模型組小鼠肝細胞排列散亂，肝細胞出現(xiàn)明顯的肝細胞氣球樣變，同時可觀察到明顯的炎細胞浸潤，甘草酸二銨組小鼠肝細胞排列較模型組更為整齊，肝細胞氣球樣變及肝組織中炎細胞浸潤均有所緩解。見圖1。

圖1 各組小鼠肝組織HE 染色（200×）

3.4 Masson 和天狼星紅染色結(jié)果 masson 及天狼星紅染色結(jié)果表明，模型組小鼠肝組織纖維含量顯著增加（P＜0.01），甘草酸二銨干預(yù)可顯著減少肝纖維化模型小鼠肝組織中纖維沉積（P＜0.01）。見圖2-5。

圖2 各組小鼠肝組織massson 染色（200×）

圖3 各組小鼠肝組織天狼星紅染色（200×）

圖4 各組小鼠肝組織massson 染色陽性表達區(qū)域（n=10）

3.5 免疫組化染色結(jié)果 免疫組化染色表明，正常組小鼠肝組織中僅見少量α-SMA 表達。與正常組比較，模型組肝組織中可見大量α-SMA 陽性區(qū)域（P＜0.01），呈棕褐色，主要集中在匯管區(qū)、中央靜脈、假小葉纖維膈及臨近的肝竇區(qū)周圍；與模型組比較，陽性藥組、甘草酸二銨低劑量組和甘草酸二銨高劑量組陽性表達呈不同程度的降低（P＜0.01）。見圖6和圖7。

圖5 各組小鼠肝組織天狼星紅染色陽性表達區(qū)域（n=10）

圖6 各組小鼠肝組織α-SMA 染色（200×）

圖7 各組小鼠肝組織α-SMA 染色陽性表達區(qū)域（n=10）

3.6 肝組織勻漿抗氧化指標水平比較 與正常組比較，模型組 SOD 和 GSH-P 活性明顯降低（P＜0.01），MDA 水平明顯上升（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組、甘草酸二銨低劑量和甘草酸二銨高劑量組SOD和 GSH-P 活性顯著升高（P＜0.01），MDA 水平明顯降低（P＜0.01）。見表 4。

表4 造模給藥后各組小鼠肝組織勻漿SOD、MDA 及GSH-Px 水平比較

3.7 甘草酸二銨對肝纖維化模型小鼠肝組織抗氧化水平的影響 qPCR 結(jié)果表明，與正常組比較，模型組小鼠肝組織中 Nrf2、HO-1、GCLC、NQO1 mRNA 表達顯著下降（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組、甘草酸二銨低劑量和甘草酸二銨高劑量組Nrf2、HO-1、GCLC、NQO1 mRNA 明顯上升（P＜0.05，P＜0.01）。見圖 8。

圖8 各組小鼠肝組織Nrf2、HO-1、GCLC、NQO1 mRNA 表達水平（n=6）

4 討論

肝纖維化是一種慢性疾病，可由肝毒性、生物因素（肝炎病毒、細菌、寄生蟲等）、化學(xué)因素（藥物、工業(yè)毒物、酒精等）和環(huán)境因素［3］引起。長期的肝纖維化可導(dǎo)致肝硬化、肝細胞癌和肝衰竭［4］。因此，改善慢性肝纖維化對于預(yù)防肝硬化和肝功能衰竭的發(fā)生至關(guān)重要。甘草酸二銨是中藥甘草有效成分的第三代提取物，具有較強的抗炎、保護肝細胞膜及改善肝功能的作用。本實驗旨在探討甘草酸二銨對肝纖維化治療的作用機制，判斷其是否與調(diào)控氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，并為其臨床用藥提供藥理學(xué)基礎(chǔ)。

研究表明，多種因素可以導(dǎo)致肝臟發(fā)生纖維化,其中肝內(nèi)氧化應(yīng)激損傷是重要的機制之一［5］, 參與到了肝臟內(nèi)膠原成分的沉積, 因此，研究降低氧化應(yīng)激水平的治療方案, 是治療肝纖維化的研究熱點之一。Nrf2 通路是氧化應(yīng)激的重要通路，有文獻報道，Nrf2的異常表達可能與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［6］。Nrf2 入核后可誘導(dǎo)下游 HO-1、NQO1、GCLC 等基因表達［6-7］，提高組織抗氧化能力進而起到保護的作用［8-10］，因此提高 Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC 等基因的表達是緩解氧化應(yīng)激損傷的重要方案之一。本研究采用甘草酸二銨對CCl4所致肝纖維化模型進行了降低氧化應(yīng)激水平作用機制的探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該藥明顯改善模型動物肝臟纖維化水平和肝臟組織中氧化應(yīng)激相關(guān)因子 Nrf2、HO-1、GCLC、NQO1 的表達，進一步詮釋甘草酸二銨在治療肝纖維化的作用機制，為甘草酸二銨通過緩解氧化應(yīng)激損傷作用的治療機制提供了基礎(chǔ)研究的數(shù)據(jù)。