欒艷超 韓青松 劉佳坤 馬靜

肺癌作為危害人類健康最常見的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率呈快速上升的趨勢，肺癌是目前全球患病率和死亡率均排第1位的肺部惡性腫瘤性疾病，值得注意的是，我國已經(jīng)成為全球肺癌發(fā)病率最高的地區(qū)[1]。肺腺癌是最常見的肺癌亞型，也是非吸煙肺癌患者中最常見的肺癌組織學(xué)類型[2]。預(yù)計(jì)2018年全球?qū)⒂行掳l(fā)肺癌病例210萬，新發(fā)死亡病例180萬，死亡人數(shù)占癌癥總體死亡人數(shù)的18.4%[3]。盡管近些年來由于靶向治療等新的治療方式的飛速發(fā)展使得肺癌的治療取得重大進(jìn)展，但是由于約70%的患者在診斷為肺癌時(shí)就已經(jīng)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或?yàn)榫植客砥赱4]。因此，繼續(xù)深入研究新的肺癌治療靶標(biāo)和預(yù)后生物標(biāo)志物顯得尤為迫切。CHD5基因(染色質(zhì)解旋酶DNA結(jié)合蛋白5) 定位于人染色體1p36(1號染色體短臂3區(qū)6帶)上，最新的研究表明，在惡性腫瘤細(xì)胞調(diào)控中的抑癌基因作用已引起廣泛關(guān)注[5]。Bagchi等[6]對小鼠模型的研究證實(shí)CHD5基因通過p19Ar/p53通路發(fā)揮作用，具有調(diào)控細(xì)胞過度增殖、分化障礙或凋亡抑制，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。動物實(shí)驗(yàn)也表明多種腫瘤組織基因組1p36片段常伴有缺失[7,8]，且越來越多的研究表明，CHD5因在腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，從而加速腫瘤進(jìn)展[9,10]。而隨后的功能性研究也提示CHD5是位于1p36的基因片段內(nèi)的一個(gè)強(qiáng)有力的腫瘤抑制因子，且在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)；然而，有關(guān)CHD5與肺腺癌關(guān)系的研究還少有報(bào)道。基于以上研究背景，本研究旨在通過檢測LUAD組織中CHD5表達(dá)情況，并結(jié)合患者臨床病理特征和預(yù)后資料分析其與預(yù)后的關(guān)系，以期為尋找肺腺癌臨床生物靶點(diǎn)的開發(fā)提供理論依據(jù)，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年1月至2014年12月在我科進(jìn)行手術(shù)切除的肺腺癌患者組織標(biāo)本130例。選取標(biāo)準(zhǔn)：所有入組患者為術(shù)前未接受抗腫瘤治療的初診患者，且均排除既往惡性腫瘤病史。所有患者隨訪截止時(shí)間2019年12月，且均已經(jīng)簽署知情同意書，并通過我院倫理委員會審核、批準(zhǔn)。130例納入研究的患者中，男63例，女67例；年齡45～81歲，平均年齡(60.4±9.2)歲；其中≥60歲74例，<60歲56例；腫瘤直徑<3 cm 70例，≥3 cm 60例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移69例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移61例；存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移9例，不存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移121例；未接受術(shù)后治療54例；而接收術(shù)后治療76例(其中接受單純化療46例，接收單純放療5例，接收單純靶向治療10例；同時(shí)接受放化療10例，同時(shí)接受放化療和靶向治療2例，同時(shí)接受化療和靶向治療2例，同時(shí)接受放療和靶向治療1例)。

1.2 試劑 Trizol試劑購自USA Invitrogen，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor),實(shí)時(shí)定量PCR( qPCR) 試劑盒上海Promega公司，AGAP2-AS1購自美國CST公司,內(nèi)參GAPDH 引物購自上海生工生物工程有限公司。

1.3 總RNA提取和qPCR 向100 mg 組織中加入1 ml TRIzol，離心后用氯仿異丙醇提取RNA，DEPC 水重懸后經(jīng)3∶1苯酚/氯仿萃取和乙醇純化，取1 μg 總RNA 采用High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor 合成cDNA，使用SYBR Premix ExTaq 試劑盒內(nèi)試劑按操作說明進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測CHD5的表達(dá)量，并以GAPDH為內(nèi)參基因，通過2-△△Ct法計(jì)算倍數(shù)變化。實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用的CHD5上游引物為：5’-F-GCCCGTGAGCCTTCCTAAG-3’，下游引物為：5’-GGGGAGTAGTCACTGCCTTC-3’。GAPDH的上游為：5’-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3’，下游引物為5’-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3’。并通過Cutoff Finder[11]篩選出CHD5表達(dá)水平的最佳分界值,該程序可基于對數(shù)秩檢驗(yàn)(Log-rank test)計(jì)算最佳分界值。

1.4 隨訪 通過常規(guī)門診復(fù)查、電話回訪等形式隨訪，隨訪截止時(shí)間為2019年12月。隨訪內(nèi)容及記錄情況包括：病情、病史詢問、?？撇轶w、腫瘤標(biāo)志物檢驗(yàn)、胸部CT檢查等?；颊咝g(shù)后的治療方案、復(fù)發(fā)及死亡等。

2 結(jié)果

2.1 CHD5在LUAD組織中的表達(dá)情況 qRT-qPCR結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，130例LUAD組織中CHD5表達(dá)水平顯著降低 (P<0.001)。見表1。

表1 LUAD與癌旁組織CHD5表達(dá)情況

2.2 CHD5表達(dá)與LUAD患者的臨床病理特征關(guān)系 以130例癌組織中CHD5表達(dá)的中位數(shù)作為分界點(diǎn)，將患者分為高表達(dá)組65例和低表達(dá)組65例，兩組相比存在顯著差異(P<0.01)。進(jìn)一步分析CHD5表達(dá)與LUAD臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示CHD5表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和術(shù)后治療顯著相關(guān)(P<0.05)，與年齡、性別、吸煙和腫瘤直徑無關(guān)。見表2、3。

表2 LUAD組織中CHD5高表達(dá)組與低表達(dá)組表達(dá)情況

表3 130例LUAD組織中CHD5的表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系 例

2.3 CHD5的表達(dá)水平與LUAD患者預(yù)后的關(guān)系 至隨訪截止日期，生存分析結(jié)果顯示， CHD5高表達(dá)患者的中位DFS為49.8個(gè)月，長于65例低表達(dá)患者的30.9個(gè)月(P<0.01)，其中臨床分期(Ⅲ～Ⅳ期)、腫瘤直徑(≥3 cm)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、未術(shù)后治療的患者預(yù)后較差(P<0.01)。見表4。

表4 130例LUAD患者的DFS情況

2.4 LUAD患者DFS的單因素和多因素分析 單因素生存分析結(jié)果顯示，臨床分期、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、術(shù)后治療和CHD5表達(dá)水平與LUAD患者的DFS有關(guān)(P<0. 01)；進(jìn)一步將上述因素納入多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，結(jié)果顯示，術(shù)后治療(HR=0.290，95%CI：0.129～0.652)和CHD5表達(dá)水平(HR=0.181，95%CI：0.073～0.447)為影響DFS的獨(dú)立因素(P<0. 01)。見表5，圖1、2。

表5 LUAD患者DFS的單因素和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析

圖1 肺腺癌患者總生存的單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析

3 討論

最新的研究發(fā)現(xiàn)，肺癌已發(fā)展成為全球發(fā)病和死亡率最高的惡性腫瘤之一，因其局部侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及耐藥等原因，每年因肺癌死亡的患者約占所有癌癥死亡患者總數(shù)的1/5，居癌癥之首[12]。肺癌相關(guān)基因的研究一直是全世界關(guān)注的熱點(diǎn)，然而，肺癌的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制并未完全闡明。據(jù)報(bào)道生存時(shí)間超過5年的患者僅有13%，且其死亡率與發(fā)病率的比值為0.87[13]。因此，眾多研究人員希望通過肺癌的發(fā)病機(jī)制出發(fā)，不僅尋找新的微創(chuàng)的生物標(biāo)志物來提高早期診斷的準(zhǔn)確性，研制出新的化療藥物及分子靶向藥物，還可以減少不必要的創(chuàng)傷性的診療并改善預(yù)后。

圖2 肺腺癌患者總生存的多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析

隨著分子生物學(xué)飛速發(fā)展，越來越多的研究表明，肺癌的形成是一個(gè)常伴有多種基因功能失常的過程，包括抑癌基因的滅活和原癌基因的激活等，并促進(jìn)腫瘤惡性化，進(jìn)一步增強(qiáng)了癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力[14]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)惡性腫瘤組織內(nèi)CHD5缺失或是表達(dá)下降時(shí)，導(dǎo)致抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)展、發(fā)生的調(diào)控系統(tǒng)出現(xiàn)功能降低，進(jìn)一步提示CHD5為抑癌基因[15]。Brodeur等[16]通過對神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織及其相應(yīng)細(xì)胞系中CHD5基因表達(dá)水平的檢測，發(fā)現(xiàn)CHD5表達(dá)水平較正常組織均顯著降低，且神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者的臨床及預(yù)后與CHD5表達(dá)水平也顯著相關(guān)。最近研究發(fā)現(xiàn)CHD5基因突變也存在于成神經(jīng)細(xì)胞瘤、乳腺癌中[17,18]。而在LUAD組織中的表達(dá)情況少有報(bào)道。

在本研究中，通過RT-PCR檢測我院130例肺腺癌組織中CHD5的表達(dá)情況；同時(shí)借助Cutoff Finder程序?qū)?30例LUAD患者分為70例高表達(dá)組和60例低表達(dá)組，結(jié)果顯示，2組間比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且CHD5低表達(dá)的患者預(yù)后較差。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析進(jìn)一步證實(shí)CHD5表達(dá)與LUAD組織的腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和術(shù)后治療顯著相關(guān)，這也提示CHD5基因很可能成為肺腺癌的一個(gè)潛在的抑癌基因提供了有力證據(jù)。此外本研究通過單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤大小(P<0.01)、腫瘤分期(P<0.01)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.01)、腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P<0.01)和術(shù)后治療(P<0.01)和CHD5表達(dá)水平(P<0.01)與患者的總生存相關(guān)。進(jìn)一步通過多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤分期(P<0.01)、術(shù)后治療(P<0.01)和CHD5表達(dá)量(P<0.01)是影響患者總生存的獨(dú)立預(yù)測因，進(jìn)一步提示其可能是LUAD預(yù)后不良的因素。同時(shí)，Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)CHD5表達(dá)水平與LUAD患者的總生存期呈正相關(guān)(P<0.01)，提示CHD5在LUAD中可能發(fā)揮著抑癌基因的作用。但是，CHD5在LUAD中具體的機(jī)制及生物學(xué)功能尚不清楚，亟需進(jìn)一步闡明。如果CHD5的生物學(xué)作用能在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中得到進(jìn)一步驗(yàn)證，那么其將有助于LUAD的檢測與治療。本研究由于是回顧性分析，且樣本量較小(130例)，無法充分控制混雜因素的影響，尚不足以指導(dǎo)臨床實(shí)踐，但卻為后續(xù)的臨床和基礎(chǔ)研究提供了有意義的參考。

綜上所述，CHD5表達(dá)量與LUAD的腫瘤分期、術(shù)后治療和預(yù)后顯著相關(guān)，可能是LUAD診斷與預(yù)后的標(biāo)志物，為靶向治療腫瘤提供重要參考價(jià)值。同時(shí)我們的研究提示，CHD5低表達(dá)組患者的總生存顯著低于CHD5高表達(dá)組患者，因此，是否可以通過上調(diào)CHD5表達(dá)來抑制LUAD細(xì)胞的增殖與侵襲將是我們進(jìn)一步研究的課題。