莊媛 郝艷麗 黃鶯 李延輝 孫穎 李悅 盧云鳳 吳濤

缺血性心臟病是由冠狀動脈閉塞或狹窄引起的心血管疾病，是世界范圍內(nèi)致殘和死亡的主要原因之一。血流恢復(fù)是緩解心肌缺血損傷的有效干預(yù)手段，然再灌注本身可導(dǎo)致額外的心肌損傷和病理性重構(gòu)，即心肌缺血/再灌注(I/R)損傷[1]。因此，減弱I/R導(dǎo)致的心肌損害對改善缺血性心臟病患者預(yù)后意義重大。環(huán)狀RNA(circRNA)是由前體mRNA反向剪切形成的單鏈封閉環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA分子，通過與miRNA結(jié)合調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)發(fā)揮功能，與心肌梗死、心臟衰老、心臟肥大、動脈粥樣硬化發(fā)生關(guān)系密切相關(guān)，是心血管疾病治療的理想靶點[2,3]。circRNA 0000285(circ_0000285)是一種致癌基因，研究發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病小鼠和高糖誘導(dǎo)的腎足細(xì)胞中circ_0000285表達(dá)升高，干擾circ_0000285表達(dá)減弱高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷[4]。生物信息學(xué)預(yù)測顯示，miR-625是circ_0000285的潛在靶點。miR-625對心肌肥厚具有抑制作用[5]。然而，circ_0000285是否靶向miR-625在心肌I/R損傷中發(fā)揮作用并不明確。本研究構(gòu)建心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(H/R)模型模擬I/R損傷過程，探討circ_0000285對H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷的影響，分析其機(jī)制是否與調(diào)miR-625表達(dá)相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠心肌細(xì)胞H9C2購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心；miRNA檢測試劑盒購于美國GeneCopoeia公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR-Green PCR試劑盒購于北京天根生化科技公司；針對circ_0000285的小干擾RNA(si-circ_0000285)及其陰性對照(si-NC)、miR-625模擬物及(mimics)其陰性對照(miR-NC)、miR-625抑制物(anti-miR-625)其陰性對照(anti-miR-NC)、雙熒光素酶報告載體由北京六合華大基因公司提供；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒購于上海銳賽生物公司；丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性檢測試劑盒北京索萊寶科技有限公司；兔源B細(xì)胞淋巴瘤-2蛋白(Bcl-2)、Bcl相關(guān)x蛋白(Bax)、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體和羊抗源IgG二抗購于美國Abcam公司。微量分光光度計(型號NanoDrop 2000)購于美國Thermo Scientific公司；流式細(xì)胞儀(型號CytoFLEX)購于美國貝克曼公司；濕式轉(zhuǎn)膜儀(型號1703930)購于美國BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 H9C2細(xì)胞培養(yǎng)、H/R模型構(gòu)建:用含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗DMEM培養(yǎng)液在37℃、5% CO2、95%空氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)H9C2細(xì)胞，當(dāng)在顯微鏡下觀察到細(xì)胞60%匯合時，消化細(xì)胞，按照1∶4比例傳代培養(yǎng)。取對數(shù)期H9C2細(xì)胞接種缺氧培養(yǎng)基，置于缺氧培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2、94% N2)培養(yǎng)3 h，磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞2次，更換為復(fù)氧培養(yǎng)基，放置常氧培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2、95% 空氣)中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，構(gòu)建H9C2細(xì)胞H/R模型[6]。

1.2.2 實時定量PCR(RT-qPCR)檢測circ_0000285和miR-625表達(dá):TRIzol試劑提取對照組、H/R組H9C2細(xì)胞的總RNA，分光光度計檢測RNA質(zhì)量。采用miRNA檢測試劑盒測定miR-625表達(dá)。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR-Green PCR試劑盒檢測circ_0000285表達(dá)。GAPDH和U6分別作為circ_0000285和miR-625的內(nèi)參基因，2-ΔΔCt法計算其相對表達(dá)量。circ_0000285上游引物5’-TACCTCTGCAGGCAGGAACT-3’，下游引物5’-TCACATGAATTTAGGTGGGACTT-3’；GAPDH上游引物5’-GCCATCACAG CAACACAGAA-3’，下游引物5’-GC CATACCAGTAAGCTTGCC-3’；miR-625上游引物5’-GCGGCAGACTATAGAACTTT-3’，下游引物5’-CAGTGCGTGTCGTGGA-3’；U6上游引物5’-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3’，下游引物5’-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和實驗分組:將對數(shù)期H9C2隨機(jī)分為以下組別。對照(Con)組為正常培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞；H/R組參照上述建模方法；H/R+si-NC組、H/R+si-circ_0000285組、H/R+miR-NC組、H/R+miR-625組、H/R+si-circ_0000285+anti-miR-NC組、H/R+si-circ_0000285+anti-miR-625組為采用脂質(zhì)Lipofectamine 2000將si-NC、si-circ_0000285、miR-NC、miR-625 mimics、si-circ_0000285+ anti-miR-NC、si-circ_0000285+anti-miR-625分別轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行H/R處理。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡:用胰蛋白酶收集各組H9C2細(xì)胞，重懸于結(jié)合緩沖液中調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個/ml。取500 μl細(xì)胞懸液加入EP管中，隨后加入5 μl的annexin V-FITC和5 μl的PI孵育10 min。混勻后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 試劑盒檢測MDA含量、SOD和GSH-Px活性:收集各組H9C2細(xì)胞EP管，棄去上清液。按照試劑盒說明書加入提取液，超聲波破碎細(xì)胞，按照10 000 r/min在4℃離心機(jī)離心10 min，收集上清液于EP管置于冰上。參照試劑盒說明書測定MDA含量以及SOD和GSH-Px活性。

1.2.6 免疫印跡法檢測Bcl-2和Bax蛋白表達(dá):使用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，采用二喹啉甲酸法測定每個蛋白樣品的濃度。將適量蛋白樣品與等體積的2×蛋白上樣緩沖液混合，沸水浴加熱5 min。取40 μg 蛋白樣品加至SDS-PAGE凝膠加樣孔，設(shè)定電壓100 V、時間110 min進(jìn)行電泳。設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為300 mA、時間為60 min利用標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上。洗膜液漂洗膜2 min，加入5%脫脂牛奶在搖床上搖動封閉60 min。吸盡封閉液后，加入稀釋好的一抗4℃緩慢搖動過夜。洗膜液漂洗膜5 min，漂洗3次。稀釋好的二抗在側(cè)擺搖床上室溫孵育1 h。采用化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯色反應(yīng)，Image J軟件分析目的條帶灰度值。蛋白相對表達(dá)量=灰度值目的條帶/灰度值GAPDH。

1.2.7 雙熒光素酶報告實驗:合成Circ_0000285野生型(WT)序列(包含miR-625結(jié)合位點)或Circ_0000285突變型(MUT)序列(含有突變位點)，將上述序列分別插入pmirGLO載體，構(gòu)建熒光素酶報告載體WT-circ_0000285、MUT-circ_0000285。分別用Lipofectamine 2000試劑將這些載體與miR-625 mimic或miR-NC共轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)測定相對熒光素酶活性。將pcDNA、pcDNA-circ_0000285、si-NC、si-circ_0000285分別轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞，按照1.2.1步驟檢測轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞中miR-625表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 circ_0000285和miR-625在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞損傷中的表達(dá) H/R組H9C2細(xì)胞中circ_0000285表達(dá)量與Con組比較顯著升高(P<0.05)，而miR-625表達(dá)量與Con組比較顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 circ_0000285和miR-625在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞損傷中的表達(dá)

2.2 抑制circ_0000285表達(dá)對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞氧化損傷的影響 與Con組比較，H/R組H9C2細(xì)胞circ_0000285表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，凋亡率、Bax蛋白表達(dá)量、MDA含量顯著升高(P<0.05)，而SOD和GSH-Px活性、Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與H/R+si-NC組比較，H/R+si-circ_0000285組H9C2細(xì)胞circ_0000285表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，凋亡率、Bax蛋白表達(dá)量、MDA含量顯著降低(P<0.05)，而SOD和GSH-Px活性、Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 抑制circ_0000285表達(dá)對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡的影響；A 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)；B 細(xì)胞凋亡流式圖

表2 抑制circ_0000285表達(dá)對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞氧化損傷的影響

2.3 circ_0000285靶向調(diào)控miR-625的表達(dá) miR-625與circ_0000285序列間存在特異性互補(bǔ)結(jié)合位點。與轉(zhuǎn)染miR-NC比較，轉(zhuǎn)染miR-625 mimics顯著降低H9C2細(xì)胞WT-circ_0000285的性對熒光素酶活性(P<0.05)，而對MUT-circ_0000285的相對熒光素酶活性物顯著影響。pcDNA-circ_0000285組H9C2細(xì)胞中miR-625表達(dá)量與pcDNA組比較顯著降低(P<0.05)；而si-circ_0000285組H9C2細(xì)胞中miR-625表達(dá)量與si-NC組比較顯著增加(P<0.05)。見圖2，表3、4。

表3 雙熒光素酶報告實驗

圖2 circ_0000285的序列中含有與miR-625互補(bǔ)的核苷酸序列

2.4 miR-625過表達(dá)對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞氧化損傷的影響 與H/R+miR-NC組比較，H/R+miR-

表4 circ_0000285調(diào)控miR-625的表達(dá)

625組H9C2細(xì)胞miR-625表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，凋亡率、Bax蛋白表達(dá)量、MDA含量顯著降低(P<0.05)，而SOD和GSH-Px活性、Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。見表5，圖3。

表5 miR-625過表達(dá)對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞氧化損傷的影響

圖3 miR-625過表達(dá)對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡的影響；A 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)；B 細(xì)胞凋亡流式圖

2.5 抑制miR-625表達(dá)逆轉(zhuǎn)抑制circ_0000285表達(dá)對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞氧化損傷的作用 與H/R+si-circ_0000285+anti-miR-NC組比較，H/R+si-circ_0000285+anti-miR-625組H9C2細(xì)胞miR-625表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，凋亡率、Bax蛋白表達(dá)量、MDA含量顯著升高(P<0.05)，而SOD和GSH-Px活性、Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。見圖4，表6。

表6 抑制miR-625表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制circ_0000285表達(dá)對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞氧化損傷的作用

圖4 抑制miR-625表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制circ_0000285表達(dá)對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡的作用；A 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)；B 細(xì)胞凋亡流式圖

3 討論

心肌I/R損傷涉及廣泛的生物學(xué)過程，包括細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷。缺血和再灌注階段可產(chǎn)生活性氧，過量活性氧可直接損傷蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA分子等細(xì)胞成分，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致心肌損傷[7]。本研究顯示H/R處理后，細(xì)胞凋亡率、脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA含量顯著增加，而抗氧化酶SOD和GSH-Px活性顯著降低，提示H9C2細(xì)胞H/R損傷模型構(gòu)建成功。目前關(guān)于circ_0000285相關(guān)研究主要集中在腫瘤方面，干擾其表達(dá)可抑制肝癌[8]、骨肉瘤[9]、喉癌[10]等惡性腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)H/R處理的H9C2細(xì)胞中circ_0000285表達(dá)量顯著增加，提示circ_0000285表達(dá)改變可能與H9C2細(xì)胞H/R損傷有關(guān)。驗證circ_0000285功能顯示，干擾其表達(dá)顯著降低MDA含量、凋亡率，提高SOD和GSH-Px活性，說明干擾circ_0000285表達(dá)通過提高H9C2細(xì)胞抗氧化能力來減輕氧化應(yīng)激以抵抗H/R損傷。Bcl-2基因家族是最重要的凋亡調(diào)節(jié)因子，Bcl-2是一種凋亡抑制蛋白，其過表達(dá)可以阻斷各種刺激誘導(dǎo)的凋亡，而Bax在凋亡刺激下移位至線粒體膜誘導(dǎo)細(xì)胞色素c釋放發(fā)揮促凋亡作用[11]。本研究中干擾circ_0000285表達(dá)顯著上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)、上調(diào)Bax蛋白表達(dá)，與其對H/R處理的H9C2細(xì)胞的抗凋亡作用吻合。以上研究表明，干擾circ_0000285可拮抗H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷。

對circ_0000285相關(guān)研究進(jìn)行分析表明，其生物學(xué)作用的發(fā)揮多與調(diào)節(jié)miRNA表達(dá)有關(guān)[12]。如干擾circ_0000285通過負(fù)調(diào)控miR-197-3p表達(dá)誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞G0/G1期阻滯、自噬和凋，抑制宮頸癌進(jìn)展[13]。本研究通過雙熒光素酶實驗證實miR-625是circ_0000285的靶基因，并進(jìn)一步證實過表達(dá)或干擾circ_0000285可下調(diào)或上調(diào)miR-625表達(dá)水平。miR-625已被證實具有神經(jīng)保護(hù)功能，敲減長鏈非編碼RNA p21(lncRNA-p21)表達(dá)通過上調(diào)miR-625表達(dá)可增加SOD活性，減輕1甲基4苯基吡啶離子(MPP+)誘導(dǎo)的神經(jīng)元毒性、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥[14]。miR-625還可改善脂多糖誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)H/R處理的H9C2細(xì)胞中miR-625表達(dá)量顯著降低，過表達(dá)miR-625顯著提高H9C2細(xì)胞抗氧化能力、降低氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡，保護(hù)H9C2細(xì)胞免受H/R損傷。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-625表達(dá)顯著減弱干擾circ_0000285表達(dá)對H/R處理的H9C2細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激損傷的影響，這間接證實circ_0000285對H9C2細(xì)胞H/R損傷的調(diào)控功能是通過靶向負(fù)調(diào)控miR-625表達(dá)實現(xiàn)的。

綜上所述，H/R刺激可誘導(dǎo)circ_0000285在H9C2心肌細(xì)胞中表達(dá)，抑制miR-625表達(dá)。干擾circ_0000285表達(dá)通過上調(diào)miR-625可減弱H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷。因此，circ_0000285/miR-625途徑在開發(fā)缺血性心臟病藥物干預(yù)可行靶點方面可能具有潛在臨床應(yīng)用價值。