李悅，李海燕*，周圓圓，陳井生，于吉東

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學農(nóng)學院，黑龍 江大慶，163319；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院大慶分院，黑龍 江大慶，163316）

大豆胞囊線蟲（Heterodera glycines,SCN）是大豆根部最為嚴重的病源之一，嚴重影響我國東北和黃淮海地區(qū)大豆的生產(chǎn)[1]。目前，對線蟲的防治多依賴于化學殺線蟲劑，雖然防控效果明顯，但其帶來的環(huán)境污染、抗性產(chǎn)生等問題也較為顯著，一些高毒、高殘留的化學殺線蟲劑己陸續(xù)在許多國家和地區(qū)被禁用[2,3]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)許多植物體內含有的次生代謝產(chǎn)物具有一定的殺蟲抑菌作用[4]。前人研究表明與亞麻、蓖麻等作物輪作后耕層胞囊數(shù)量降低了80%以上[5]，劉淑霞[6]等研究表明大麻根和葉的水提物與乙醇浸提物均對SCN 的毒殺效果顯著，但并未探究莖稈提取物對大豆胞囊線蟲的毒殺效果以及對線蟲的生理生化代謝的影響。

工業(yè)大麻也稱漢麻（Cannabis sativaLinn.），是一年生草本植物[7]，其四氫大麻酚含量低于0.3%，屬于無毒品利用價值的大麻類型[8]。據(jù)報道，2019年黑龍江省大麻的種植面積超過4 萬公頃，占全國種植面積的60%以上，且有不斷增加的趨勢[9～11]。作者在前期進行的篩選與研究中發(fā)現(xiàn)，工業(yè)大麻乙醇提取物濃度為9 mg·mL-1時，大豆胞囊線蟲J2 的校正死亡率為88.5%。但其對大豆胞囊線蟲的作用機理尚不清楚。線蟲體內的糖類、脂類和蛋白質是維持自身生命活動中必不可少的物質，其含量變化會影響線蟲的抗藥性，從而影響大豆胞囊線蟲的存活力[12]。昆蟲解毒酶系是代謝大量外源和內源物質的異質酶系[13]，其中乙酰膽堿酯酶、羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉移酶是昆蟲體內主要的解毒酶，具有代謝內外有毒物和維持正常代謝發(fā)育的關鍵作用[14～16]。因此，為了明確工業(yè)大麻秸稈乙醇提取物對大豆胞囊線蟲的作用機理，本研究利用前期篩選的最優(yōu)提取條件所獲得的乙醇提取物，測定了其對大豆胞囊線蟲體內的總糖、甘油和蛋白質含量以及酶活性等生理生化指標的影響，為工業(yè)大麻防治大豆胞囊線蟲病奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

工業(yè)大麻秸稈為慶麻1 號，由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院大慶分院提供。

大豆胞囊線蟲3 號生理小種，采自大慶市洪湖基地大豆試驗田。

1.2 方法

1.2.1 工業(yè)大麻秸稈乙醇提取物制備 取收獲后工業(yè)大麻秸稈，陰干后使用植物粉碎機粉碎，過40目篩，備用。在預試驗基礎上，取10 g工業(yè)大麻秸稈粉末，加入62%的乙醇，超聲輔助提取一定時間，過濾后減壓濃縮至膏狀，備用。

1.2.2 大豆胞囊線蟲二齡幼蟲的獲得 于5 月25日取表層土下5～10cm 的病土，采用淘洗過篩法分離病土中的胞囊，于體視解剖鏡下挑取大小一致的成熟、飽滿胞囊，經(jīng)0.5% NaClO 溶液表面消毒3 min，無菌水沖洗3～5 次后，浸泡在3 mmoL·L-1ZnS04溶液中，于28℃的恒溫箱中孵化，每隔24 h 收集一次孵化的二齡幼蟲，并及時換水，用無菌水制成2000條·L-1的懸浮液。

1.2.3 大豆胞囊線蟲的處理方法 取J2 懸浮液10 mL，常溫下1500 r·min-1離心3 min，移除上清液。離心管內加3 mL 濃度為4.3 mg·mL-1的工業(yè)大麻秸稈的乙醇提取物，以無菌水作對照，每個處理重復4次。分別處理0、6、12 和24 h 后，于常溫下2000 r·min-1離心5 min，移除上清液，收集線蟲備用。

1.2.4 大豆胞囊線蟲生理生化指標測定 總糖含量測定：采用蒽酮顯色法，將經(jīng)預處理后的大豆胞囊線蟲20 mg 置于1.5 mL 離心管內，加入20 μL 蒸餾水和少許石英砂，冰浴下研磨離心取上清液，參照仵均祥等[17]的方法，加入蒽酮試劑后，使用酶標儀測定620 nm 下的吸光值（OD 值），結合糖標準曲線計算線蟲體內的實際總糖含量。線蟲體內糖含量（μg·mg-1）=從標準曲線中查得糖含量（μg·mL-1）×樣品稀釋倍數(shù)（mL）/線蟲重量（mg）。

可溶性蛋白測定：采用考馬斯亮藍G250 染色法，將經(jīng)預處理后的大豆胞囊線蟲20 mg 置于1.5 mL 離心管內，加入20 μL PBS 緩沖液（磷酸鹽緩沖液）和少許石英砂，冰浴下研磨離心取上清液，參照路平[18]方法，加入G250 染色后，使用酶標儀測定595 nm 下的吸光值（OD 值），結合可溶性蛋白標準曲線計算線蟲體內的實際可溶性蛋白含量。線蟲體內可溶性蛋白（μg·mg-1）=從標準曲線中查得可溶性蛋白含量（μg·mL-1）×樣品稀釋倍數(shù)（mL）/線蟲重量（mg）。

甘油含量測定：采用高碘酸鈉氧化法，線蟲體內甘油的提取方法同可溶性蛋白的處理，參照劉丹丹[19]方法，加入甘油顯色劑后，使用酶標儀測定420 nm 下的吸光值（OD 值），結合甘油標準曲線計算線蟲體內的實際甘油含量。線蟲體內甘油（μg·mg-1）=從標準曲線中查得甘油含量（μg·mL-1）×樣品稀釋倍數(shù)（mL）/線蟲重量（mg）。

羧酸酯酶、乙酰膽堿酯酶和谷胱甘肽-S-轉移酶活性測定：采用北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒，相應酶液的提取及酶活測定均參照說明書進行。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用Microsoft Excel 2003 進行數(shù)據(jù)的錄入、整理，用DPS軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 工業(yè)大麻秸稈乙醇提取物對大豆胞囊線蟲J2總糖含量的影響

隨著處理時間的延長，乙醇提取物處理大豆胞囊線蟲J2 總糖含量呈上升趨勢，而CK 總糖含量稍有下降（圖1）。浸泡6 h時，線蟲J2總糖含量上升情況與CK 間差異不顯著。處理12 h 時，J2 總糖含量稍有上升，J2 總糖含量為27.18 μg·mg-1，與CK 相比總糖含量高24.6%，差異顯著。處理24 h 時，J2 總糖含量上升較快，為40.74 μg·mg-1，與CK 相比總糖含量上升了96.2%，與CK 間存在極顯著差異。隨處理時間的延長CK 的總糖含量雖有不同程度的降低，但均未達到顯著水平，經(jīng)工業(yè)大麻秸稈乙醇提取物處理后的J2 總糖含量隨處理時間的延長有顯著或極顯著上升，與處理6h 相比，處理12 h 和24 h后的J2體內總糖含量分別升高了49.9%、79.0%。

圖1 工業(yè)大麻秸稈乙醇提取物處理后大豆胞囊線蟲J2總糖含量Fig.1 Total sugar content of soybean cyst nematode J2 treated with ethanol extract of industrial hemp straw

2.2 工業(yè)大麻秸稈乙醇提取物對大豆胞囊線蟲J2可溶性蛋白含量的影響

隨著工業(yè)大麻秸稈乙醇提取物處理時間的延長，大豆胞囊線蟲J2 可溶性蛋白含量與CK 均有不同程度降低（圖2）。經(jīng)處理6 h時，線蟲J2體內可溶性蛋白含量下降情況與CK 間差異不顯著。處理12 h 時，J2 體內可溶性蛋白含量下降較快，可溶性蛋白含量為18.36 μg·mg-1，與CK 相比降低了18.3%，差異極顯著。處理24 h 后，J2 體內可溶性蛋白含量持續(xù)下降，為15.34 μg·mg-1，與CK 相比降低了26.3%，與CK間存在極顯著差異。隨處理時間的延長CK 的可溶性蛋白含量雖有不同程度的降低，但均未達到顯著水平，經(jīng)工業(yè)大麻秸稈乙醇提取物處理后的J2 可溶性蛋白含量隨處理時間的延長均有顯著或極顯著差異下降，與處理6 h 相比，處理12 h和24 h 后的J2 體內可溶性蛋白含量分別降低17.6%、31.1%。

圖2 工業(yè)大麻秸稈乙醇提取物處理后大豆胞囊線蟲J2可溶性蛋白含量Fig.2 Soluble protein content of soybean cyst nematode J2 treated with ethanol extract of industrial hemp straw

2.3 工業(yè)大麻秸稈乙醇提取物對大豆胞囊線蟲J2甘油含量的影響

隨著工業(yè)大麻秸稈乙醇提取物處理時間的延長，大豆胞囊線蟲J2體內甘油含量與CK均呈上升趨勢（圖3）。當處理6 h時，線蟲J2體內甘油含量變化與CK間差異不顯著。處理12 h時，J2體內甘油含量上升較快，為0.12 μg·mg-1，與CK相比甘油含量上升了24.4%，差異極顯著。處理24 h后，J2體內甘油含量持續(xù)上升，為0.14 μg·mg-1，與CK相比甘油含量上升了33.5%，差異極顯著。經(jīng)工業(yè)大麻秸稈提取物處理12 h 和24 h 后的J2 甘油含量極顯著高于處理6 h后的J2甘油含量，分別升高29.0%、44.7%。

圖3 工業(yè)大麻秸稈乙醇提取物處理后大豆胞囊線蟲J2甘油含量Fig.3 Glycerin content of soybean cyst nematode J2 treated with ethanol extract of industrial hemp straw

2.4 工業(yè)大麻秸稈乙醇提取物對大豆胞囊線蟲J2乙酰膽堿酯酶（AchE）活性的影響

隨著工業(yè)大麻秸稈乙醇提取物處理時間的延長，大豆胞囊線蟲J2 乙酰膽堿酯酶活性變化呈下降趨勢（圖4）。當處理6 h時，線蟲J2乙酰膽堿酯酶活性稍有降低，但與CK 間差異不顯著。處理12 h 時，J2 乙酰膽堿酯酶活性降低較快，為1093.68 U·g-1，與CK 相比乙酰膽堿酯酶活性降低了58.3%，差異極顯著。處理24 h 后，J2 乙酰膽堿酯酶活性持續(xù)降低，為377.71 U·g-1，與CK 相比乙酰膽堿酯酶活性降低了61.1%，與CK 間存在極顯著差異。隨處理時間延長，CK 的J2 乙酰膽堿酯酶活性稍有降低，但均未達到顯著水平。經(jīng)工業(yè)大麻秸稈乙醇提取物處理后的J2 乙酰膽堿酯酶活性極顯著降低，與處理6 h 時相比，處理12 h 和24 h 后的J2 體內乙酰膽堿酯酶活性分別降低了50.3%、58.9%。

圖4 工業(yè)大麻秸稈乙醇提取物處理后大豆胞囊線蟲J2乙酰膽堿酯酶活性Fig.4 AchE activity of soybean cyst nematode J2 treated with ethanol extract of industrial hemp straw

2.5 工業(yè)大麻秸稈乙醇提取物對大豆胞囊線蟲J2羧酸酯酶（CarE）活性的影響

隨著工業(yè)大麻秸稈乙醇提取物處理時間的延長，大豆胞囊線蟲J2 羧酸酯酶活性呈下降趨勢（圖5）。經(jīng)處理6 h 時，線蟲J2 羧酸酯酶活性降低情況與CK 間差異不顯著。處理12 h 時，J2 羧酸酯酶活性降低較快，為15.33 U·g-1，與CK 相比羧酸酯酶活性降低了41.8%，達極顯著差異。處理24 h 時，J2羧酸酯酶活性持續(xù)降低，為13.00 U·g-1，與CK 相比羧酸酯酶活性降低了51.3%，差異極顯著。CK的J2羧酸酯酶活性隨時間的延長雖有不同程度的降低，但均未達到顯著水平；經(jīng)工業(yè)大麻秸稈乙醇提取物處理12 h 和24 h 時的J2 羧酸酯酶活性與6 h 時相比差異極顯著，分別降低了42.7%、51.4%。

圖5 工業(yè)大麻秸稈乙醇提取物處理后大豆胞囊線蟲J2羧酸酯酶（CarE）活性Fig.5 CarE activity of soybean cyst nematode J2 treated with ethanol extract of industrial hemp straw

2.6 工業(yè)大麻秸稈乙醇提取物對大豆胞囊線蟲J2谷胱甘肽S-轉移酶（GST）活性的影響

隨著工業(yè)大麻秸稈乙醇提取物處理時間的延長，大豆胞囊線蟲J2谷胱甘肽S-轉移酶活性呈下降趨勢（圖6）。經(jīng)工業(yè)大麻秸稈乙醇提取物處理6 h、12 h 時，線蟲J2 谷胱甘肽S-轉移酶活性分別為0.46 U·g-1、0.44 U·g-1，與CK 間差異均不顯著。處理24 h 后，線蟲J2 谷胱甘肽S-轉移酶活性降低較快，為0.24 U·g-1，與CK 相比谷胱甘肽S-轉移酶活性降低了45.4%，達極顯著差異。CK 線蟲J2 谷胱甘肽S-轉移酶活性隨時間延長稍有降低，但無顯著差異。經(jīng)工業(yè)大麻秸稈乙醇提取物處理后的J2 谷胱甘肽S-轉移酶活性極顯著降低，與處理6 h 時相比，處理12 h和24 h后的J2谷胱甘肽S-轉移酶活性分別降低了5.3%、44.6%。

圖6 工業(yè)大麻秸稈乙醇提取物處理后大豆胞囊線蟲J2谷胱甘肽S-轉移酶（GST）活性Fig.6 GST activity of soybean cyst nematode J2 treated with ethanol extract of industrial hemp straw

3 討論與結論

糖類是線蟲體內重要的儲能物質，而蛋白質是線蟲體表的防御性角質層的重要組成部分，其結構和功能被破壞后，會影響大豆胞囊線蟲的抗藥性，從而降低大豆胞囊線蟲的存活力[12]。本試驗結果表明，線蟲在工業(yè)大麻秸稈乙醇提取物作用時，引起總糖含量上升，這與路平[18]研究的生防細菌X-20對根結線蟲生防機制中總糖含量的變化趨勢相同，工業(yè)大麻秸稈乙醇提取物處理線蟲后，促進了線蟲體內糖的合成，導致線蟲體內糖代謝出現(xiàn)紊亂，從而削弱線蟲抵御不良環(huán)境的能力。可溶性蛋白含量和甘油含量下降，與劉丹丹[19]報道的酸類化合物處理大豆胞囊線蟲后變化趨勢一致。表明工業(yè)大麻秸稈乙醇提取物可能是抑制了線蟲體內可溶性蛋白的合成，影響線蟲蟲體角質層的形成，降低線蟲的抗逆能力最終致其死亡。甘油除作為線蟲體內能源物質外，也是參與抗逆機制的重要組成部分[20]。經(jīng)工業(yè)大麻秸稈乙醇提取物處理后，線蟲體內的甘油含量增加，說明線蟲體內的甘油可能參與了線蟲的抗逆反應。

乙酰膽堿酯酶、羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉移酶是昆蟲體內主要的解毒酶，經(jīng)工業(yè)大麻秸稈乙醇提取物處理后，線蟲的乙酰膽堿酯酶活性明顯降低，這與劉瓊[21]等報道的球孢白僵菌次生代謝產(chǎn)物處理南方根結線蟲后變化趨勢相同。說明工業(yè)大麻秸稈乙醇提取物可導致線蟲蟲體的神經(jīng)遞質無法正常降解，造成其神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，最終導致線蟲死亡。另外昆蟲的代謝抗藥性與羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉移酶有關[22]，張楠[23]研究發(fā)現(xiàn)大豆莢殼提取物處理根結線蟲后谷胱甘肽S-轉移酶活性顯著低于對照。本研究發(fā)現(xiàn)工業(yè)大麻秸稈乙醇提取物處理線蟲后可使其體內的羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉移酶活性下降，削弱其對毒害物質的降解，使線蟲無法正常的生長發(fā)育，最終導致線蟲死亡。

本研究明確了工業(yè)大麻秸稈乙醇提取物能夠使線蟲體內糖、蛋白質和脂類物質代謝出現(xiàn)紊亂，破壞線蟲蟲體結構，使其生存能力下降。同時乙酰膽堿酯酶、羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉移酶活性受到抑制，使線蟲代謝有毒物質能力減弱，從而起到毒殺線蟲的作用。但是，關于工業(yè)大麻秸稈乙醇提取物中有效殺線蟲活性成分的結構以及影響線蟲代謝的分子機制還有待進一步研究，以期開發(fā)出新型的植物源殺線蟲劑，減少化學農(nóng)藥的使用量。