龍杰鳳，胡秀虹，范成念，楊違仙

(凱里學(xué)院大健康學(xué)院，貴州 凱里 556011)

0 引言

黃精(Polygonatumsibiricum)屬百合科多年生草本植物，別名雞頭黃精、老虎姜。黃精作為傳統(tǒng)的滋補類中藥，被廣泛應(yīng)用于中醫(yī)臨床，2020年版《中國藥典》收載的三種黃精為黃精、滇黃精、多花黃精的干燥根莖，且藥典規(guī)定的黃精炮制方法為“置沸水中略燙或蒸至透心，干燥”[1]；而在貴州苗族地區(qū)喜用鮮黃精治療胃腸炎、皮膚癬等病癥，具有一定的療效。大量學(xué)者的研究多集中在制黃精的成分分析及抗氧化活性上，對生黃精的藥用研究甚少，且對生黃精多糖抑菌活性研究未見報道[2-4]。本文通過提取生黃精多糖，探究生黃精多糖對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌五種致病菌的抑菌作用，為開發(fā)苗藥具有一定的推進(jìn)作用，為生黃精相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)參考。

1 實驗材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材的購買與處理

生黃精來源于筆者參加全國第四次中藥資源普查中在貴州省鎮(zhèn)遠(yuǎn)縣、黃平縣、印江縣、梵凈山等多個地區(qū)采集而得，將生黃精藥材清洗干凈，新鮮切片，搗碎，密封存放于2～8 ℃冰箱中備用。

1.1.2 實驗菌株

由凱里學(xué)院民族藥工程中心提供的五種菌：白色念珠菌(CandidaAlbicans)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereu)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、巨大芽孢桿菌(BacillusmegateriumdeBary)。

1.1.3 實驗設(shè)備與試劑

超聲儀SK8200HP(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)、立式壓力蒸汽滅菌器BXM-30R(上海博訊實業(yè)有限公司)、生化培養(yǎng)箱BSP-150(上海博訊實業(yè)有限公司)、消毒柜ZTP-78L-A01(佛山市六百年電器)、凈化工作臺(上海博訊實業(yè)有限公司)、數(shù)顯水浴恒溫振蕩器、抑菌圈(抗生素效價)測量儀；無水乙醇、石油醚、α-萘酚，均為試劑純，購于重慶川東化工。

1.1.4 供試培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨20 g、牛肉膏3 g、氯化鈉5 g、瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL；沙氏培養(yǎng)基：瓊脂20 g、蛋白胨10 g、葡萄糖40 g、蒸餾水1000 mL。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥材的預(yù)處理(石油醚脫脂)

分別稱取3份50 g生黃精碎末，加入3個三角瓶中，再向三角瓶中加入適量石油醚進(jìn)行脫脂[6](沒過藥材約2～3 cm)。將3個三角瓶用鐵架臺固定于超聲波清洗器中，設(shè)置時間為30 min、功率90%、工作頻率為53 kHz，開啟超聲。石油醚脫脂結(jié)束后，傾出提取液，棄液留渣，自然狀態(tài)下，揮干剩余的石油醚，作為提取的原料。

1.2.2 超聲波輔助提取多花黃精

按照料液比1∶15，向已脫脂處理的3個三角瓶中分別加入已滅菌好的蒸餾水，將三角瓶用鐵架臺固定于超聲波清洗器中，設(shè)置提取時間40 min，超聲波作用功率90%，工作頻率53 kHz，提取結(jié)束后，用脫脂棉過濾2次，再用濾紙過濾1次，將濾液轉(zhuǎn)移至3個三角瓶中，將提取液用電磁爐水浴加熱濃縮到50 mL，得到濃縮液的濃度為0.5 g/mL。用保鮮膜將瓶口封好，冷卻至室溫或者更低溫度后，放入冰箱5 ℃保存?zhèn)溆肹5-6]。

1.2.3 菌種活化

在無菌操作條件下[7]，用接種環(huán)刮取金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、解淀粉酶芽孢桿菌的菌落在制備好牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，放入生化培養(yǎng)箱(BSP-150)中37 ℃下，倒置培養(yǎng)24 h。白色念珠菌則在制備好的沙氏固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，放入霉菌培養(yǎng)箱(BMJ-160)中28 ℃下，培養(yǎng)24 h，即得到活化后的供試菌種。

1.2.4 菌液制備

將活化的菌種用接種環(huán)刮取菌落接到25 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(若接白色念珠菌則用沙氏液體培養(yǎng)基)中，放入水浴恒溫振蕩器(SPCC-SHA-C)中37 ℃搖床培養(yǎng)22 h，即得到菌液[8]。在凈化工作臺(SW-CJ-1FD)中，開啟紫外30 min，風(fēng)機10 min，用無菌注射器分別吸取9.9 mL已滅菌的0.9%生理鹽水加入到5支已滅菌的試管中，再用移液槍吸取100 μL經(jīng)水浴恒溫振蕩培養(yǎng)好的菌液，加入試管中稀釋成實驗所需要的菌懸液。

1.2.5 體外抑菌試驗

按照濾紙片法進(jìn)行試驗操作[8]：分別用移液槍吸取 0.2 mL各菌懸液，加到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基表面上并涂布均勻。將生黃精多糖用對倍稀釋法，分別配制成濃度為0.5 g/mL、0.25 g/mL、0.125 g/mL、0.0625 g/mL、0.03125 g/mL的抑菌藥液，用移液槍各吸取5 mL上述濃度的藥液(對照則用無菌水代替藥液，其他條件不變)分別放入已滅菌好的培養(yǎng)皿中，然后將已滅菌并烘干的濾紙片(直徑6 mm)放入培養(yǎng)皿中進(jìn)行浸泡，每個培養(yǎng)皿放25片，浸泡2 h后，用鑷子取出后等待微干，放入培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿等距離放置不同濃度抑菌液浸泡過的濾紙片，每個菌種做3個平行。然后倒置于生化培養(yǎng)箱(BSP-150)中培養(yǎng)，37 ℃下培養(yǎng) 24 h(白色念珠菌則放入霉菌培養(yǎng)箱(BMJ-160)中培養(yǎng)，27 ℃下培養(yǎng)24 h)，觀察并記錄結(jié)果，取出培養(yǎng)皿后，用訊數(shù)-抑菌圈(抗生素效價)測量儀(CzoneG67)對培養(yǎng)基進(jìn)行圖像的拍攝，并標(biāo)定抑菌圈，進(jìn)行抑菌圈直徑的大小的測量，比較抑菌效果。

2 實驗結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

2.1 抑菌活性測定

通過紙片法，將不同濃度的黔產(chǎn)生黃精多糖對5種供試菌株進(jìn)行抑制試驗，采用訊數(shù)-抑菌圈(抗生素效價)測量儀(CzoneG67)對抑菌圈直徑進(jìn)行測量。綜上分析，結(jié)果見表1-表6。

表1 黔產(chǎn)生黃精多糖對白色念珠菌抑菌圈的測定Tab.1 Determination of inhibition zone of polysaccharideinPolygonatum sibiricum on Candida albicans

表2 黔產(chǎn)生黃精多糖對金黃色葡萄球菌抑菌圈的測定Tab.2 Determination of inhibition zone of polysaccharide inPolygonatum sibiricum on Staphylococcus aureus

實驗結(jié)果表明，黔產(chǎn)多花黃精藥液濃度在31.25～500 mg/mL范圍內(nèi)，對5種供試菌種均具有抑菌效果，抑菌圈直徑大小為：巨大芽孢桿菌>解淀粉芽孢桿菌>蠟樣芽孢桿菌>金黃色葡萄球菌>白色念珠菌。其中，在藥液濃度為125 mg/mL時，對巨大芽孢桿菌的抑菌效果最佳，抑菌圈直徑為12.826 mm。

表3 黔產(chǎn)生黃精多糖對蠟樣芽孢桿菌抑菌圈的測定Tab.3 Determination of inhibition zone of polysaccharide inPolygonatum sibiricum on Bacillus cereus

表4 黔產(chǎn)生黃精多糖對巨大芽孢桿菌抑菌圈的測定Tab.4 Determination of inhibition zone of polysaccharidein Polygonatum sibiricum on Bacillus megaterium

表5 黔產(chǎn)生黃精多糖對解淀粉芽孢桿菌抑菌圈的測定Tab.5 Determination of inhibition zone of polysaccharide inPolygonatum sibiricum on Bacillus amyloliquefaciens

表6 黔產(chǎn)生黃精多糖對5種菌株抑菌圈平均直徑表Tab.6 Average diameter of inhibition zone of polysaccharide inPolygonatum sibiricum on the five kinds of bacteria

2.2 穩(wěn)定性實驗(方差分析)

用SPSS24.0對藥液濃度與抑菌圈直徑大小的關(guān)系進(jìn)行單因素方差分析，所得結(jié)果如表7至表11所示，分別為白色念珠菌抑菌圈直徑方差分析、解淀粉芽孢桿菌抑菌圈直徑方差分析、金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑方差分析、巨大芽孢桿菌抑菌圈直徑方差分析、蠟樣芽孢桿菌抑菌圈直徑方差分析，通過數(shù)據(jù)可知，黔產(chǎn)多花黃精對5種實驗菌的抑菌圈直徑方差顯著性P<0.05，具有統(tǒng)計學(xué)意義，即黔產(chǎn)生黃精多糖對白色念珠菌、解淀粉芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、巨大芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌這5種菌的生長，均具有良好的抑制效果。

表7 白色念珠菌抑菌圈直徑方差分析表Tab.7 Variance analysisof inhibition zone diameter onCandida albicans

表8 解淀粉芽孢桿菌抑菌圈直徑方差分析表Tab.8 Variance analysis of inhibition zone diameter onBacillus amyloliquefaciens

表9 金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑方差分析表Tab.9 Variance analysis of inhibition zone diameter onStaphylococcus aureus

表10 巨大芽孢桿菌抑菌圈直徑方差分析表Tab.10 Variance analysis of inhibition zone diameter onBacillus megaterium

表11 蠟樣芽孢桿菌抑菌圈直徑方差分析表Tab.11 Variance analysis of inhibition zone diameter onBacillus cereus

2.3 抑菌劑活性測定

由圖1可知，黔產(chǎn)生黃精多糖對這5種供試菌株均具有良好的抑菌效果。其中對巨大芽孢桿菌的抑菌效果最為明顯，當(dāng)藥液濃度為125 mg/mL時抑菌效果最好，作用最優(yōu)；對白色念珠菌抑菌作用最弱。

圖1 不同藥物濃度對5種菌的抑菌效果Fig.1 Antibacterial effect of different concentrationsof polysaccharide on the five kinds of bacteria

3 結(jié)論與討論

1)實驗研究結(jié)果表明，黔產(chǎn)生黃精多糖對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌這5種試驗菌株均具有良好的抑菌活性。其中，對白色念珠菌的最佳抑菌濃度為62.5 mg/mL，對其他4個供試菌株的最佳抑菌濃度都為125 mg/mL。對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌的最大平均抑菌圈直徑分別為9.460 mm、10.302 mm、10.367 mm、10.828 mm、12.826 mm，由此可見，黔產(chǎn)生黃精多糖對巨大芽孢桿菌的抑菌效果最優(yōu)，最適濃度為125 mg/mL。

2)生黃精多糖具有廣譜抗菌性，本實驗的研究結(jié)果將為生鮮黃精進(jìn)一步開發(fā)成天然抑菌劑提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)參考[10]。