楊鵬 張華 李欣淼 張子敬 劉賢 趙楊楊 田全召 王二耀 雷初朝 陳宏 黃永震*

（1.西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西咸陽 712100；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心，北京 100176；3.河南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，河南鄭州 450002；4.河南省鼎元種牛育種有限公司，河南鄭州 450000）

隨著全球農(nóng)業(yè)反芻動物產(chǎn)業(yè)技術的發(fā)展，我國人民對于優(yōu)異種質資源認識和需求的加深，家畜培育、養(yǎng)殖及相關產(chǎn)業(yè)對我國國民生活水平和國家經(jīng)濟發(fā)展有重要意義。我國具有動物遺傳資源豐富的天然優(yōu)勢，但隨著科技水平的發(fā)展和人民生活水平的提高，國內及國際市場對畜產(chǎn)品的需求發(fā)生了巨大的變化，僅依靠自然選擇獲得的品種遠不能滿足當前的需求。而在一些地方，“重引進、雜交，輕培育和保護” 的情況非常嚴重，導致本土品種遺傳資源缺失，且培育效果不佳。20 世紀末，隨著分子生物技術的迅猛發(fā)展，以DNA 水平的各種技術為支撐，發(fā)展出了一套分子標記鑒定技術，突破了常規(guī)育種的限制因素，提高了育種精確度。在此之后，基因芯片技術的興起與發(fā)展，擴大了遺傳標記的檢測范圍，實現(xiàn)了大量標記并行檢測。而隨著測序技術的發(fā)展，基因組學飛速發(fā)展，本文旨在對分子育種技術進行分類總結，并綜述了分子標記、基因芯片和全基因組選擇在黃牛育種中的應用，以期為后續(xù)育種工作提供材料參考和技術支撐。

1 分子育種的分類

1.1 分子標記

DNA 分子標記是利用測定遺傳物質產(chǎn)生的變化來確定樣本DNA 的變異情況，并以此作為標記。這種技術為遺傳多樣性的研究提供了新的形式[1]。分子標記可以通過檢測準確反映出檢測個體遺傳物質遺傳變異的特征信息。優(yōu)良的分子標記具有多種優(yōu)點，包括①較高的多態(tài)水平，基因多態(tài)是指在家畜群體中，影響個體表型的同種基因以多種基因型存在，而較高的多態(tài)水平和樣本量，有利于在試驗中檢測出個體間的差異，差異性越大，越能體現(xiàn)出優(yōu)勢基因和優(yōu)勢基因型；②范圍大，覆蓋群體面積大，有利于我們在家畜群體中開展研究；③分子遺傳標記不受個體年齡、性別和環(huán)境等因素限制，提高了育種的速度和效果；④基因的明確性，可確定所有基因型[2-3]。根據(jù)不同原理，分子標記可分為以下幾種：①以分子雜交為核心內容的技術，包括限制性片段長度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）、數(shù)目可變串聯(lián)重復多態(tài)性（Variable number of tandem repeats，VNTR）。限制性片段長度多態(tài)性是指同種生物不同個體間DNA 序列產(chǎn)生差異，形成可被限制性內切酶識別的序列進而可被消化，被消化后的產(chǎn)物由于長度不同可通過電泳進行分型[4]。數(shù)目可變串聯(lián)重復多態(tài)性是多態(tài)性程度高，重復性高的DNA 片段，分布廣并且種類多，又分為微衛(wèi)星序列（又稱簡單重復序列）和小衛(wèi)星序列[5]；②以PCR 為核心的分子標記技，包括隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNAs，RAPD）[6]，擴增片段長度多態(tài)性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）[7]等；③第三種是較為新穎的分子標記，如單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）、表達序列標簽（Expressed Sequence Tags，EST）[8]。依靠PCR、電泳等技術對重要基因進行分型來研究基因表達和調控規(guī)律逐漸不足以滿足育種需求，基因芯片的產(chǎn)生，很大程度上改善了這一問題。

1.2 基因芯片

基因芯片（gene chip）又可稱為DNA 微陣列（DNA microarray），是一種通過在固體支持物上設置成千上萬的核酸探針，將檢測樣本置于芯片上進行雜交，檢測信號確定受檢個體的遺傳信息[9]。20 世紀80年代，研究者們參考計算機芯片將寡核苷酸分子固定在固相載體上，制成首個芯片[10]?；蛐酒鶕?jù)不同標準具有不同分類，例如依據(jù)固相載體上的探針種類可分為cDNA 芯片和寡核苷酸芯片[11]；根據(jù)不同固相載體可分為玻璃芯片、硅芯片等；根據(jù)其功能還可以分為DNA 測序芯片、表達譜芯片等[12]。目前，單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）芯片廣泛引用在家畜育種工作中，包括品種起源、群體組成和功能分析等。

1.3 基因組選擇

2009 年，牛基因組的公布標志著研究者們對牛的研究將進入新階段[13]。牛基因組涵蓋了至少22000 個基因，其中14345 個基因與其他7 個哺乳動物存在同源關系。全基因組中存在高密度特異性區(qū)域，泌乳與免疫方面存在物種特異性變異，這為后續(xù)牛全基因組方面的研究打下堅實基礎。在此之后，不同版本的牛參考基因組相繼公布——Bos taurus5.0、UMD 3.1.1 和ARS-UCD1.2。緊接著，以?；蚪M為核心，研究者們結合全基因組重測序分析和基因芯片技術將分子育種帶入了全基因組選擇育種階段。全基因組選擇（genomic selection，GS）是指通過對覆蓋全基因組范圍的遺傳標記進行檢測，利用獲取的遺傳信息從基因組水平出發(fā)對家畜個體不同性狀進行育種值估計（genomic breeding values，GEBV）和選擇[14]。利用全基因組選擇確定的數(shù)量性狀基因座（quantitative trait loci，QTL）能夠更為準確地估計個體育種值，進而極大地促進育種工作并降低成本[15]。

2 分子育種的特點及優(yōu)勢

1974 年，第一代分子標記RFLP 的提出，標志著對DNA 的研究進入了全新的階段，擴大了人類疾病、動物育種工作的視野[16]，在此之前，動物育種依靠傳統(tǒng)的育種方式，通過觀察良好表型的個體作為種用，依靠不同品種間的雜交實現(xiàn)了“基因重組”，實現(xiàn)雜交改良的目的。但是傳統(tǒng)育種方式不可避免地會出現(xiàn)雜交后產(chǎn)生的后代優(yōu)良性狀不固定，效率不高，成本大等問題，這大大阻礙了家畜的育種工作。隨著分子標記概念及技術的提出和發(fā)展，家畜育種的準確性和效率都得到了極大的提升。分子標記借助其DNA 水平的特點，突破了對育種目標性別、年齡的限制，并且通過對優(yōu)良性狀候選基因的準確篩選，避免遇到傳統(tǒng)育種可能出現(xiàn)的問題。傳統(tǒng)育種可能需要大量的樣本、嘗試得到理想的個體，但分子標記技術的定向選擇可以在家畜育種過程中實現(xiàn)特定性狀基因快速、高效選育，獲得高產(chǎn)、抗病的家畜品種[17]，這主要體現(xiàn)了分子標記的幾個特點：①分子標記的基礎是家畜DNA 多態(tài)性，而這種多態(tài)性在家畜DNA 序列上普遍且大量存在[18]。在家畜DNA 復制等過程中，多態(tài)性的發(fā)生對家畜個體表型產(chǎn)生了不同的影響，而這種變化越多，不同個體間的差異表現(xiàn)就越大；②動物表型受到遺傳因素和環(huán)境因素的共同作用，傳統(tǒng)育種受環(huán)境、個體年齡和性別等因素影響較大，但是分子標記打破了這一限制[19]；③共顯性，由于等位基因的存在，使得基因存在雜合子和純合子的區(qū)別，而分子標記可以較為準確地判斷基因型。

雖然基因芯片最初還是以雜交為核心，依舊存在制作煩瑣，不利于大樣本數(shù)量檢測，但是隨著分子技術和基因組學的發(fā)展，它實現(xiàn)了可以在同一時間對大量的DNA 片段進行分析，操作簡潔且效率高，需要的組成成分少也使得在制作使用期間產(chǎn)生的損耗污染少，這一進步極大地提高了基因芯片使用性能。而隨著各國公司相繼進行基因芯片開發(fā)研究，牛上不同密度基因芯片相繼問世，包括由Illumina 開發(fā)的位點數(shù)為50K 的Bovine SNP50 芯片和777K 位點數(shù)的Bovine HD 芯片，Affymetrix 的648KGenome-Wide BOS1 Bovine Array[20]。

基于基因組遺傳信息的全基因組選擇作為目前最新的育種技術，并非摒棄了之前的育種技術，相反，更是與表型、系譜和芯片等技術相結合，準確高效地實現(xiàn)育種值估計、個體選擇等目標。由于全基因組選擇基于家畜基因組信息可以提前對具有控制或影響優(yōu)良性狀遺傳信息的個體進行準確篩選，提高了品種改良的速度；其次，結合表型和系譜信息，可獲取更準確地育種值，更全面地定位品種中的優(yōu)秀個體。全基因組選擇損耗低，效率高，高效、準確地選擇極大推動了育種工作[21]。

3 分子育種在黃牛育種中的應用

黃牛養(yǎng)殖是畜牧業(yè)經(jīng)濟中的重要組成部分，而在整個黃牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展中，育種問題占據(jù)至關重要的地位。

3.1 肉牛

隨著政策、技術的發(fā)展和進步，我國肉牛的養(yǎng)殖方式從落后的農(nóng)戶散養(yǎng)逐漸過渡到規(guī)?；⒓s化的大規(guī)模高新技術養(yǎng)殖方式，分子育種充分發(fā)揮分子生物學和現(xiàn)代遺傳學優(yōu)勢，為大規(guī)模技術養(yǎng)殖提供強有力的支撐。產(chǎn)仔率作為肉牛繁殖方面的重要性狀，是提高肉牛繁殖性能的重要內容。自然條件下，牛雙胎率低，即使母牛能產(chǎn)下雙胎，犢牛成活率也非常低，這對肉牛養(yǎng)殖造成了極大的限制。雷雪芹等通過PCR-RFLP 標記研究發(fā)現(xiàn)FSHR 基因在秦川牛和中國荷斯坦奶牛中雙胎優(yōu)勢基因型不同[22]。在肉牛養(yǎng)殖過程中，除了布魯氏桿菌病外，還有一種重要的人畜共患病會對產(chǎn)業(yè)、社會安全造成極大損害——牛結核病。AFLP 技術汲取了RFLP 技術和PCR 技術的穩(wěn)定、準確和高效，曾廣泛應用于品種鑒定、DNA 指紋圖譜構建方面。楊興元等利用AFLP 技術獲取了具有良好多態(tài)性的西門塔爾牛、延邊牛和南陽牛的指紋圖譜，并進行比對后發(fā)現(xiàn)3 個品種之間存在明顯差異[23]。曹瑞等通過MIRU-VNTR 方法對30 株新疆地區(qū)的牛分枝桿菌進行分型研究，發(fā)現(xiàn)新疆地區(qū)牛分枝桿菌與其他地區(qū)的分枝桿菌多態(tài)性存在差異，這可能作為新疆地區(qū)肉牛養(yǎng)殖過程中檢測牛結核病的輔助標記之一[24]。

單核苷酸多態(tài)性作為目前分子標記研究方面廣泛使用的技術之一，已為肉牛育種提供了豐富的內容，而相關技術的進步也使得SNP 檢測豐富多樣。楊穎等利用PCR-SSCP 和DNA 測序比對對南陽牛HDAC1基因的多態(tài)位點與經(jīng)濟性狀進行關聯(lián)分析，結果表明HDAC1 基因第11 外顯子與3’ UTR 區(qū)域的SNP 與尻長、十字部高和體高等性狀顯著相關[25]。有研究通過結合全基因組關聯(lián)分析（GWAS）和基因注釋等方法，根據(jù)西門塔爾牛高密度芯片篩選西門塔爾牛SNPs，設計構建準確性高、低成本的低密度芯片，解析西門塔爾牛重要經(jīng)濟性狀遺傳信息，推動肉用西門塔爾牛育種工作[26]。全基因組測序技術的加入，使DNA 多態(tài)性研究進入新的階段。張順進等通多對郟縣紅牛全基因組測序，并將結果與參考基因組比對，獲得涵蓋全基因組內容的單核苷酸多態(tài)性（SNP），獲取郟縣紅牛遺傳變異圖譜，為進一步挖掘郟縣紅牛經(jīng)濟性狀重要候選基因提供參考資料[27]。容維中結合PCR-SSCP 和熒光定量PCR 技術檢測早勝牛CAPN1基因和CD36 基因8 個SNP 位點共22 種基因型，確定了CAPN1 基因和CD36 基因早勝牛優(yōu)勢基因型[28]。

3.2 奶牛

據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計，2021 年我國乳制品進口量增加18.7%，生鮮乳產(chǎn)量增加7.1%[29]，盡管產(chǎn)量相比于2020 年有所增加，奶牛品種改良培育依舊是我國奶牛行業(yè)的重要工作，依靠分子標記、全基因組選擇、全基因組關聯(lián)分析等技術，育種工作者在奶牛產(chǎn)奶性能、繁殖、抗應激等方面已取得了重要進展。李艷華通過基因組測序結合系譜信息、DHI 記錄等發(fā)現(xiàn)DDIT3、RPL23A 等4 個基因共35 個SNPs 和3 個Indels，同時單標記關聯(lián)分析表明以上標記均與產(chǎn)奶性狀顯著相關[30]。Bohlouli 等注意到乳脂肪酸含量與奶牛對氣候變化適應相關，利用全基因組關聯(lián)分析，結合SNP 標記、系譜和基因組信息，鑒定出與奶牛抗病相關基因，并且發(fā)現(xiàn)乳脂肪酸生成與奶牛熱應激遺傳機制有重要相關性[31]。王夢琦等對奶牛LF 基因的兩個多態(tài)位點檢測，并利用多因素方差分析法等方法進行關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)兩個位點分別于體細胞評分（somatic cell score，SCS）、乳脂率和日產(chǎn)奶量相關[32]。Bo Han 等通過RNA 測序分析，以及GO 和KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)LPIN1 基因與奶牛產(chǎn)奶性狀相關，存在7 個SNP位點，關聯(lián)分析結果表明與乳脂率、乳蛋白率等性狀相關[33]。Penagaricano 利用全基因組關聯(lián)分析了1755頭公牛的公畜受孕率和牛基因組涵蓋的38650 個單核苷酸多態(tài)性（SNP），使用混合線性模型關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)存在8 個SNP 與公畜受孕率顯著相關，其中有SNP 處于雄性繁殖性能相關基因附近，包括精子頂體反應、精子發(fā)生過程中的染色質重塑以及男性生殖細胞成熟過程中的減數(shù)分裂過程[34]。其中一些SNP 表現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢效應，這為提高奶牛繁殖性能提供了更多參考。除了以上研究，不育是奶牛淘汰和經(jīng)濟損失的主要原因。信號轉導和轉錄激活因子（STAT）蛋白是在生育力和早期胚胎發(fā)育以及許多其他功能中發(fā)揮重要作用的轉錄因子，STAT1 和STAT3 基因是該途徑的成員。Khatib 等根據(jù)第7 天的囊胚數(shù)量計算胚胎早期成活率，利用單SNP 分析發(fā)現(xiàn)STAT3 基因存在兩個SNP 為SNP 25402 和SNP（SNP19069/SNP254 02）與卵母細胞受精率相關，其次，兩個SNP 位點之間存在相互作用，對胚胎存活率有顯著影響[35]。

4 小結

我國具有豐富的黃牛種質資源，并且具有多種品種優(yōu)勢，具有豐富的遺傳多樣性、較強的環(huán)境適應能力和抗病性、肉品質好、風味佳等特點。長期以來，通過引進國外優(yōu)秀肉牛品種與我國本地黃牛品種雜交，選育出了不同用途（肉用、乳用）的品種。但是我國牛肉市場需求巨大，雜交管理體系不健全，部分品種雜交較為盲目和混亂，使得我國本土黃牛資源受到了威脅，牛肉供應嚴重不足，導致我國牛肉非常依賴進口。分子標記具有準確、高效選育的優(yōu)點，在此基礎上基因芯片在選擇范圍和效率上具有更好的表現(xiàn)，基于基因組學的全基因組選擇更是作為目前最新的育種技術將育種精確度和品種改良速度提高到了新的水平。分子育種是提高我國黃牛品種生長、生產(chǎn)和繁殖性能的重要手段，通過將分子育種技術與其他飼養(yǎng)管理技術相結合“保持本土品種獨有的特性，改善固有的缺陷”，揚長補短，是目前我國黃牛育種，乃至農(nóng)業(yè)反芻動物種質資源工作的重要內容。