OsESV1基因?qū)λ镜矸酆铣傻挠绊?/h1>
2022-03-17 12:08:38王永祥燕海剛徐含聰傅玉雙單壯壯胡曉晴張文偉江玲
中國水稻科學(xué) 2022年2期
王永祥 燕海剛 徐含聰 傅玉雙 單壯壯 胡曉晴 張文偉 江玲
基因?qū)λ镜矸酆铣傻挠绊?/p>
王永祥 燕海剛 徐含聰 傅玉雙 單壯壯 胡曉晴 張文偉*江玲
(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省植物基因工程技術(shù)研究中心, 南京 210095;*通信聯(lián)系人, E-mail: zhangww@njau.edu.cn)
【】研究水稻()基因?qū)λ镜矸鄞x的影響?！尽客ㄟ^CRISPR-Cas9技術(shù)獲得突變體，考查的表型及胚乳淀粉的理化特性，分析的表達(dá)特性及相關(guān)功能?！尽縊sESV1蛋白在植物界中十分保守。突變體株高、穗長、每穗粒數(shù)低于野生型，分蘗數(shù)顯著多于野生型，葉片中淀粉含量顯著下降，籽粒中的直鏈淀粉含量上升，而總淀粉含量無明顯變化。呈組成型表達(dá)，并且具有晝夜節(jié)律表達(dá)的特征。OsESV1蛋白定位在葉綠體內(nèi)且呈點(diǎn)狀分布。酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明OsESV1蛋白可以與ADP-葡萄糖焦磷酸化酶小亞基(OsAGPS) 2a和OsAGPS1互作?！尽炕蛴绊懰救~片的淀粉合成途徑，而對胚乳淀粉合成的影響不明顯。
水稻；淀粉；胚乳；；互作
水稻是中國的第一大糧食作物，國內(nèi)有65%以上的人口以稻米為主食[1]。淀粉是稻米的主要成分，其含量、組成與水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)直接相關(guān)[2]。稻米淀粉在胚乳細(xì)胞中合成，已知多種酶參與合成[3-6]。水稻中還克隆了多個(gè)粉質(zhì)胚乳基因[7-22]，這些基因均能影響胚乳中淀粉合成，說明除淀粉合成酶之外，還有很多因子參與胚乳淀粉積累。因此，挖掘新的淀粉合成相關(guān)基因?qū)τ谏钊肓私獾矸酆铣傻姆肿訖C(jī)制，以及提高水稻產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。
研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中淀粉顆粒結(jié)合蛋白ESV1能調(diào)控葉片中淀粉的降解速度[23]。與野生型相比，葉片在白天的淀粉積累量下降，夜晚的淀粉降解速率增加。同時(shí)，根冠、莖、花和角果中的淀粉含量均低于野生型。與野生型相比，葉片中的淀粉顆粒邊緣呈波浪形或有裂紋，過表達(dá)ESV1則明顯提高了葉片淀粉含量，產(chǎn)生更厚、更大的淀粉顆粒。對支鏈淀粉鏈長分布的影響很小，但ESV1的缺失和過表達(dá)均提高了葉片的直鏈淀粉含量。ESV1同時(shí)存在于葉片總蛋白的可溶性和不溶性（淀粉結(jié)合）部分，白天淀粉顆粒生長時(shí)，ESV1可與之結(jié)合；晚上淀粉降解時(shí)，ESV1則被釋放至葉綠體基質(zhì)中[23]。由于ESV1不含有任何已知結(jié)構(gòu)域，推測它可能有利于淀粉的半晶體片層結(jié)構(gòu)形成，從而限制淀粉水解酶接近淀粉，葉片中淀粉結(jié)構(gòu)的有序性降低，導(dǎo)致淀粉易被水解酶降解，因而增加了淀粉降解的速度。已證實(shí)ESV1影響特定水解酶在淀粉顆粒表面的作用[24]。
綜上所述，擬南芥的研究主要集中于對葉片淀粉合成和降解的影響。為探究水稻同源基因?qū)ε呷榈矸酆铣傻挠绊懀狙芯坷肅RISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，構(gòu)建了突變體材料，考查了其表型及胚乳淀粉的理化特性，初步分析在淀粉合成中的功能及其作用機(jī)制，為深入研究對淀粉合成的影響奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料來源與種植條件
突變體源自粳稻品種W017，采用CRISPR-Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因敲除獲得。參照汪秉琨等[25]的方法，設(shè)計(jì)靶位點(diǎn)為AGCACCTGGTACA GGGAGAGTGG，構(gòu)建CRISPR/Cas9載體，并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染W(wǎng)017愈傷組織，篩選培養(yǎng)獲得T0轉(zhuǎn)基因植株[26]。經(jīng)潮霉素鑒定為陽性的植株，采用CTAB法提取葉片DNA[27]，并用特異性的引物（表1）擴(kuò)增獲得PCR產(chǎn)物，測序確定突變位點(diǎn)。突變體經(jīng)加代繁育得到純合種子。2020年正季，將野生型和突變體種植在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)牌樓基地，冬季種植在海南陵水基地。
1.2 進(jìn)化樹構(gòu)建和生物信息分析
參照水稻基因組注釋計(jì)劃數(shù)據(jù)庫(http://rice. plantbiology.msu.edu/)網(wǎng)站提供的水稻基因 ()序列信息，在NCBI (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/)網(wǎng)站下載獲得不同物種的ESV1同源蛋白序列，利用MEGA6.0軟件中鄰位相連法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(Bootstrap=1000)，同時(shí)利用ClustalX2和Genedoc軟件進(jìn)行OsESV1及其同源蛋白的氨基酸序列比對。利用 SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP-4.1/)網(wǎng)站進(jìn)行信號肽預(yù)測，基于PROSITE數(shù)據(jù)庫 (https://www.expasy.org/)進(jìn)行OsESV1蛋白結(jié)構(gòu)的分析。
1.3 葉片的碘染和淀粉含量測定
野生型和幼苗在人工氣候箱中（28℃，光照12 h）生長至4周，分別取白天和夜晚結(jié)束時(shí)的葉片，用無水乙醇浸泡，沸水浴20 min除去葉綠素后，用Lugol solution (Sigma)染色10 min，再用水浸泡1 h后觀察。生長6周齡的葉片用液氮研磨后80℃下干燥24 h，同上脫色除去葉綠素，采用Megazyme公司的K-TSTA淀粉總量檢測試劑盒測定總淀粉含量[28]。
1.4 農(nóng)藝性狀考查及種子胚乳理化特性分析
選取野生型和(T2代) 成熟植株各10株，考查株高、穗長、分蘗數(shù)、每穗粒數(shù)、一次枝梗數(shù)和千粒重等農(nóng)藝性狀。
成熟種子去除穎殼，磨成精米粉過篩（100目），50℃下烘至恒重。使用Megazyme公司生產(chǎn)的總淀粉檢測試劑盒TSTA進(jìn)行胚乳總淀粉含量的測定。參照《農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)米質(zhì)測定方法：NY147?88》測定胚乳直鏈淀粉含量。精確稱量3 g精米粉，加入25 mL的蒸餾水，使用快速黏度分析儀(Rapid Visco Analyser，瑞典Perten)測定米粉的黏度特性[29]。
1.5 組織表達(dá)模式分析
水稻開花期間，下午對野生型的各個(gè)組織進(jìn)行取樣，并取花后3～24 d的穎果，液氮保存，用于的組織表達(dá)分析。在夜晚結(jié)束時(shí)，選取人工氣候箱中（28℃，光照12 h）生長至4周的野生型幼苗3株，每隔4 h采集一次葉片至24 h，用于的節(jié)律表達(dá)分析。
使用天根公司的植物RNA提取試劑盒，提取野生型和突變體不同組織的RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT Reagent Kit, TaKaRa)的使用說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第1鏈。用寶生物染料法熒光定量試劑盒(SYBR premix Ex TaqTM, TaKaRa)，在PCR儀(C1000 TouchTMThermal Cycler, BIO-RAD)上運(yùn)行程序：95℃下30 s；95℃下5 s、60℃下30 s，39個(gè)循環(huán)；95℃下15 s、60℃下1 min，95℃下15 s。反應(yīng)體系為20 μL：5 μL cDNA模板，10 μmol/L正反向引物各2.5 μL，10 μL 2×SYBR Premix ExII。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以水稻作為內(nèi)參, 用2法計(jì)算相對表達(dá)水平[30]。所用引物見表1。
1.6 亞細(xì)胞定位
用野生型幼苗cDNA擴(kuò)增的全長cDNA序列，并克隆到pAN580載體中，獲得pAN580-OsESV1-GFP載體（35S啟動(dòng)子），轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體并觀察定位[31]。同理構(gòu)建p1305-OsESV1-GFP融合載體（35S啟動(dòng)子），轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌并侵染4周齡煙草，48 h之后觀察定位[32]。使用Leica公司的SP8型激光共聚焦顯微鏡檢測熒光信號。所用引物見表1。
1.7 酵母雙雜
用野生型幼苗cDNA擴(kuò)增OsESV1、OsAGPS1、OsAGPS2a、OsAGPS2b、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亞基(OsAGPL) 1、可溶性淀粉合成酶(SS)Ⅰ、SSⅡa、SSⅡb、淀粉分支酶(BE)Ⅰ及BEⅡb的cDNA序列，分別克隆到pGADT7或pGBKT7載體上，并將不同的載體組合共轉(zhuǎn)到酵母AH109中，在二缺培養(yǎng)基 (SD/-Leu/-Trp)上30℃培養(yǎng)2～3 d后，挑菌在四缺培養(yǎng)基(SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade)上進(jìn)行篩選。pGADT7和pGBKT7載體購自Clontech公司，按照試劑盒的方法進(jìn)行酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化。所用引物見表1。
表1 實(shí)驗(yàn)所用引物
1.8 雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)
將、和全長cDNA序列分別克隆到p2YC和p2YN載體上，參照1.6方法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后侵染4周齡煙草，48 h后用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光信號[32]。所用引物的信息列于表1。
2 結(jié)果與分析
2.1 OsESV1及其同源蛋白的保守性分析。
進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，ESV1蛋白在植物中普遍存在，并且水稻中的OsESV1與擬南芥AtESV1高度同源（圖1-A），氨基酸序列比結(jié)果表明，OsESV1蛋白與擬南芥、玉米和亞洲棉ESV1同源蛋白均包含一段高度保守的富含色氨酸的序列，并且在C端有一段富含脯氨酸的序列，N端的序列相似度不高（圖1-B）。這種保守性說明ESV1在植物中具有比較基礎(chǔ)的功能。
2.2 osesv1的基因突變
水稻基因含11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子（圖2-A），編碼含431個(gè)氨基酸殘基的蛋白（圖2-B）。生物信息學(xué)分析表明，OsESV1沒有信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)域。為了研究的功能，采用CRISPR-Cas9系統(tǒng)獲得了兩種基因編輯形式的突變體（圖2-C）。測序結(jié)果表明，突變體中的第3個(gè)外顯子有11個(gè)堿基的缺失，突變體中的第3個(gè)外顯子有1個(gè)單堿基的插入（圖2-A）基因的這兩種編輯類型均導(dǎo)致移碼突變和翻譯的提前終止，因此均編碼缺失富含色氨酸區(qū)和富含脯氨酸區(qū)的截短蛋白（圖2-B）。qRT-PCR結(jié)果表明，突變體中的表達(dá)在白天和晚上結(jié)束時(shí)均顯著低于野生型（圖2-D）。
成熟植株的株高、穗長和每穗粒數(shù)均顯著低于野生型，而分蘗數(shù)顯著高于野生型，千粒重則無明顯差異（表2）。由于淀粉代謝缺陷，突變植株表現(xiàn)嚴(yán)重的發(fā)育異常和形態(tài)缺陷[23]，但植株未出現(xiàn)明顯的發(fā)育異常（圖2-C）。
A—OsESV1及其同源蛋白的進(jìn)化樹分析，蛋白名采用相應(yīng)的GenBank 序列登錄號；B—多氨基酸序列比對，星號表示20個(gè)氨基酸的間隔，淺紅色區(qū)域?yàn)楦缓彼?W)區(qū)，保守色氨酸殘基下用“：”標(biāo)注，黃色區(qū)域?yàn)楦缓彼?P)區(qū)。
Fig. 1. The conservation analysis of OsESV1.
2.3 osesv1對葉片中淀粉合成的影響
對野生型和突變體的葉片進(jìn)行碘染色分析，發(fā)現(xiàn)在白天和夜晚結(jié)束時(shí)，突變體葉片的碘染色程度均比野生型淺，說明葉片中的淀粉含量低于野生型（圖3-A）。淀粉含量測定結(jié)果也證實(shí)葉片中的淀粉含量顯著低于野生型（圖3-B）。
2.4 osesv1對種子中淀粉合成的影響
對野生型及突變體成熟種子進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)突變體種子外觀無明顯變化（圖4-A）。種子的總淀粉含量無明顯變化，但直鏈淀粉含量顯著升高（圖4-B、C），這一點(diǎn)與突變體相似。RVA分析表明，野生型與突變體胚乳淀粉的黏度曲線呈現(xiàn)相似的趨勢（圖4-D）。
2.5 OsESV1基因的表達(dá)分析
基于的突變表型，我們首先對的組織表達(dá)譜進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，基因在水稻的根、莖、葉、葉鞘、幼穗中都有表達(dá)，且在花后12 d的胚乳中表達(dá)較高（圖5-A）。同時(shí)對晝夜節(jié)律表達(dá)的分析表明，在黎明時(shí)表達(dá)量上升達(dá)到最高峰，表達(dá)量是其他時(shí)間點(diǎn)的40倍以上，而其他時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均較低（圖5-B），表明該基因的表達(dá)具有晝夜節(jié)律性。
A—OsESV1的基因結(jié)構(gòu)。深灰和淺灰方塊分別表示外顯子區(qū)域和UTR區(qū)域，方塊之間的黑色連線表示內(nèi)含子，下面為野生型和osesv1靶位點(diǎn)基因序列比較，連續(xù)的點(diǎn)表示缺失的序列，插入的堿基加粗標(biāo)示，紅色標(biāo)注為原間隔基序(protospacer adjacent motif , PAM) TGG；B—野生型和突變體的OsESV1蛋白結(jié)構(gòu)。箭頭標(biāo)注富含色氨酸區(qū)（Trp-rich region）和富含脯氨酸區(qū)（Pro-rich region）；C—野生型和osesv1植株，標(biāo)尺為10 cm；D—野生型和osesv1幼苗在白天和夜晚結(jié)束時(shí)OsESV1基因的表達(dá)水平。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)。*和**分別表示差異達(dá)0.05和0.01顯著水平（t檢驗(yàn)）。下同。
Fig. 2. Phenotype of themutants.
表2 野生型和osesv1的農(nóng)藝性狀
數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差（=10）。
Values are means ± SD (=10).
2.6 OsESV1定位于葉綠體
通過UniProt (https://www.uniprot.org/)網(wǎng)站預(yù)測，OsESV1蛋白定位于葉綠體。為了確認(rèn)OsESV1的亞細(xì)胞定位，在水稻原生質(zhì)體中瞬時(shí)表達(dá)OsESV1-GFP。結(jié)果表明，OsESV1-GFP融合蛋白定位于葉綠體內(nèi)，呈點(diǎn)狀分布（圖6-A）。同樣，OsESV1-GFP在煙草表皮細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，也是在葉綠體內(nèi)呈點(diǎn)狀分布（圖6-B）。
A—白天和夜晚結(jié)束時(shí)野生型(WT)和osesv1葉片的碘染觀察; B—白天和夜晚結(jié)束時(shí)野生型(WT)和osesv1葉片的淀粉含量測定。
Fig. 3. Starch contents in leaves of WT and
A—野生型(WT)和osesv1的成熟種子表型，標(biāo)尺為5 mm；B, C—野生型(WT)和osesv1種子總淀粉含量、直鏈淀粉含量；D—野生型和osesv1胚乳淀粉的黏度曲線。
Fig. 4. Phenotype ofgrains andphysicochemical properties of endosperm starch
2.7 OsESV1與OsAGP互作
在突變體中，白天結(jié)束時(shí)葉片中的淀粉含量顯著低于野生型。為探討對淀粉合成途徑存在的可能影響，將OsESV1與一系列淀粉合成酶進(jìn)行酵母雙雜。結(jié)果表明，OsESV1可以與OsAGPS2a和OsAGPS1在酵母細(xì)胞中互作（圖7）。OsAGP是淀粉合成的限速酶，為淀粉合成提供前體物質(zhì)ADP葡萄糖[4, 6]。水稻中OsAGP的小亞基包括OsAGPS1和OsAGPS2兩種亞型，OsAGPS1主要存在于胚乳的造粉體中，OsAGPS2a主要存在于葉片的葉綠體中[33-34]。
2.8 OsESV1與OsAGP互作的驗(yàn)證
我們利用雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(BiFC)來進(jìn)一步驗(yàn)證OsESV1與OsAGPS2a和OsAGPS1的互作。結(jié)果表明，在煙草表皮細(xì)胞中的葉綠體中，OsESV1可以分別與OsAGPS2a和OsAGPS1互作，并且熒光在葉綠體內(nèi)呈點(diǎn)狀分布（圖8）。
A—OsESV1在野生型不同組織及胚乳發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)水平；B—OsESV1的晝夜節(jié)律表達(dá)。黑框和白框分別表示黑夜和白天的時(shí)間軸。
Fig. 5. Expression pattern of
A—OsESV1-GFP融合蛋白在水稻原生質(zhì)體中的表達(dá)，pAN580-GFP空載體作為對照，標(biāo)尺為20 μm；B—OsESV1-GFP融合蛋白在煙草表皮細(xì)胞中的表達(dá)，p1305-GFP空載體作為對照，標(biāo)尺為20 μm。
Fig. 6. Subcellular localization of OsESV1.
二缺：SD-Leu/-Trp；四缺：SD-Leu/-Trp/-His/-Ade。
Fig. 7. Yeast two-hybrid assays show that OsESV1 can interact with OsAGPS2a and OsAGPS1.
3 討論
本研究采用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)獲得了突變體，并對基因的功能進(jìn)行了初步的研究。與野生型相比，和葉片中的淀粉含量在白天結(jié)束時(shí)分別減少了22%和52%（圖3-B），但成熟種子的淀粉含量并沒有明顯變化（圖4-B），因而與不同(突變對種子中的淀粉合成沒有明顯影響)。類似的報(bào)道還有擬南芥)在水稻中的同源基因()[28]。研究發(fā)現(xiàn)，PTST1作為腳手架蛋白，能介導(dǎo)顆粒結(jié)合淀粉合酶（granule bound starch synthase, GBSS）靶定到淀粉顆粒上，后者直接負(fù)責(zé)直鏈淀粉的合成。在擬南芥突變體葉片中，靶定到淀粉顆粒上的GBSS變少，葉片中幾乎檢測不到直鏈淀粉[35]。水稻突變體葉片中也幾乎不含直鏈淀粉，但是胚乳中直鏈淀粉的含量沒有明顯變化，且多數(shù)GBSS蛋白仍能與胚乳中的淀粉結(jié)合[36]。突變導(dǎo)致葉片與籽粒表型的差異，與本研究報(bào)道的相似。
Bars = 10 μm.
Fig. 8. BiFC assays show that OsESV1 can interact with OsAGPS2a and OsAGPS1 in tobacco epidermal cells.
突變導(dǎo)致白天葉片中淀粉含量下降，作者認(rèn)為葉片淀粉合成的同時(shí)發(fā)生降解，所以淀粉含量下降[23]。本研究中的酵母雙雜和BiFC實(shí)驗(yàn)表明，OsESV1可與OsAGPS2a互作（圖7和圖8）。研究表明，OsAGPS2a在水稻葉片的淀粉合成中起到主要作用[33]。因此OsESV1與OsAGPS2a的互作，可能是OsESV1影響葉片淀粉合成的另一種方式。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，OsESV1還與OsAGPS1互作（圖7和圖8）。OsAGPS1與OsAGPL1形成異源四聚體，定位于胚乳造粉體內(nèi)，在胚乳發(fā)育早期的淀粉合成中起作用[34]。而水稻造粉體內(nèi)OsAGP活性只占胚乳OsAGP總活性的10%，主要由細(xì)胞質(zhì)中的OsAGP負(fù)責(zé)提供ADP-葡萄糖合成淀粉[37]，比如突變體籽粒的淀粉合成幾乎未受影響[38]，因此，造粉體中的AGP對于胚乳淀粉合成應(yīng)該是非必需的。我們推測，由于OsESV1與OsAGPS1在質(zhì)體上互作，而種子造粉體中的OsAGP對種子淀粉合成幾乎沒有影響，所以的突變對種子中的淀粉合成沒有明顯影響。
AtESV1可以結(jié)合淀粉顆粒，OsESV1與其高度同源，且兩者均在葉綠體內(nèi)呈點(diǎn)狀分布（圖6），推測OsESV1可能也具有結(jié)合淀粉顆粒的特性。OsESV1與OsAGPS2a和OsAGPS1互作的熒光在葉綠體內(nèi)也呈現(xiàn)點(diǎn)狀分布，可能是結(jié)合淀粉顆粒的形式（圖8）。我們通過分析發(fā)現(xiàn)OsAGP本身并沒有結(jié)合淀粉的典型結(jié)構(gòu)域或結(jié)合位點(diǎn)，是否OsAGPS2a與OsAGPS1借助OsESV1靶定到淀粉顆粒上，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。目前已有報(bào)道，一些淀粉綁定蛋白作為腳手架蛋白，介導(dǎo)淀粉代謝酶靶定到淀粉顆粒上，如FLOURY ENDOSPERM 6可能作為腳手架蛋白，與異淀粉酶（Isoamylase 1，ISA1）互作，調(diào)控ISA1與淀粉的結(jié)合[12]；PTST1介導(dǎo)GBSS靶向到淀粉顆粒[35]；LIKE SEX4 1介導(dǎo)β-淀粉酶定位于淀粉顆粒表面[39]。
綜上所述，可能與OsAGP互作，影響水稻的淀粉合成。我們下一步計(jì)劃獲得過表達(dá)基因的材料，進(jìn)一步探討在水稻淀粉合成中的作用。
謝 辭：農(nóng)業(yè)部長江中下游粳稻生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、長江流域雜交水稻協(xié)同創(chuàng)新中心、現(xiàn)代作物生產(chǎn)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心給予大力支持，謹(jǐn)致謝意。
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Effects ofon Starch Synthesis in Rice
WANG Yongxiang, YAN Hangang, XU Hancong, FU Yushuang, SHAN Zhuangzhuang, HU Xiaoqing, ZHANG Wenwei*, JIANG Ling
(State Key Laboratory for Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Jiangsu Plant Gene Engineering Research Center, Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095, China;*Corresponding author, E-mail: zhangww@njau.edu.cn)
【】It is important to reveal the role of() in starch metabolism of rice.【】Themutants were obtained by using the CRISPR-Cas9 system. The phenotype and the physicochemical properties of endosperm starch ofwere investigated. The expression pattern and function ofwere analyzed. 【】The OsESV1 protein was conserved inplants. Compared with the wildtype, themutants exhibited lower plant height, panicle length, and grain number per panicle, but higher tiller number. Though the starch contents inleavessignificantly decreased, the total starch contents ofgrains did not obviously altered and the amylose contents increased. The expression ofwas constitutive and rhythmic. OsESV1 was located in chloroplasts with a dot-like distribution. Yeast two-hybrid and bimolecular fluorescence complementation(BiFC) assays showed thatOsESV1 could interact with ADP glucose pyrophosphorylase small subunit (OsAGPS) 2a and OsAGPS1.【】significantly affects the starch synthesis pathway in rice leaves, while not in endosperm.
rice; starch; endosperm;; interaction
10.16819/j.1001-7216.2022.210308
2021-03-19；
2021-05-12。
國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(2016ZX08001006)；國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助項(xiàng)目（2016YFD0100101-08）。
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王永祥 燕海剛 徐含聰 傅玉雙 單壯壯 胡曉晴 張文偉 江玲
基因?qū)λ镜矸酆铣傻挠绊?/p>
王永祥 燕海剛 徐含聰 傅玉雙 單壯壯 胡曉晴 張文偉*江玲
(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省植物基因工程技術(shù)研究中心, 南京 210095;*通信聯(lián)系人, E-mail: zhangww@njau.edu.cn)
【】研究水稻()基因?qū)λ镜矸鄞x的影響?！尽客ㄟ^CRISPR-Cas9技術(shù)獲得突變體，考查的表型及胚乳淀粉的理化特性，分析的表達(dá)特性及相關(guān)功能?！尽縊sESV1蛋白在植物界中十分保守。突變體株高、穗長、每穗粒數(shù)低于野生型，分蘗數(shù)顯著多于野生型，葉片中淀粉含量顯著下降，籽粒中的直鏈淀粉含量上升，而總淀粉含量無明顯變化。呈組成型表達(dá)，并且具有晝夜節(jié)律表達(dá)的特征。OsESV1蛋白定位在葉綠體內(nèi)且呈點(diǎn)狀分布。酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明OsESV1蛋白可以與ADP-葡萄糖焦磷酸化酶小亞基(OsAGPS) 2a和OsAGPS1互作?！尽炕蛴绊懰救~片的淀粉合成途徑，而對胚乳淀粉合成的影響不明顯。
水稻；淀粉；胚乳；；互作
水稻是中國的第一大糧食作物，國內(nèi)有65%以上的人口以稻米為主食[1]。淀粉是稻米的主要成分，其含量、組成與水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)直接相關(guān)[2]。稻米淀粉在胚乳細(xì)胞中合成，已知多種酶參與合成[3-6]。水稻中還克隆了多個(gè)粉質(zhì)胚乳基因[7-22]，這些基因均能影響胚乳中淀粉合成，說明除淀粉合成酶之外，還有很多因子參與胚乳淀粉積累。因此，挖掘新的淀粉合成相關(guān)基因?qū)τ谏钊肓私獾矸酆铣傻姆肿訖C(jī)制，以及提高水稻產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。
研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中淀粉顆粒結(jié)合蛋白ESV1能調(diào)控葉片中淀粉的降解速度[23]。與野生型相比，葉片在白天的淀粉積累量下降，夜晚的淀粉降解速率增加。同時(shí)，根冠、莖、花和角果中的淀粉含量均低于野生型。與野生型相比，葉片中的淀粉顆粒邊緣呈波浪形或有裂紋，過表達(dá)ESV1則明顯提高了葉片淀粉含量，產(chǎn)生更厚、更大的淀粉顆粒。對支鏈淀粉鏈長分布的影響很小，但ESV1的缺失和過表達(dá)均提高了葉片的直鏈淀粉含量。ESV1同時(shí)存在于葉片總蛋白的可溶性和不溶性（淀粉結(jié)合）部分，白天淀粉顆粒生長時(shí)，ESV1可與之結(jié)合；晚上淀粉降解時(shí)，ESV1則被釋放至葉綠體基質(zhì)中[23]。由于ESV1不含有任何已知結(jié)構(gòu)域，推測它可能有利于淀粉的半晶體片層結(jié)構(gòu)形成，從而限制淀粉水解酶接近淀粉，葉片中淀粉結(jié)構(gòu)的有序性降低，導(dǎo)致淀粉易被水解酶降解，因而增加了淀粉降解的速度。已證實(shí)ESV1影響特定水解酶在淀粉顆粒表面的作用[24]。
綜上所述，擬南芥的研究主要集中于對葉片淀粉合成和降解的影響。為探究水稻同源基因?qū)ε呷榈矸酆铣傻挠绊懀狙芯坷肅RISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，構(gòu)建了突變體材料，考查了其表型及胚乳淀粉的理化特性，初步分析在淀粉合成中的功能及其作用機(jī)制，為深入研究對淀粉合成的影響奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料來源與種植條件
突變體源自粳稻品種W017，采用CRISPR-Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因敲除獲得。參照汪秉琨等[25]的方法，設(shè)計(jì)靶位點(diǎn)為AGCACCTGGTACA GGGAGAGTGG，構(gòu)建CRISPR/Cas9載體，并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染W(wǎng)017愈傷組織，篩選培養(yǎng)獲得T0轉(zhuǎn)基因植株[26]。經(jīng)潮霉素鑒定為陽性的植株，采用CTAB法提取葉片DNA[27]，并用特異性的引物（表1）擴(kuò)增獲得PCR產(chǎn)物，測序確定突變位點(diǎn)。突變體經(jīng)加代繁育得到純合種子。2020年正季，將野生型和突變體種植在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)牌樓基地，冬季種植在海南陵水基地。
1.2 進(jìn)化樹構(gòu)建和生物信息分析
參照水稻基因組注釋計(jì)劃數(shù)據(jù)庫(http://rice. plantbiology.msu.edu/)網(wǎng)站提供的水稻基因 ()序列信息，在NCBI (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/)網(wǎng)站下載獲得不同物種的ESV1同源蛋白序列，利用MEGA6.0軟件中鄰位相連法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(Bootstrap=1000)，同時(shí)利用ClustalX2和Genedoc軟件進(jìn)行OsESV1及其同源蛋白的氨基酸序列比對。利用 SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP-4.1/)網(wǎng)站進(jìn)行信號肽預(yù)測，基于PROSITE數(shù)據(jù)庫 (https://www.expasy.org/)進(jìn)行OsESV1蛋白結(jié)構(gòu)的分析。
1.3 葉片的碘染和淀粉含量測定
野生型和幼苗在人工氣候箱中（28℃，光照12 h）生長至4周，分別取白天和夜晚結(jié)束時(shí)的葉片，用無水乙醇浸泡，沸水浴20 min除去葉綠素后，用Lugol solution (Sigma)染色10 min，再用水浸泡1 h后觀察。生長6周齡的葉片用液氮研磨后80℃下干燥24 h，同上脫色除去葉綠素，采用Megazyme公司的K-TSTA淀粉總量檢測試劑盒測定總淀粉含量[28]。
1.4 農(nóng)藝性狀考查及種子胚乳理化特性分析
選取野生型和(T2代) 成熟植株各10株，考查株高、穗長、分蘗數(shù)、每穗粒數(shù)、一次枝梗數(shù)和千粒重等農(nóng)藝性狀。
成熟種子去除穎殼，磨成精米粉過篩（100目），50℃下烘至恒重。使用Megazyme公司生產(chǎn)的總淀粉檢測試劑盒TSTA進(jìn)行胚乳總淀粉含量的測定。參照《農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)米質(zhì)測定方法：NY147?88》測定胚乳直鏈淀粉含量。精確稱量3 g精米粉，加入25 mL的蒸餾水，使用快速黏度分析儀(Rapid Visco Analyser，瑞典Perten)測定米粉的黏度特性[29]。
1.5 組織表達(dá)模式分析
水稻開花期間，下午對野生型的各個(gè)組織進(jìn)行取樣，并取花后3～24 d的穎果，液氮保存，用于的組織表達(dá)分析。在夜晚結(jié)束時(shí)，選取人工氣候箱中（28℃，光照12 h）生長至4周的野生型幼苗3株，每隔4 h采集一次葉片至24 h，用于的節(jié)律表達(dá)分析。
使用天根公司的植物RNA提取試劑盒，提取野生型和突變體不同組織的RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT Reagent Kit, TaKaRa)的使用說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第1鏈。用寶生物染料法熒光定量試劑盒(SYBR premix Ex TaqTM, TaKaRa)，在PCR儀(C1000 TouchTMThermal Cycler, BIO-RAD)上運(yùn)行程序：95℃下30 s；95℃下5 s、60℃下30 s，39個(gè)循環(huán)；95℃下15 s、60℃下1 min，95℃下15 s。反應(yīng)體系為20 μL：5 μL cDNA模板，10 μmol/L正反向引物各2.5 μL，10 μL 2×SYBR Premix ExII。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以水稻作為內(nèi)參, 用2法計(jì)算相對表達(dá)水平[30]。所用引物見表1。
1.6 亞細(xì)胞定位
用野生型幼苗cDNA擴(kuò)增的全長cDNA序列，并克隆到pAN580載體中，獲得pAN580-OsESV1-GFP載體（35S啟動(dòng)子），轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體并觀察定位[31]。同理構(gòu)建p1305-OsESV1-GFP融合載體（35S啟動(dòng)子），轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌并侵染4周齡煙草，48 h之后觀察定位[32]。使用Leica公司的SP8型激光共聚焦顯微鏡檢測熒光信號。所用引物見表1。
1.7 酵母雙雜
用野生型幼苗cDNA擴(kuò)增OsESV1、OsAGPS1、OsAGPS2a、OsAGPS2b、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亞基(OsAGPL) 1、可溶性淀粉合成酶(SS)Ⅰ、SSⅡa、SSⅡb、淀粉分支酶(BE)Ⅰ及BEⅡb的cDNA序列，分別克隆到pGADT7或pGBKT7載體上，并將不同的載體組合共轉(zhuǎn)到酵母AH109中，在二缺培養(yǎng)基 (SD/-Leu/-Trp)上30℃培養(yǎng)2～3 d后，挑菌在四缺培養(yǎng)基(SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade)上進(jìn)行篩選。pGADT7和pGBKT7載體購自Clontech公司，按照試劑盒的方法進(jìn)行酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化。所用引物見表1。
表1 實(shí)驗(yàn)所用引物
1.8 雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)
將、和全長cDNA序列分別克隆到p2YC和p2YN載體上，參照1.6方法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后侵染4周齡煙草，48 h后用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光信號[32]。所用引物的信息列于表1。
2 結(jié)果與分析
2.1 OsESV1及其同源蛋白的保守性分析。
進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，ESV1蛋白在植物中普遍存在，并且水稻中的OsESV1與擬南芥AtESV1高度同源（圖1-A），氨基酸序列比結(jié)果表明，OsESV1蛋白與擬南芥、玉米和亞洲棉ESV1同源蛋白均包含一段高度保守的富含色氨酸的序列，并且在C端有一段富含脯氨酸的序列，N端的序列相似度不高（圖1-B）。這種保守性說明ESV1在植物中具有比較基礎(chǔ)的功能。
2.2 osesv1的基因突變
水稻基因含11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子（圖2-A），編碼含431個(gè)氨基酸殘基的蛋白（圖2-B）。生物信息學(xué)分析表明，OsESV1沒有信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)域。為了研究的功能，采用CRISPR-Cas9系統(tǒng)獲得了兩種基因編輯形式的突變體（圖2-C）。測序結(jié)果表明，突變體中的第3個(gè)外顯子有11個(gè)堿基的缺失，突變體中的第3個(gè)外顯子有1個(gè)單堿基的插入（圖2-A）基因的這兩種編輯類型均導(dǎo)致移碼突變和翻譯的提前終止，因此均編碼缺失富含色氨酸區(qū)和富含脯氨酸區(qū)的截短蛋白（圖2-B）。qRT-PCR結(jié)果表明，突變體中的表達(dá)在白天和晚上結(jié)束時(shí)均顯著低于野生型（圖2-D）。
成熟植株的株高、穗長和每穗粒數(shù)均顯著低于野生型，而分蘗數(shù)顯著高于野生型，千粒重則無明顯差異（表2）。由于淀粉代謝缺陷，突變植株表現(xiàn)嚴(yán)重的發(fā)育異常和形態(tài)缺陷[23]，但植株未出現(xiàn)明顯的發(fā)育異常（圖2-C）。
A—OsESV1及其同源蛋白的進(jìn)化樹分析，蛋白名采用相應(yīng)的GenBank 序列登錄號；B—多氨基酸序列比對，星號表示20個(gè)氨基酸的間隔，淺紅色區(qū)域?yàn)楦缓彼?W)區(qū)，保守色氨酸殘基下用“：”標(biāo)注，黃色區(qū)域?yàn)楦缓彼?P)區(qū)。
Fig. 1. The conservation analysis of OsESV1.
2.3 osesv1對葉片中淀粉合成的影響
對野生型和突變體的葉片進(jìn)行碘染色分析，發(fā)現(xiàn)在白天和夜晚結(jié)束時(shí)，突變體葉片的碘染色程度均比野生型淺，說明葉片中的淀粉含量低于野生型（圖3-A）。淀粉含量測定結(jié)果也證實(shí)葉片中的淀粉含量顯著低于野生型（圖3-B）。
2.4 osesv1對種子中淀粉合成的影響
對野生型及突變體成熟種子進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)突變體種子外觀無明顯變化（圖4-A）。種子的總淀粉含量無明顯變化，但直鏈淀粉含量顯著升高（圖4-B、C），這一點(diǎn)與突變體相似。RVA分析表明，野生型與突變體胚乳淀粉的黏度曲線呈現(xiàn)相似的趨勢（圖4-D）。
2.5 OsESV1基因的表達(dá)分析
基于的突變表型，我們首先對的組織表達(dá)譜進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，基因在水稻的根、莖、葉、葉鞘、幼穗中都有表達(dá)，且在花后12 d的胚乳中表達(dá)較高（圖5-A）。同時(shí)對晝夜節(jié)律表達(dá)的分析表明，在黎明時(shí)表達(dá)量上升達(dá)到最高峰，表達(dá)量是其他時(shí)間點(diǎn)的40倍以上，而其他時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均較低（圖5-B），表明該基因的表達(dá)具有晝夜節(jié)律性。
A—OsESV1的基因結(jié)構(gòu)。深灰和淺灰方塊分別表示外顯子區(qū)域和UTR區(qū)域，方塊之間的黑色連線表示內(nèi)含子，下面為野生型和osesv1靶位點(diǎn)基因序列比較，連續(xù)的點(diǎn)表示缺失的序列，插入的堿基加粗標(biāo)示，紅色標(biāo)注為原間隔基序(protospacer adjacent motif , PAM) TGG；B—野生型和突變體的OsESV1蛋白結(jié)構(gòu)。箭頭標(biāo)注富含色氨酸區(qū)（Trp-rich region）和富含脯氨酸區(qū)（Pro-rich region）；C—野生型和osesv1植株，標(biāo)尺為10 cm；D—野生型和osesv1幼苗在白天和夜晚結(jié)束時(shí)OsESV1基因的表達(dá)水平。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)。*和**分別表示差異達(dá)0.05和0.01顯著水平（t檢驗(yàn)）。下同。
Fig. 2. Phenotype of themutants.
表2 野生型和osesv1的農(nóng)藝性狀
數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差（=10）。
Values are means ± SD (=10).
2.6 OsESV1定位于葉綠體
通過UniProt (https://www.uniprot.org/)網(wǎng)站預(yù)測，OsESV1蛋白定位于葉綠體。為了確認(rèn)OsESV1的亞細(xì)胞定位，在水稻原生質(zhì)體中瞬時(shí)表達(dá)OsESV1-GFP。結(jié)果表明，OsESV1-GFP融合蛋白定位于葉綠體內(nèi)，呈點(diǎn)狀分布（圖6-A）。同樣，OsESV1-GFP在煙草表皮細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，也是在葉綠體內(nèi)呈點(diǎn)狀分布（圖6-B）。
A—白天和夜晚結(jié)束時(shí)野生型(WT)和osesv1葉片的碘染觀察; B—白天和夜晚結(jié)束時(shí)野生型(WT)和osesv1葉片的淀粉含量測定。
Fig. 3. Starch contents in leaves of WT and
A—野生型(WT)和osesv1的成熟種子表型，標(biāo)尺為5 mm；B, C—野生型(WT)和osesv1種子總淀粉含量、直鏈淀粉含量；D—野生型和osesv1胚乳淀粉的黏度曲線。
Fig. 4. Phenotype ofgrains andphysicochemical properties of endosperm starch
2.7 OsESV1與OsAGP互作
在突變體中，白天結(jié)束時(shí)葉片中的淀粉含量顯著低于野生型。為探討對淀粉合成途徑存在的可能影響，將OsESV1與一系列淀粉合成酶進(jìn)行酵母雙雜。結(jié)果表明，OsESV1可以與OsAGPS2a和OsAGPS1在酵母細(xì)胞中互作（圖7）。OsAGP是淀粉合成的限速酶，為淀粉合成提供前體物質(zhì)ADP葡萄糖[4, 6]。水稻中OsAGP的小亞基包括OsAGPS1和OsAGPS2兩種亞型，OsAGPS1主要存在于胚乳的造粉體中，OsAGPS2a主要存在于葉片的葉綠體中[33-34]。
2.8 OsESV1與OsAGP互作的驗(yàn)證
我們利用雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(BiFC)來進(jìn)一步驗(yàn)證OsESV1與OsAGPS2a和OsAGPS1的互作。結(jié)果表明，在煙草表皮細(xì)胞中的葉綠體中，OsESV1可以分別與OsAGPS2a和OsAGPS1互作，并且熒光在葉綠體內(nèi)呈點(diǎn)狀分布（圖8）。
A—OsESV1在野生型不同組織及胚乳發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)水平；B—OsESV1的晝夜節(jié)律表達(dá)。黑框和白框分別表示黑夜和白天的時(shí)間軸。
Fig. 5. Expression pattern of
A—OsESV1-GFP融合蛋白在水稻原生質(zhì)體中的表達(dá)，pAN580-GFP空載體作為對照，標(biāo)尺為20 μm；B—OsESV1-GFP融合蛋白在煙草表皮細(xì)胞中的表達(dá)，p1305-GFP空載體作為對照，標(biāo)尺為20 μm。
Fig. 6. Subcellular localization of OsESV1.
二缺：SD-Leu/-Trp；四缺：SD-Leu/-Trp/-His/-Ade。
Fig. 7. Yeast two-hybrid assays show that OsESV1 can interact with OsAGPS2a and OsAGPS1.
3 討論
本研究采用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)獲得了突變體，并對基因的功能進(jìn)行了初步的研究。與野生型相比，和葉片中的淀粉含量在白天結(jié)束時(shí)分別減少了22%和52%（圖3-B），但成熟種子的淀粉含量并沒有明顯變化（圖4-B），因而與不同(突變對種子中的淀粉合成沒有明顯影響)。類似的報(bào)道還有擬南芥)在水稻中的同源基因()[28]。研究發(fā)現(xiàn)，PTST1作為腳手架蛋白，能介導(dǎo)顆粒結(jié)合淀粉合酶（granule bound starch synthase, GBSS）靶定到淀粉顆粒上，后者直接負(fù)責(zé)直鏈淀粉的合成。在擬南芥突變體葉片中，靶定到淀粉顆粒上的GBSS變少，葉片中幾乎檢測不到直鏈淀粉[35]。水稻突變體葉片中也幾乎不含直鏈淀粉，但是胚乳中直鏈淀粉的含量沒有明顯變化，且多數(shù)GBSS蛋白仍能與胚乳中的淀粉結(jié)合[36]。突變導(dǎo)致葉片與籽粒表型的差異，與本研究報(bào)道的相似。
Bars = 10 μm.
Fig. 8. BiFC assays show that OsESV1 can interact with OsAGPS2a and OsAGPS1 in tobacco epidermal cells.
突變導(dǎo)致白天葉片中淀粉含量下降，作者認(rèn)為葉片淀粉合成的同時(shí)發(fā)生降解，所以淀粉含量下降[23]。本研究中的酵母雙雜和BiFC實(shí)驗(yàn)表明，OsESV1可與OsAGPS2a互作（圖7和圖8）。研究表明，OsAGPS2a在水稻葉片的淀粉合成中起到主要作用[33]。因此OsESV1與OsAGPS2a的互作，可能是OsESV1影響葉片淀粉合成的另一種方式。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，OsESV1還與OsAGPS1互作（圖7和圖8）。OsAGPS1與OsAGPL1形成異源四聚體，定位于胚乳造粉體內(nèi)，在胚乳發(fā)育早期的淀粉合成中起作用[34]。而水稻造粉體內(nèi)OsAGP活性只占胚乳OsAGP總活性的10%，主要由細(xì)胞質(zhì)中的OsAGP負(fù)責(zé)提供ADP-葡萄糖合成淀粉[37]，比如突變體籽粒的淀粉合成幾乎未受影響[38]，因此，造粉體中的AGP對于胚乳淀粉合成應(yīng)該是非必需的。我們推測，由于OsESV1與OsAGPS1在質(zhì)體上互作，而種子造粉體中的OsAGP對種子淀粉合成幾乎沒有影響，所以的突變對種子中的淀粉合成沒有明顯影響。
AtESV1可以結(jié)合淀粉顆粒，OsESV1與其高度同源，且兩者均在葉綠體內(nèi)呈點(diǎn)狀分布（圖6），推測OsESV1可能也具有結(jié)合淀粉顆粒的特性。OsESV1與OsAGPS2a和OsAGPS1互作的熒光在葉綠體內(nèi)也呈現(xiàn)點(diǎn)狀分布，可能是結(jié)合淀粉顆粒的形式（圖8）。我們通過分析發(fā)現(xiàn)OsAGP本身并沒有結(jié)合淀粉的典型結(jié)構(gòu)域或結(jié)合位點(diǎn)，是否OsAGPS2a與OsAGPS1借助OsESV1靶定到淀粉顆粒上，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。目前已有報(bào)道，一些淀粉綁定蛋白作為腳手架蛋白，介導(dǎo)淀粉代謝酶靶定到淀粉顆粒上，如FLOURY ENDOSPERM 6可能作為腳手架蛋白，與異淀粉酶（Isoamylase 1，ISA1）互作，調(diào)控ISA1與淀粉的結(jié)合[12]；PTST1介導(dǎo)GBSS靶向到淀粉顆粒[35]；LIKE SEX4 1介導(dǎo)β-淀粉酶定位于淀粉顆粒表面[39]。
綜上所述，可能與OsAGP互作，影響水稻的淀粉合成。我們下一步計(jì)劃獲得過表達(dá)基因的材料，進(jìn)一步探討在水稻淀粉合成中的作用。
謝 辭：農(nóng)業(yè)部長江中下游粳稻生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、長江流域雜交水稻協(xié)同創(chuàng)新中心、現(xiàn)代作物生產(chǎn)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心給予大力支持，謹(jǐn)致謝意。
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Effects ofon Starch Synthesis in Rice
WANG Yongxiang, YAN Hangang, XU Hancong, FU Yushuang, SHAN Zhuangzhuang, HU Xiaoqing, ZHANG Wenwei*, JIANG Ling
(State Key Laboratory for Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Jiangsu Plant Gene Engineering Research Center, Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095, China;*Corresponding author, E-mail: zhangww@njau.edu.cn)
【】It is important to reveal the role of() in starch metabolism of rice.【】Themutants were obtained by using the CRISPR-Cas9 system. The phenotype and the physicochemical properties of endosperm starch ofwere investigated. The expression pattern and function ofwere analyzed. 【】The OsESV1 protein was conserved inplants. Compared with the wildtype, themutants exhibited lower plant height, panicle length, and grain number per panicle, but higher tiller number. Though the starch contents inleavessignificantly decreased, the total starch contents ofgrains did not obviously altered and the amylose contents increased. The expression ofwas constitutive and rhythmic. OsESV1 was located in chloroplasts with a dot-like distribution. Yeast two-hybrid and bimolecular fluorescence complementation(BiFC) assays showed thatOsESV1 could interact with ADP glucose pyrophosphorylase small subunit (OsAGPS) 2a and OsAGPS1.【】significantly affects the starch synthesis pathway in rice leaves, while not in endosperm.
rice; starch; endosperm;; interaction
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2021-03-19；
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