裘霖琳 劉竅 付亞萍 劉文真 胡國(guó)成 翟玉鳳 龐礴 汪得凱,*

水稻矮化小穗基因的鑒定與克隆

裘霖琳1劉竅1付亞萍2劉文真2胡國(guó)成2翟玉鳳1龐礴1汪得凱1,*

(1浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)與醫(yī)藥學(xué)院，杭州 310018；2中國(guó)水稻研究所 水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 杭州 310006；*通信聯(lián)系人，E-mail: kay77@163.com)

【】水稻株高和穗型在產(chǎn)量形成中發(fā)揮著重要作用。鑒定與克隆水稻株高和穗型發(fā)育相關(guān)基因，可以豐富水稻株高穗型發(fā)育調(diào)控的分子機(jī)理，為分子設(shè)計(jì)育種奠定理論基礎(chǔ)和提供基因資源?！尽吭诰救毡厩鏣-DNA插入群體中篩選到矮化小穗突變體，對(duì)其主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行了分析；采用圖位克隆法結(jié)合T-DNA標(biāo)簽分離法進(jìn)行了基因定位和克??；利用半定量PCR和qRT-PCR進(jìn)一步確定的候選基因；遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了的功能。【】與野生型日本晴相比，突變體表現(xiàn)為半矮化、穗軸和枝梗明顯縮短、穗型直立、千粒重降低等特征；遺傳分析表明該突變體受一對(duì)不完全顯性單基因控制；利用圖位克隆將定位于第2染色體標(biāo)記RM208和RM7337之間，與RM3850共分離；隨后遺傳分析發(fā)現(xiàn)，T-DNA插入位點(diǎn)與表型共分離，利用TAIL-PCR分離T-DNA插入序列，顯示T-DNA插入到上述RM208和RM7337之間的兩個(gè)基因之間。RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，位于T-DNA插入位點(diǎn)下游的一個(gè)編碼LOB家族轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)量明顯增加，而其他5個(gè)基因的表達(dá)量變化不明顯，表明該基因可能為的候選基因；在野生型日本晴中過(guò)量表達(dá)基因，轉(zhuǎn)化植株出現(xiàn)半矮化、小穗的表型，與表型類似，從而驗(yàn)證了的功能?！尽炕虻倪^(guò)量表達(dá)是產(chǎn)生突變表型的原因；基因?qū)λ局旮吆退腴L(zhǎng)發(fā)育具有負(fù)向調(diào)控作用；為進(jìn)一步豐富株高和穗型的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)打下了基礎(chǔ)。

水稻；矮化；穗長(zhǎng)；突變體；基因克隆

水稻產(chǎn)量是由株高、莖粗、分蘗數(shù)、每穗粒數(shù)、粒形等多種農(nóng)藝性狀共同決定的[1-3]。矮化是水稻育種中一個(gè)有價(jià)值的農(nóng)藝性狀，可以減少倒伏，提高產(chǎn)量。20世紀(jì)60年代，以降低農(nóng)作物株高、半矮化育種為特征的第一次“綠色革命”，使得全世界水稻和小麥產(chǎn)量水平急劇提升，為解決溫飽問(wèn)題和糧食安全作出了重大貢獻(xiàn)[4, 5]。

目前，水稻中已定位的與株高相關(guān)的位點(diǎn)已達(dá)上百個(gè)（http://www.ricedata.cn）。水稻株高調(diào)控途徑主要有激素途徑和非激素途徑，其中激素主要有赤霉素（gibberellin，GA）、油菜素內(nèi)酯（brassinosteroid，BR）、獨(dú)腳金內(nèi)酯（strigolactone，SL），吲哚乙酸（3-indoleacetic acid，IAA），脫落酸（abscisic acid，ABA）和乙烯（ethylene，ETH）等，主要涉及激素的合成、代謝和信號(hào)傳導(dǎo)。赤霉素合成和代謝途徑研究較為深入，如水稻“綠色革命”基因編碼GA20氧化酶2[4]。和分別編碼OsGA3ox2和OsKO2，是赤霉素合成中的關(guān)鍵酶，突變體表型為植株半矮化，外源赤霉素可以恢復(fù)其突變表型[6, 7]。編碼一個(gè)能失活GA的P450蛋白酶，調(diào)控赤霉素代謝[8]。是GA受體，突變體表型為GA不敏感[9]。、和編碼油菜素內(nèi)酯合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，其突變體共同特征是植株半矮化、葉色深綠、葉夾角變小[10-12]。BR信號(hào)途徑中的多個(gè)基因已經(jīng)被鑒定，如編碼BR受體蛋白激酶，其突變體對(duì)外施BR不敏感[13]。編碼GRAS家族基因，在BR信號(hào)中起正調(diào)控作用[14]。獨(dú)腳金內(nèi)酯（SL）是一種重要植物激素，在植株分枝和生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮作用，如、CCD7和CCD8分別編碼β-胡蘿卜素異構(gòu)酶、類胡蘿卜素裂解雙加氧酶7和類胡蘿卜素裂解雙加氧酶8，在獨(dú)腳金內(nèi)酯合成步驟中發(fā)揮重要作用，其突變體、、表現(xiàn)為獨(dú)腳金內(nèi)酯缺乏、植株矮化、分蘗增加等表型[15-17]。其中，和基因在水稻“綠色革命”中被共選擇，對(duì)水稻的穩(wěn)產(chǎn)和廣適發(fā)揮了重要作用[18]。關(guān)于SLs受體及其感知機(jī)制取得了突破性進(jìn)展，編碼一個(gè)α/β折疊水解酶，在水解SLs過(guò)程中發(fā)生構(gòu)象變化，形成D14-D3復(fù)合體，招募D53并介導(dǎo)其泛素化降解，觸發(fā)SLs信號(hào)傳導(dǎo)，誘導(dǎo)D53/SMXL2,6,7,8發(fā)生泛素化修飾介導(dǎo)的蛋白降解，解除對(duì)下游基因的轉(zhuǎn)錄抑制，調(diào)控植物株型以及作物產(chǎn)量[19-22]。是IAA合成過(guò)程中的關(guān)鍵基因，其缺失突變表現(xiàn)為胚致死，再生植株表現(xiàn)為矮化、窄葉、花器官異常等表型[23]。是Aux/IAA家族成員，受IAA誘導(dǎo)，過(guò)量表達(dá)表現(xiàn)為植株矮化、株型松散的表型，表明在IAA信號(hào)響應(yīng)中發(fā)揮重要作用[24]。編碼乙烯響應(yīng)因子，過(guò)量表達(dá)出現(xiàn)矮化表型，顯示莖稈長(zhǎng)度受GA和ETH交叉調(diào)控[25]。水稻株高除了受激素調(diào)控外，還受非激素途徑調(diào)控，如細(xì)胞壁發(fā)育、細(xì)胞質(zhì)谷氨酰胺合成途徑、RNA編輯、細(xì)胞分裂、泛素-蛋白酶體途徑和脂肪酸代謝等。編碼類纖維素合成酶，突變體表現(xiàn)為矮化，纖維素和木糖含量顯著降低[26]。編碼胞質(zhì)谷氨酰胺合成酶，其插入突變體生長(zhǎng)緩慢、穗變小、籽粒灌漿受阻[27]。編碼knotted1同源框家族轉(zhuǎn)錄因子，影響細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)，其缺失突變表現(xiàn)為矮化，表皮和維管束細(xì)胞排列不規(guī)則[28]。隨著眾多水稻矮化基因位點(diǎn)的發(fā)掘，對(duì)控制水稻株高性狀的遺傳基礎(chǔ)和分子調(diào)控機(jī)理研究也將會(huì)不斷深入。

本實(shí)驗(yàn)室從粳稻品種日本晴T-DNA插入突變體庫(kù)中篩選到一系列株高和穗部性狀有關(guān)的突變體，其中一個(gè)突變體表現(xiàn)為半矮化、穗軸和枝?？s短，穗型直立、著粒減少對(duì)進(jìn)行了表型鑒定和遺傳學(xué)分析,并通過(guò)圖位克隆結(jié)合T-DNA標(biāo)簽的方法克隆了基因。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析T-DNA插入位點(diǎn)上下游基因在野生型和突變體中的表達(dá)差異，確定了候選基因，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)過(guò)量表達(dá)基因，從而驗(yàn)證了基因的功能，為豐富水稻穗型種質(zhì)資源和穗型基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

從粳稻品種日本晴T-DNA插入突變體庫(kù)中[29]，篩選到一個(gè)半矮化，穗軸、一次枝梗和二次枝梗明顯縮短的突變材料，經(jīng)連續(xù)種植，發(fā)現(xiàn)該性狀可以穩(wěn)定遺傳，將其命名為，供試材料分別種植于浙江杭州和海南陵水實(shí)驗(yàn)基地。

1.2 突變體的表型鑒定

抽穗后隨機(jī)選取野生型日本晴、雜合體和純合分別對(duì)其株高、穗型、著粒數(shù)、千粒重等農(nóng)藝性狀進(jìn)行考查，每個(gè)材料10個(gè)重復(fù)。

1.3 遺傳分析和定位群體構(gòu)建

突變體的遺傳分析從T1代開(kāi)始，統(tǒng)計(jì)正常植株、雜合體和純合植株的數(shù)量，單株收獲T1代種子，種植T2代。自交后代均單株收獲，按株系種植，觀察植株的表型，調(diào)查后代有無(wú)分離。

以作母本與秈稻品種龍?zhí)馗雜交，獲得/龍?zhí)馗的F1雜交種子，將F1種子收獲后單本種植，去除假雜種后套袋自交，單株收獲F2種子，F(xiàn)2種子按株系進(jìn)行單本種植，從F2分離群體中選取極端隱性表型（野生型正常表型）的純合表型單株用于初步定位。

1.4 基因定位

采用CTAB法[29]提取各單株葉片總DNA，并參照Michelmore等[30]的BSA法，根據(jù)F2分離群體植株表型，隨機(jī)等量取10株野生型和10株極端表型植株的DNA，分別構(gòu)建野生型DNA池和突變型DNA池。利用本實(shí)驗(yàn)室保存的183對(duì)在上述兩親本間有多態(tài)性的SSR標(biāo)記對(duì)兩個(gè)近等基因池進(jìn)行BSA分析，然后選取有偏態(tài)擴(kuò)增的SSR標(biāo)記對(duì)隱性單株進(jìn)行分析，初步確定突變基因的位置。PCR擴(kuò)增參照Panaud等[31]的方法進(jìn)行，本研究中使用15 μL的PCR擴(kuò)增體系：1 μL模板DNA，7.5 mL PCR Mix(2×)，正反向引物各1 μL，4.5 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增程序：94℃下變性5 min；94℃下預(yù)變性30 s，55℃下退火30 s，72℃下延伸1 min，72℃下重復(fù)延伸5 min，16℃下保存，共計(jì)35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物用4%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用Alpha Imager EP凝膠成像儀觀察并拍照。

表1 PCR鑒定及定量PCR所用的引物

1.5 連鎖分析

將的SSR擴(kuò)增帶型記為“1”，龍?zhí)馗的帶型記為“2”，雜合體帶型記為“3”，用MapMaker/EXP 3.0軟件進(jìn)行連鎖分析[33]，結(jié)合SSR標(biāo)記在染色體上的位置，對(duì)基因進(jìn)行定位。

T-DNA插入位點(diǎn)連鎖分析，選取T2代表型分離的群體，分別選取野生型、雜合體和純合突變型三種表型單株，取葉片提取DNA，利用T-DNA區(qū)的基因設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增，所用反應(yīng)程序：94℃下5 min；94℃下30 s，55℃下30 s，72℃下1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃下5 min，16℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6 候選基因表達(dá)分析

采用Trizol法提取野生型和突變體幼穗發(fā)育第Ⅲ期的總RNA，野生型和突變體各取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TOYOBO公司的ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix with gDNA Remover）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄第1鏈cDNA合成，步驟參照試劑盒說(shuō)明書。以水稻為內(nèi)參基因，用NOVO protein公司的2×PCR Master Mix試劑進(jìn)行半定量PCR檢測(cè)。反應(yīng)程序如下：94℃下5 min；94℃下30 s，55℃下30 s，72℃下1 min，25個(gè)循環(huán)；72℃下5 min，16℃保存。PCR產(chǎn)物取8 μL，用1%的瓊脂糖凝膠電泳，Alpha Imager EP凝膠成像儀拍照。

利用前述方法獲得的cDNA，采用SYBR熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行反應(yīng)，依照產(chǎn)品說(shuō)明書完成操作，20 μL反應(yīng)體系含1 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。反應(yīng)在Lightcycler 2.0熒光定量PCR儀(Roche瑞士)上進(jìn)行，所用反應(yīng)程序如下：95℃下10 s；95℃下5 s，55℃下10 s，72℃下10 s，40個(gè)循環(huán)。采用2法對(duì)基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行比較[34]。

1.7 轉(zhuǎn)基因過(guò)量表達(dá)

以基因序列為模板，設(shè)計(jì)擴(kuò)增基因全長(zhǎng)ORF的引物，用TaKaRa公司的PrimeSTAR?HS DNA聚合酶結(jié)合2×GC緩沖液進(jìn)行對(duì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序如下：98℃下10 s，60℃下5 s，72℃下2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃下5 min，16℃保存。取5 μL PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)，確認(rèn)擴(kuò)增成功后用無(wú)水乙醇沉淀，然后溶于適量的ddH2O，用Ⅰ和Ⅰ對(duì)獲得的目的基因片段進(jìn)行酶切、回收，連接到用同樣酶切后回收的線性化載體上，形成載體，測(cè)序驗(yàn)證。將測(cè)序正確的載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化野生型日本晴，以空載體為對(duì)照，轉(zhuǎn)化方法參照文獻(xiàn)[35]。利用G418篩選獲得抗性愈傷，將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有150 mg/L G418的預(yù)分化培養(yǎng)基上預(yù)分化10 d左右，然后轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)1個(gè)月左右，獲得轉(zhuǎn)基因植株，用引物進(jìn)行擴(kuò)增，所用反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃下5 min；94℃下30 s，55℃下30 s，72℃下1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃下5 min，16℃下保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。檢測(cè)陽(yáng)性的植株移栽到田間，于抽穗期觀察植株表型并取樣進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 dsp2-D突變體的形態(tài)特征與性狀分析

自然條件下（杭州夏季，6月1日前后播種），突變體表現(xiàn)為株高顯著降低，野生型、雜合體和純合突變型的株高分別為91.7、80.6和69.9 cm，雜合體和純合突變分別是野生型的87.9%和76.2%。穗軸、一次枝梗和二次枝梗顯著縮短，其中野生型、雜合體和純合突變型的穗長(zhǎng)分別為21.5、11.7和10.0 cm，雜合體和純合突變分別是野生型的54.4%和46.5%。穗粒數(shù)顯著減少，野生型、雜合體和純合突變型的每穗粒數(shù)分別為122.5、49.6和11.6，雜合體和純合突變型分別是野生型的40.5%和9.5%。而野生型、雜合體和純合突變型的結(jié)實(shí)率分別為85.3%、35.5%和14.5%，雜合體和純合突變型分別是野生型的41.6%和17.0%(圖1)。穗軸、一次和二次枝?？s短，導(dǎo)致穗型直立，著粒密度變大（圖1）。此外，分蘗數(shù)顯著增加，雜合體和純合突變型分別比野生型增加26.4%和52.9%。

2.2 dsp2-D突變體的遺傳分析

的T1代突變株系中可見(jiàn)兩種突變表型，其中一種為極端突變體，表現(xiàn)為半矮化、穗頸極度縮短，另外一種突變表型，株高、穗長(zhǎng)等介于野生型和極端型之間，野生型∶中間型∶純合體植株數(shù)量分別8∶16∶6（χ2＝0.18，<0.05）。將兩類突變體單株收獲，通過(guò)后代株系的表型分離確定其遺傳特性。分別調(diào)查分析了分離群體中，極端表型和中間表型各4個(gè)單株后代株系的表型，其中極端突變體自交后代全部出現(xiàn)極端表型，不再分離，而4個(gè)中間型表型的植株后代均再次出現(xiàn)野生型、中間型和極端型3種表型分離，且3種表型的數(shù)量比例符合1∶2∶1的分離關(guān)系（結(jié)果未顯示）。以上結(jié)果表明，突變體表型受一對(duì)不完全顯性基因控制。

AA、Aa、aa分別代表野生型日本晴植株、雜合體和dsp2-D純合體。不同字母代表差異極顯著（P<0.01，Tukey檢驗(yàn)），n=10。

AA, Wild-type ‘Nipponbare’ plants; Aa, dsp2-D heterozygous plants; aa, dsp2-D homozygous plants. Values are mean ± SD of ten biological replicates. Samples with different letters are significantly different (P < 0.01; Tukey’s test).

圖1 突變體dsp2-D的表型

Fig. 1. Phenotypes of the dsp2-D mutant.

2.3 dsp2-D的基因定位和T-DNA插入位點(diǎn)分析

利用在日本晴和龍?zhí)馗兩親本間有多態(tài)性的、均勻分布于水稻12條染色體的183對(duì)SSR引物對(duì)兩個(gè)近等基因池進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)位于第2染色體相鄰的3對(duì)SSR引物(RM240，RM166和RM266)在兩基因池具有明顯的偏態(tài)擴(kuò)增。利用這3對(duì)引物對(duì)93個(gè)隱性單株進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示出明顯的偏分離，表明該突變基因位于第2染色體上的SSR標(biāo)記RM240和RM266之間。進(jìn)一步在RM240和RM266之間發(fā)展SSR標(biāo)記，其中3對(duì)標(biāo)記(RM208、RM3850和RM7337)在兩親本間有多態(tài)性，利用這3對(duì)有多態(tài)性的引物繼續(xù)檢測(cè)93個(gè)單株的擴(kuò)增產(chǎn)物，將突變基因定位在SSR標(biāo)記RM208和RM7337之間，與RM3850共分離，與兩個(gè)標(biāo)記RM208和RM7337的遺傳距離分別約為3.5 cM和2.3 cM（圖2-A）。

利用T-DNA中的潮霉素抗性基因，對(duì)F2分離群體中的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)雜合體和純合體均可以擴(kuò)增出目的條帶，而野生型表型不能擴(kuò)增（圖2-B），表明突變表型與T-DNA插入共分離。

A―DSP2基因的初步定位；B―T-DNA插入位點(diǎn)共分離分析。M, 1 kb ladder; P為質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照; A1～A3為野生型；B1～B7為雜合體；C1～C4為純合體。

Fig. 2. Location ofon chromosome 2 and co-segregation analysis of T-DNA.

2.4 候選基因DSP2表達(dá)分析

利用TAIL-PCR分離了T-DNA插入位點(diǎn)的旁側(cè)序列，通過(guò)NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)T-DNA插入到水稻第2染色體克隆P0474F11上兩個(gè)基因之間，位于所在的SSR標(biāo)記RM208和RM7337的區(qū)間，提示表型是T-DNA插入引起(圖3-A)。

為了確定候選基因DSP2，分別對(duì)T-DNA插入位點(diǎn)上下游各3個(gè)基因進(jìn)行了RT-PCR半定量分析(圖3-A)。對(duì)野生型和突變體中6個(gè)基因進(jìn)行表達(dá)分析的結(jié)果顯示，這5個(gè)基因在突變體中的表達(dá)量和野生型相比沒(méi)有顯著差異，位于T-DNA插入位點(diǎn)下游的基因在野生型中表達(dá)量很低（T-DNA位于ORF1啟動(dòng)子方向的上游），但是在突變體中其表達(dá)水平顯著上調(diào)(圖3-B)。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果也與前述半定量結(jié)果相符。T-DNA插入位點(diǎn)下游基因在突變體中其表達(dá)水平顯著上調(diào)，而其他幾個(gè)分析的基因表達(dá)量無(wú)顯著差異（圖3-C）。結(jié)果顯示，可能是的候選基因。

2.5 轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證

利用載體構(gòu)建了水稻啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的過(guò)量表達(dá)載體，命名為-OE，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻品種日本晴。隨機(jī)選取3株-過(guò)量表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植株的幼穗提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qRT-PCR分析，基因表達(dá)量比空載體轉(zhuǎn)化對(duì)照植株顯著增加（圖4-A）。至抽穗期，基因的過(guò)量表達(dá)植株，其株高均出現(xiàn)顯著降低，OE#1, OE#2和OE#3三個(gè)陽(yáng)性植株株高分別為75.6、72.4和69.8 cm，株高與基因的表達(dá)量負(fù)相關(guān)，稻穗變短，穗直立，表型與突變體類似（圖4-B、4-C）。上述研究結(jié)果顯示，突變體表型確實(shí)是由基因的過(guò)量表達(dá)引起的。

A―T-DNA插入位點(diǎn)；B, C―6個(gè)基因在突變體dsp2-D和野生型中的表達(dá)水平，水稻OsUBQ5為內(nèi)參基因。Bar值表示3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值±SD；**表示0.01極顯著水平。

Fig. 3. Expression analysis of candidate gene

A―DSP2基因在野生型和轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)水平，其中WT代表野生型日本晴，CK代表空載體轉(zhuǎn)化植株，OE-1#～OE-3#代表DSP2-OE轉(zhuǎn)化植株；Bar值表示3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值±SD；**表示0.01極顯著水平。B, C―DSP2過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的表型，CK為空載體轉(zhuǎn)化植株。B圖中標(biāo)尺表示10 cm; C圖中標(biāo)尺表示5 cm。

Fig. 4. Overexpression ofgene and functional identification.

3 討論

水稻是我國(guó)乃至世界上的重要糧食作物，全世界超過(guò)一半人口以稻米為主食。水稻生產(chǎn)在我國(guó)的糧食安全中占有極為重要的地位，水稻株高、穗型會(huì)直接影響最終的產(chǎn)量和品質(zhì)，是水稻育種和生產(chǎn)中最受關(guān)注的性狀之一[36-38]。對(duì)水稻穗型突變體及其調(diào)控的基因進(jìn)行研究，有助于闡明穗發(fā)育的遺傳基礎(chǔ)和分子調(diào)控機(jī)理，對(duì)水稻穗型和產(chǎn)量的遺傳改良研究具有重要的指導(dǎo)意義。

本研究中，突變體出現(xiàn)半矮化，穗軸和枝梗縮短，著粒密度變大等表型，遺傳分析顯示，突變是由一對(duì)單基因控制的不完全顯性基因控制。利用分子標(biāo)記定位結(jié)合T-DNA標(biāo)簽分離，確定了是的候選基因，進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)基因過(guò)量表達(dá)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了基因的功能，表明基因?qū)λ舅胄途哂兄匾呢?fù)向調(diào)控作用，是一個(gè)調(diào)控水稻株高和穗型的新基因，深入研究的功能和分子調(diào)控機(jī)理，可以豐富水稻穗型發(fā)育基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。后續(xù)需要對(duì)基因進(jìn)行基因編輯或抑制基因表達(dá)，進(jìn)一步深入研究對(duì)水稻株高和穗型的調(diào)控機(jī)理，并篩選基因的自然等位變異，獲得具有增產(chǎn)效應(yīng)的優(yōu)異等位基因，為育種利用提供支持。

基因編碼LOB家族轉(zhuǎn)錄因子，基因家族是一類植物特異的轉(zhuǎn)錄因子家族，主要作用于分生組織邊界，影響葉片近-遠(yuǎn)軸極性的建立[39]。基因家族在側(cè)生器官的發(fā)育和形成過(guò)程中發(fā)揮重要功能，此外，基因功能還與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、光形態(tài)建成、葉枕和葉柄發(fā)育、抗病性、激素反應(yīng)、代謝調(diào)節(jié)有關(guān)，其功能對(duì)植物的生長(zhǎng)非常重要[40]。水稻中有35個(gè)基因，絕大部分基因功能未知[41]。其中編碼LOB蛋白，其缺失突變體表現(xiàn)出不定根缺失，根向地性丟失，對(duì)生長(zhǎng)素、乙烯等不敏感，但是在NAA處理?xiàng)l件下，在根系中表達(dá)量上升，表明該基因參與生長(zhǎng)素應(yīng)答途徑而影響細(xì)胞分化途徑[42-43]。編碼另外一個(gè)LOB蛋白，其T-DNA插入缺失突變體穎殼退化、雌雄蕊數(shù)目異常、部分雄性不育[44]。編碼LOB蛋白，是玉米的同源基因，OsIG1-RNAi植株表現(xiàn)為穎花、穎殼發(fā)育異常[45]。為玉米的同源基因，異位表達(dá)枝?？s短，表達(dá)量降低，枝梗伸長(zhǎng)[46]。OsLBD37和OsLBD38通過(guò)抑制下游開(kāi)花基因和的表達(dá)，調(diào)控抽穗期[47]。本研究中，編碼LOB蛋白，其過(guò)量表達(dá)后導(dǎo)致矮化，穗軸、一次枝梗和二次枝?？s短，結(jié)實(shí)率下降，為一調(diào)控株高和穗型的新基因,與基因具有類似的表型。對(duì)功能的研究，有助于進(jìn)一步闡明LOB家族的生物學(xué)功能。

水稻是重要的糧食作物，也是禾本科植物研究的模式植物，深入發(fā)掘基因的功能和分子機(jī)理，可以為分子設(shè)計(jì)育種提供基因資源和研究思路。水稻基因的發(fā)掘和成功利用使得水稻產(chǎn)量取得重大突破，引發(fā)了“第一次綠色革命”，近年來(lái)，水稻生產(chǎn)中利用有利功能基因及其弱等位突變?nèi)〉昧酥匾黄?，如東北和長(zhǎng)江中下游晚粳稻區(qū)的直立穗和半直立穗品種中普遍利用的直立穗基因[48-49]，秈粳雜交稻甬優(yōu)系列品種中利用的粗大穗理想株型基因[50-51]，以及華占品種中利用的多蘗矮稈基因[18]。因此，為實(shí)現(xiàn)在現(xiàn)有產(chǎn)量水平上實(shí)現(xiàn)單產(chǎn)水平的進(jìn)一步突破，充分挖掘作物產(chǎn)量遺傳潛力，對(duì)株型、穗型形成的分子機(jī)理進(jìn)行遺傳解析具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

謝辭：本研究所用水稻材料由原中國(guó)水稻研究所孫宗修研究員提供，特此致謝。

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Identification and Gene Cloning ofin Rice (L.)

QIU Linlin1, LIU Qiao1, FU Yaping2, LIU Wenzhen2, HU Guocheng2, ZHAI Yufeng1, PANG Bo1, WANG Dekai1,*

(1College of Life Sciences and Medicine, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China;2State Key Laboratory of Rice Biology,China National Rice Research Institute,Hangzhou 310006, China;*Corresponding author, E-mail: kay77@163.com)

【】Plant height and panicle length play important roles in rice production. Identifying and cloning genes related to rice plant height and panicle architecture will enrich the molecular mechanism of the regulation of rice plant height and panicle development, and will provide a theoretical foundation and genetic resources for molecular design breeding.【】 A dwarf and small panicle mutant() was obtained from T-DNA insertion population of Nipponbare. The main agronomic traits ofand the wild-type were characterized under conventional planting conditions infield. An F2mapping population was generated by crossing themutant with Longtefu B (anrice variety) andwas identified by map-based cloning and T-DNA tag method. The candidate gene was determined by the relative expression analysis of three genes located upstream and downstream of the T-DNA insertion site, respectively, which was carried out by real-time RT-PCR. The function ofwas confirmed by overexpressing() in wild-type Nipponbare.【】 The plant height, panicle length, the length of primary and secondary inflorescence branches ofwas dramatically reduced compared with the wild type. Genetic analysis indicated that the phenotypes ofwere regulated by an incomplete dominant gene. Thegene was mapped to a region between RM208 and RM7337 on chromosome 2, and co-segregated with RM3850. Subsequently, T-DNA insertion site was found to be co-segregated withphenotype, and T-DNA insertion sequence was separated by TAIL-PCR, which showed that T-DNA was inserted into the two genes between RM208 and RM7337. Real-time PCR analysis indicated that the expression level ofwhich located down-stream of T-DNA site, was dramatically up-regulated. While the expression levels of the rest five detected geneswere not significantly changed in.() overexpressing transgenic plants showed semi-dwarf and small panicle，which were similar with the phenotypes inThe results confirmed thatgene was the target gene controlling【】The overexpression ofcaused the mutant phenotypes of. And we found thatencodes a LOB family transcript factor and negatively regulates plant height and panicle length in rice. Our findings will open new perspectives on-based improvement of plant height and panicle type of rice.

rice;dwarf; panicle length; mutant; gene cloning

2021-06-17；

2021-09-14。

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)專項(xiàng)(2016YFD0100401)；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31571742)；浙江理工大學(xué)科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(19042142-Y)。