劉 倩, 羅 迪, Roman JASHENKO, 季 榮,*

(1. 新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 中亞區(qū)域跨境有害生物聯(lián)合控制國(guó)際研究中心,新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 新疆特殊環(huán)境物種多樣性應(yīng)用與調(diào)控教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830054; 2. 哈薩克斯坦阿勒法拉比國(guó)立大學(xué), 阿拉木圖 050038)

海藻糖作為二糖類(lèi)碳水化合物不僅可以在各種環(huán)境脅迫條件下保護(hù)蛋白和細(xì)胞分子結(jié)構(gòu)，抵抗不良環(huán)境(Tangetal., 2008)，還可作為能量物質(zhì)和碳源參與生物體的代謝過(guò)程(Argüelles, 2000)。海藻糖酶是昆蟲(chóng)體內(nèi)唯一水解海藻糖的酶，將海藻糖水解形成葡萄糖為昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育提供能量(唐斌等, 2012)，海藻糖酶可分為可溶型海藻糖酶(TreS或Tre1)和膜結(jié)合型海藻糖酶(TreM或Tre2)，前者主要存在于消化系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)，后者主要存在于肌肉中，飛行類(lèi)昆蟲(chóng)體內(nèi)的TreM活性相對(duì)較高(Derr and Randall, 1966)。海藻糖酶是由海藻糖酶基因(Treh)編碼，最先從昆蟲(chóng)中克隆出的海藻糖酶基因是可溶型海藻糖酶基因Treh1(Takiguchietal., 1992)，2005年膜結(jié)合型海藻糖酶基因在家蠶Bombyxmori中被發(fā)現(xiàn)并成功克隆(Mitsumasuetal., 2005)，隨后在多種昆蟲(chóng)體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)了兩種海藻糖酶基因(田宇等, 2016; 王德意等, 2018)。研究表明，海藻糖酶是昆蟲(chóng)體內(nèi)調(diào)節(jié)滯育激素和保幼激素及幾丁質(zhì)合成途徑中的關(guān)鍵酶(Ogiso and Takahashi, 1984; Kameietal., 2011; Shuklaetal., 2016)，海藻糖酶基因受到干擾后不僅會(huì)阻斷有機(jī)體能量代謝，還會(huì)影響昆蟲(chóng)正常的生長(zhǎng)發(fā)育(Chenetal., 2010)，張倩等(2012)利用RNAi技術(shù)干擾海藻糖酶基因后，幾丁質(zhì)合成受到影響，致使昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育受阻，死亡率增加。

昆蟲(chóng)屬于變溫動(dòng)物，極端低溫或高溫都會(huì)影響昆蟲(chóng)生存和生長(zhǎng)發(fā)育(Boaedmanetal., 2015; Maetal., 2021)，低溫馴化(cold acclimation)可顯著提高昆蟲(chóng)在低溫下的存活率(Lee, 1989)。將綠盲蝽Apolyguslucorum越冬卵經(jīng)過(guò)0℃下40 min處理后，其在-20℃下的死亡率顯著降低(卓德干等, 2012)；其次，低溫馴化可通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)耐寒基因的表達(dá)提高昆蟲(chóng)的抗寒能力(Fuetal., 2020)。一定范圍內(nèi)溫度越低亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis越冬滯育幼蟲(chóng)AK,Tpi和Gst基因表達(dá)量越高(劉寧, 2017)。在低溫脅迫處理下，假眼小綠葉蟬Empoascavitis的Tre2表達(dá)量增加(汪曉茜, 2018)。異色瓢蟲(chóng)Harmoniaaxyridis經(jīng)過(guò)不同低溫處理后，Trehl-1基因表達(dá)量顯著增加，說(shuō)明昆蟲(chóng)在受到低溫脅迫時(shí)，會(huì)通過(guò)調(diào)動(dòng)海藻糖的利用和加強(qiáng)海藻糖的代謝等方式進(jìn)行御寒(秦資, 2012)。

意大利蝗Calliptamusitalicus是新疆草原的重要害蟲(chóng)(張泉等, 1995)，以滯育卵在土壤中越冬，越冬卵發(fā)育經(jīng)歷早期、滯育、滯育解除3個(gè)階段(王香香等, 2019)。新疆冬季寒冷，倒春寒現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，蝗卵耐寒能力是其能否順利越冬以維持種群數(shù)量的關(guān)鍵(葛婧等, 2014)，探討越冬卵耐寒能力對(duì)害蟲(chóng)種群預(yù)報(bào)和防治具有重要意義。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，自然條件下，隨著蝗卵發(fā)育進(jìn)程，意大利蝗卵的血藍(lán)蛋白基因Hc2表達(dá)呈現(xiàn)出先增加后減少的變化趨勢(shì)，并在滯育階段Hc2表達(dá)量最高(王香香等, 2019)。Hc2基因與氧氣運(yùn)載有關(guān)(Terwilliger, 1998)，氧氣運(yùn)載需要消耗能量，而能量供給則主要來(lái)自海藻糖酶分解海藻糖?；诖颂岢黾僭O(shè)，低溫脅迫下蝗卵海藻糖酶基因與Hc2的表達(dá)變化趨勢(shì)相同，以滿(mǎn)足蝗卵不同發(fā)育階段的能量供給。本研究通過(guò)克隆海藻糖酶基因，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，對(duì)其在意大利蝗卵不同發(fā)育階段低溫馴化前后的表達(dá)譜進(jìn)行測(cè)定，旨在進(jìn)一步探討蝗卵抵御冬季低溫的分子生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試蟲(chóng)來(lái)源與處理

于2019年7月初赴新疆維吾爾自治區(qū)昌吉瑪納斯南山蝗區(qū)實(shí)驗(yàn)站(43°54′ N, 86°7′ E; 海拔1 310 m)捕捉意大利蝗雌、雄成蟲(chóng)，并混合飼養(yǎng)于室外的蟲(chóng)籠(1 m×1 m×1 m)中?；\內(nèi)的地面上放置4個(gè)直徑相同、深度為12 cm的塑料花盆，花盆里裝滿(mǎn)砂壤土，供意大利蝗產(chǎn)卵。籠內(nèi)飼養(yǎng)密度為500頭/m2以獲得群居型意大利蝗(張洋, 2011)。每日飼喂新鮮冷蒿Artemisiafrigida、紫花苜蓿Medicagosativa直至交配產(chǎn)卵。每日定時(shí)更換花盆，并通過(guò)篩土法收集卵囊。

卵囊?guī)Щ貙?shí)驗(yàn)室后放在盛有蛭石的塑料盒(30 cm×20 cm×9.6 cm)中，深度約為5 cm，塑料盒用封口膜密封并扎有小孔以保濕和透氣。預(yù)實(shí)驗(yàn)將不同發(fā)育階段的蝗卵于0℃和4℃下分別處理5, 10和15 d。結(jié)果顯示，0℃處理15 d后蝗卵早期(8月中旬-9月初)、滯育階段(12月底-1月中旬)、滯育解除階段(翌年3月底-5月初)3個(gè)發(fā)育階段的過(guò)冷卻點(diǎn)與對(duì)照組常溫(27℃)有顯著差異(P<0.05)，其他處理?xiàng)l件下無(wú)顯著差異，故將0℃低溫處理15 d的蝗卵作為實(shí)驗(yàn)組，以置于人工培養(yǎng)箱(RTOP-430B1, 浙江托普儀器有限公司)27℃(任金龍等, 2015b)、處于相同發(fā)育階段的蝗卵作為對(duì)照組。兩組同時(shí)在意大利蝗卵早期、滯育、滯育解除階段分別取樣，每組30粒卵，重復(fù)3組。意大利蝗越冬卵不同發(fā)育階段劃分采用王香香等(2019)方法，因產(chǎn)卵時(shí)間、當(dāng)年的氣溫變化或存放蝗卵的溫度不同，都會(huì)對(duì)意大利蝗卵發(fā)育時(shí)間造成影響(任金龍等, 2015a)，故本實(shí)驗(yàn)依據(jù)發(fā)育階段進(jìn)行實(shí)驗(yàn)而非發(fā)育時(shí)間。人工培養(yǎng)箱溫度為27±1℃，相對(duì)濕度為45%±5%，光周期為14L∶10D(任金龍等, 2015b)。

1.2 總RNA提取及cDNA合成

取1.1節(jié)不同發(fā)育階段的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組意大利蝗卵各100 mg，液氮研磨后，參照TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總RNA提取。以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA提取質(zhì)量，采用超微量生物檢測(cè)儀(NanoDrop2000, 美國(guó)Thermo公司)進(jìn)行RNA濃度和純度的測(cè)定。以提取的總RNA作為模板，按照PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa, 大連)操作說(shuō)明合成cDNA的第1鏈，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 意大利蝗卵海藻糖酶基因片段擴(kuò)增

從課題組前期注釋的意大利蝗卵轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中(未發(fā)表)獲得意大利蝗卵海藻糖酶基因的序列信息，并在NCBI blast中進(jìn)行比對(duì)。利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)序列全長(zhǎng)的擴(kuò)增引物(表1)。以1.2節(jié)合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系(30 μL): cDNA模板1 μL，上下游引物(0.2 μmol/L)各1.5 μL, PCR Master Mix 15 μL及ddH2O 11 μL。PCR反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性4 min; 94℃變性30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸2 min, 30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min; 4℃條件下保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，使用EZ-10柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行DNA的電泳后回收，將回收的目的片段與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中轉(zhuǎn)化，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，進(jìn)行菌液PCR陽(yáng)性克隆檢測(cè)，選取檢測(cè)合格的3個(gè)菌液樣品送至上海生工進(jìn)行測(cè)序。

1.4 意大利蝗卵海藻糖酶基因的生物信息學(xué)分析

利用NCBI中的ORF Finder(http:∥www. ncbi. nlm. nih. Gov/gorf/gorf. html)工具對(duì)獲得的序列進(jìn)行開(kāi)放閱讀框預(yù)測(cè)，并將其核苷酸序列翻譯成氨基酸序列；用在線(xiàn)網(wǎng)站ProtParam (http:∥web. Expasy. org/protparam/)進(jìn)行等電點(diǎn)、分子質(zhì)量、氨基酸組成和理化性質(zhì)預(yù)測(cè)；分別使用SignalP 4.1(http:∥www. cbs. dtu. dk/services/Si GnalP/)與TMHMM(http:∥www. Cbs. Dtu. dk/services/TMHMM/)進(jìn)行信號(hào)肽和跨膜區(qū)的預(yù)測(cè)；通過(guò)在線(xiàn)分析工具PBIL(https:∥prabi. ibcp. fr/htm/site/web/home)和SWISS-MODEL(https:∥swissmodel. expasy. org)預(yù)測(cè)其二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。序列同源性比對(duì)采用在線(xiàn)Blast程序(https:∥blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)；用MEGA7.0中的鄰接法(neighbor-joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，重復(fù)運(yùn)行1 000次。

1.5 意大利蝗卵海藻糖酶基因的表達(dá)譜分析

應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)分析意大利蝗卵不同發(fā)育階段和低溫馴化后的海藻糖酶基因mRNA的表達(dá)情況。以β-actin為內(nèi)參基因，引物序列見(jiàn)表1，以1.2節(jié)合成的cDNA為模板，使用SYBR?Premix Ex TaqTMGreen Ⅱ試劑盒進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系(20 μL): cDNA模板1 μL, 上下游引物(0.2 μmol/L)各1 μL, ddH2O 7 μL, SYBR Green Supermix 10 μL。反應(yīng)程序: 95℃ 10 min; 95℃ 10 s, 58℃ 15 s, 72℃ 15 s, 40個(gè)循環(huán); 95℃ 10 s, 65℃ 60 s, 97℃ 1 s。生成溶解曲線(xiàn)。每組蝗卵樣品3次技術(shù)重復(fù)。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔCt法(Livak and Schmittgen, 2001)計(jì)算分析對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組意大利蝗卵不同發(fā)育階段海藻糖酶基因的相對(duì)表達(dá)量。采用SPSS方差分析(ANOVA)最小顯著性差異法(LSD)進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)，分析不同發(fā)育階段蝗卵的基因表達(dá)量差異；低溫馴化后蝗卵不同發(fā)育階段海藻糖酶基因表達(dá)量與對(duì)照組(27℃)的差異采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，顯著性檢驗(yàn)水平P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 意大利蝗卵海藻糖酶基因的克隆與序列特征

克隆共獲得4個(gè)具有完整開(kāi)放閱讀框(ORF)的海藻酶基因序列，依次命名為CiTreM1,CiTreM2,CiTreS1和CiTreS2(GenBank登錄號(hào)分別為MZ669810, MZ669811, MZ669812和MZ669813)，其編碼蛋白中CiTreM1和CiTreM2為膜結(jié)合型海藻糖酶，CiTreS1和CiTreS2為可溶型海藻糖酶。其中CiTreM1的ORF全長(zhǎng)為1 797 bp，編碼598個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)的蛋白分子質(zhì)量為69.53 kD，理論等電點(diǎn)為5.30，包含83個(gè)帶負(fù)電荷氨基酸殘基，68個(gè)帶正電荷氨基酸殘基，無(wú)信號(hào)肽序列，有一段約為22個(gè)氨基酸的跨膜區(qū)，跨膜結(jié)構(gòu)域的位置在第539-561位氨基酸；CiTreM2的ORF全長(zhǎng)為1 797 bp，編碼598個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)的蛋白分子質(zhì)量為69.24 kD，理論等電點(diǎn)為5.02，包含82個(gè)帶負(fù)電荷氨基酸殘基，56個(gè)帶正電荷氨基酸殘基，具有長(zhǎng)為18個(gè)氨基酸殘基(MFHGSEVVLCIALVSIVS)的信號(hào)肽序列，有一段約為22個(gè)氨基酸的跨膜區(qū)，跨膜結(jié)構(gòu)域的位置在第574-596位氨基酸；CiTreS1的ORF全長(zhǎng)為1 653 bp，編碼550個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)的蛋白分子質(zhì)量為62.70 kD，理論等電點(diǎn)為5.68，包含65個(gè)帶負(fù)電荷氨基酸殘基，57個(gè)帶正電荷氨基酸殘基，無(wú)信號(hào)肽序列，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域；CiTreS2的ORF全長(zhǎng)為1 194 bp，編碼397個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)的蛋白分子質(zhì)量為46.13 kD，理論等電點(diǎn)為8.10，包含46個(gè)帶負(fù)電荷氨基酸殘基，48個(gè)帶正電荷氨基酸殘基，無(wú)信號(hào)肽序列，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域。4個(gè)蛋白都具有2個(gè)海藻糖酶特有的標(biāo)簽序列“QWDFPNVWPP”和“PGGRFREFYYWDSY”和1個(gè)甘氨酸富集區(qū)“GGGGEY”(圖1)。

圖1 意大利蝗與飛蝗海藻糖酶的氨基酸序列比對(duì)Fig. 1 Multiple alignment of amino acid sequences of trehalase from Calliptamus italicus and Locusta migratoria飛蝗海藻糖酶蛋白序列的GenBank登錄號(hào)GenBank accession numbers of trehalase proteins from L. migratoria: LmTre-M1: AQV08185.1; LmTre-M2: AQV08187.1; LmTre-S1: AQV08186.1; LmTre-S2: ACP28173.1. 海藻糖酶特有的序列標(biāo)簽“QWDYPNAWPP”和“PGGRFREFYYWDSY”用下劃線(xiàn)表示，甘氨酸富集區(qū)“GGGGEY”用波浪線(xiàn)表示，相同的氨基酸殘基以紅色背景表示，相似的氨基酸殘基以藍(lán)色框表示。Typical sequence tags “QWDYPNAWPP”and“PGGRFREFYYWDSY”in trehalase proteins are underlined, glycine enrichment area “GGGGEY” is underlined with wavy lines, identical amino acid residues are indicated by a red background, and similar amino acid residues are indicated by a blue box.

2.2 預(yù)測(cè)的意大利蝗卵海藻糖酶基因編碼蛋白二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)

CiTreM1, CiTreM2, CiTreS1和CiTreS2的二級(jí)結(jié)構(gòu)均由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無(wú)規(guī)卷曲組成，其中，α-螺旋占比最高，分別為45.15%, 48.16%, 45.27%和48.87%；β-轉(zhuǎn)角占比最少，分別為4.85%, 4.68%, 5.27%和5.04%；延伸鏈和無(wú)規(guī)卷曲分別占10.70%和39.30%, 11.04%和36.12%, 11.64%和37.82%, 10.83%和35.26%。蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)是α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲等二級(jí)結(jié)構(gòu)通過(guò)側(cè)鏈基團(tuán)的相互作用進(jìn)一步卷曲、折疊，借助次級(jí)鍵的維系形成的。通過(guò)在線(xiàn)軟件SWISS-MODE對(duì)意大利蝗卵海藻糖酶基因蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示，4個(gè)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)較為相似，都是主要由螺旋和卷曲構(gòu)成，轉(zhuǎn)角和線(xiàn)圈占比較少，α-螺旋包圍著無(wú)規(guī)卷曲形成類(lèi)似球形的蛋白質(zhì)分子，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)相吻合。

2.3 意大利蝗卵海藻糖酶基因的序列同源性和進(jìn)化樹(shù)

將克隆得到的意大利蝗卵海藻糖酶基因與其他昆蟲(chóng)的進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)CiTreM1與飛蝗Locustamigratoria和蚜蟲(chóng)Siphaflava海藻糖酶氨基酸序列一致性分別達(dá)到88.98%和61.53%，CiTreM2與飛蝗和灰飛虱Laodelphaxstriatellus海藻糖酶氨基酸序列一致性分別為94.86%和67.01%；CiTreS1與飛蝗和人體虱Pediculushumanuscorporis的海藻糖酶氨基酸序列一致性分別為83.95%和54.26%，CiTreS2與東亞飛蝗L.m.manilensis和桃蚜Myzuspersicae的海藻糖酶氨基酸序列一致性分別為84.26%和54.43%。

系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，CiTreM1和CiTreM2與其他昆蟲(chóng)膜結(jié)合型海藻糖酶聚為一支，與飛蝗的親緣關(guān)系最近，與其他直翅目和半翅目昆蟲(chóng)膜結(jié)合型海藻糖酶的親緣關(guān)系較近(圖2)；CiTreS1和CiTreS2與其他昆蟲(chóng)可溶型海藻糖酶構(gòu)成一個(gè)分支，與東亞飛蝗的親緣關(guān)系最近，置信度為100%(圖2)。

圖2 鄰接法構(gòu)建的基于氨基酸序列的意大利蝗和其他物種海藻糖酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(1 000次重復(fù))Fig. 2 Phylogenetic tree based on amino acid sequences of trehalases from Calliptamus italicus andother species constructed by neighbor-joining method (1 000 replicates)

2.4 意大利蝗卵不同發(fā)育階段海藻糖酶基因表達(dá)及低溫馴化后表達(dá)量的變化

結(jié)果顯示，常溫27℃下意大利蝗卵3個(gè)發(fā)育階段中CiTreM1,CiTreM2,CiTreS1和CiTreS2均有表達(dá)，但變化趨勢(shì)不同(圖3)。CiTreM1在滯育解除階段表達(dá)水平最高，在滯育階段表達(dá)水平最低，3個(gè)階段的表達(dá)水平有顯著差異(P<0.05)；CiTreM2在滯育階段的表達(dá)水平最高，在滯育解除階段表達(dá)水平最低，滯育階段與早期和滯育解除階段間的表達(dá)水平差異顯著(P<0.05)。CiTreS1和CiTreS2均在早期階段表達(dá)量最高，隨后下降，CiTreS2整體表達(dá)水平低于CiTreS1表達(dá)水平(圖3)。

圖3 意大利蝗卵不同發(fā)育階段海藻糖酶基因的相對(duì)表達(dá)量Fig. 3 Relative expression levels of CiTre genes in differentdevelopmental stages of Calliptamus italicus eggs圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，柱上不同字母表示基因表達(dá)量在不同發(fā)育階段間差異顯著(P<0.05，方差分析中的LSD檢驗(yàn))。Data in the figure are mean±SD. Different letters above bars indicate significant difference in the gene expression level among different developmental stages (P<0.05, LSD in ANOVA).

在卵發(fā)育的同一階段，4個(gè)基因的表達(dá)量也明顯不同，早期階段表達(dá)量的高低順序?yàn)镃iTreS1>CiTreS2>CiTreM2>CiTreM1；滯育階段為CiTreM2>CiTreS2>CiTreS1>CiTreM1；滯育解除階段為CiTreM1>CiTreS1=CiTreM2=CiTreS2(圖3)。

低溫(0℃)馴化15 d后，與對(duì)照組(27℃)比較，CiTreM1表達(dá)量增加，且在早期階段差異極顯著(P<0.01)，在滯育階段和滯育解除階段差異不顯著(P>0.05)(圖4: A)；CiTreM2表達(dá)量在3個(gè)階段均顯著提高(P<0.05)(圖4: B)；CiTreS1表達(dá)量在早期階段極顯著下降(P<0.01)，在滯育解除階段極顯著提高(P<0.01)，在滯育階段無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖4: C)；CiTreS2表達(dá)量在早期階段顯著下降(P<0.05)，在滯育和滯育解除階段顯著提高(P<0.05)(圖4: D)。

低溫(0℃)馴化15 d后4個(gè)基因在同一發(fā)育階段的變化也不同，在早期階段表達(dá)量高低順序?yàn)镃iTreM2>CiTreM1>CiTreS2>CiTreS1，在滯育階段為CiTreM2>CiTreS2>CiTreM1>CiTreS1，在滯育解除階段為CiTreS1>CiTreS2>CiTreM2>CiTreM1(圖4)。

圖4 低溫(0℃)馴化15 d后意大利蝗卵不同發(fā)育階段海藻糖酶基因的相對(duì)表達(dá)量Fig. 4 Relative expression levels of CiTre genes in Calliptamus italicus eggs at different developmental stagesafter acclimation to low temperature (0℃) for 15 dA: CiTreM1; B: CiTreM2; C: CiTreS1; D: CiTreS2. 對(duì)照組(CK)： 以27℃下的表達(dá)量為基準(zhǔn)1。圖中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，柱上星號(hào)和雙星號(hào)分別代表與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)(T檢驗(yàn))。The control group (CK): the expression level at 27℃ was taken as the benchmark 1. Data in the figure are means±SD. Asterisk and double asterisk above bars indicate significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01), respectively, from the control group by T-test.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，意大利蝗卵海藻糖酶基因有4個(gè)拷貝，從其結(jié)構(gòu)和功能分析推測(cè)是由兩種基因復(fù)制而得，4個(gè)拷貝具有完整的編碼序列和僅存在于海藻糖酶蛋白中的特異性標(biāo)簽及一個(gè)保守的海藻糖酶超家族結(jié)構(gòu)域，表明復(fù)制基因仍具有海藻糖酶功能，共同參與調(diào)控了蝗卵越冬過(guò)程中的海藻糖代謝。CiTreS1和CiTreS2蛋白結(jié)構(gòu)不含跨膜結(jié)構(gòu)域，與飛蝗TreS同源性最高，置信度可達(dá)100%，說(shuō)明海藻糖酶基因具有高度保守的進(jìn)化特征；CiTreM1和CiTreM2在C端含有跨膜結(jié)構(gòu)域，表明其可以跨越細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)入到細(xì)胞周質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)質(zhì)中發(fā)揮作用。CiTre蛋白相似性較高，功能相似，具有類(lèi)似比例的α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲，4個(gè)基因中僅CiTreM2的編碼蛋白在N端含有信號(hào)肽，推測(cè)該蛋白可能為分泌型蛋白，可進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)到其他組織或細(xì)胞中去發(fā)揮作用(應(yīng)喜娟等, 2007)。

昆蟲(chóng)體內(nèi)海藻糖酶基因表達(dá)在不同發(fā)育階段差異較大(Guoetal., 2015)。BtTre2在煙粉虱Bemisiatabaci卵和成蟲(chóng)階段表達(dá)水平高于在若蟲(chóng)中的(Wangetal., 2014)；LdTre基因在馬鈴薯甲蟲(chóng)Leptinotarsadecemlineata1-3齡幼蟲(chóng)蛻皮期間表達(dá)量較低，蛻皮前后表達(dá)量較高，以滿(mǎn)足幾丁質(zhì)合成的需求(Shietal., 2017)。本研究表明，對(duì)照組(27℃)海藻糖酶基因在意大利蝗卵各發(fā)育階段中均有表達(dá)(圖3)，這與大多數(shù)研究結(jié)果(劉曉健等, 2012; 田宇等, 2016; 陳龍等, 2018)一致，但4個(gè)海藻糖酶基因在意大利蝗卵不同發(fā)育階段的表達(dá)各有特點(diǎn)，CiTreM1表達(dá)量先下降后上升，在滯育解除階段達(dá)到最高(圖3)，推測(cè)其參與分解海藻糖、為蝗卵孵化及幾丁質(zhì)合成提供能量有關(guān)。4個(gè)海藻糖酶基因中，CiTreM2在滯育階段的表達(dá)量最高(圖3)，這與滯育激素可增強(qiáng)家蠶卵海藻糖酶活性的研究結(jié)果(Kameietal., 2011)相似。滯育階段蟲(chóng)體內(nèi)的滯育激素水平較高(Fukuda and Takeuchi, 1967)，滯育激素可提高海藻糖酶活性(王洪亮等, 2008)，致使蝗卵滯育階段CiTreM2表達(dá)量增加，為維持蝗卵滯育階段的基礎(chǔ)代謝提供能量。4個(gè)海藻糖酶基因中，CiTreS1和CiTreM1分別在意大利蝗卵早期和滯育解除階段的表達(dá)量最高(圖3)，分析這是由于在早期階段胚胎需要消耗大量能量快速發(fā)育進(jìn)入滯育狀態(tài)以順利越冬，滯育解除后胚胎發(fā)育恢復(fù)到滯育前的活躍狀態(tài)(閆蒙云等, 2018)，蝗卵孵化和1齡若蟲(chóng)幾丁質(zhì)外骨骼合成(劉曉健等, 2012)均需能量，它們的高表達(dá)可產(chǎn)生更多海藻糖酶誘導(dǎo)海藻糖水解為葡萄糖以補(bǔ)給所需能量。

已有研究報(bào)道，越冬期間意大利蝗卵通過(guò)積累與抗寒相關(guān)的多種游離氨基酸(葛婧等, 2014)，降低過(guò)冷卻點(diǎn)和呼吸代謝水平(閆蒙云等, 2018; 任金龍等, 2021)及高表達(dá)與氧氣運(yùn)載有關(guān)的血藍(lán)蛋白基因(王香香等, 2019)等方式應(yīng)對(duì)冬季低溫。本研究發(fā)現(xiàn)，第一，低溫馴化后蝗卵不同發(fā)育階段膜結(jié)合型海藻糖酶基因表達(dá)量增加，與低溫下血藍(lán)蛋白基因Hc2的變化趨勢(shì)(王香香等, 2019)相同，而可溶型海藻糖酶基因變化與其不一致，研究結(jié)果部分驗(yàn)證了提出的假設(shè)，分析原因與兩類(lèi)不同的海藻糖酶基因的功能不同有關(guān)。可溶型海藻糖酶基因?qū)τ诶ハx(chóng)表皮中幾丁質(zhì)合成、碳水化合物攝取以及體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)動(dòng)態(tài)平衡具有重要意義，膜結(jié)合型海藻糖酶基因則主要影響中腸幾丁質(zhì)合成和生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程(張文慶等, 2011)。Chen等(2010)的研究也證實(shí)了用Treh-1和Treh-2的dsRNA干擾甜菜夜蛾Spodopteraexigua的幼蟲(chóng)和蛹，結(jié)果產(chǎn)生了不同的異常表型。其二，與對(duì)照組(27℃)相比，低溫馴化后CiTreM基因表達(dá)量在3個(gè)階段均增加，CiTreS基因僅在早期階段表達(dá)量下降，其他階段表達(dá)量增加(圖4)，說(shuō)明海藻糖酶基因參與了蝗卵對(duì)低溫脅迫的應(yīng)答，這與其他昆蟲(chóng)的研究結(jié)果(Shietal., 2016; 汪曉茜, 2018; Lüetal., 2020)相似。其三，低溫對(duì)海藻糖酶基因的影響與蝗卵發(fā)育階段有關(guān)，CiTreM1在蝗卵發(fā)育早期階段存在明顯的低溫馴化現(xiàn)象，表明蝗卵通過(guò)提高CiTreM1表達(dá)量分解海藻糖，提高蝗卵對(duì)低溫脅迫的適應(yīng)力。CiTreM2在3個(gè)發(fā)育階段的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組，并在早期階段的增幅最大，說(shuō)明不同發(fā)育階段CiTre基因?qū)囟鹊拿舾行源嬖诓町悾爽F(xiàn)象在其他昆蟲(chóng)中也有類(lèi)似發(fā)現(xiàn)，如Lü等(2020)發(fā)現(xiàn)松毛蟲(chóng)赤眼蜂Trichogrammadendrolimi在低溫脅迫后成蟲(chóng)階段TdTre基因的表達(dá)較幼蟲(chóng)更敏感。Kamei等(2011)研究發(fā)現(xiàn)家蠶膜結(jié)合型海藻糖酶活性的增強(qiáng)能夠有效促進(jìn)滯育激素誘導(dǎo)滯育卵進(jìn)入深度滯育，利于提高抗寒能力，因此，推測(cè)CiTreM2在蝗卵應(yīng)對(duì)低溫脅迫時(shí)發(fā)揮著重要作用。0℃低溫馴化15 d后，CiTreS1表達(dá)量在意大利蝗卵滯育解除階段增幅最大(圖4)，基于低溫馴化前后CiTreS1表達(dá)水平和變化幅度最大的事實(shí)判斷，其在蝗卵滯育解除后快速發(fā)育的能量供給和應(yīng)對(duì)低溫脅迫如倒春寒天氣中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

蝗卵發(fā)育階段因產(chǎn)卵時(shí)間不同，甚至同一個(gè)卵囊內(nèi)不同卵粒都會(huì)不同(任金龍等, 2015a)，為避免因蝗卵不同發(fā)育階段對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，本研究按照意大利蝗卵發(fā)育階段劃分依據(jù)，隨機(jī)選取一定量的蝗卵解剖，當(dāng)超過(guò)90%的卵發(fā)育至某一階段時(shí)方進(jìn)行取樣，以確保實(shí)驗(yàn)所用蝗卵發(fā)育階段的一致性。不同類(lèi)型的海藻糖酶基因在應(yīng)對(duì)昆蟲(chóng)所受脅迫中具有一定的協(xié)同作用(Shietal., 2019)，同理，蝗卵應(yīng)對(duì)低溫脅迫亦并非某一海藻糖酶基因起作用，但不同海藻糖酶基因之間的協(xié)作還需進(jìn)一步探討，另一方面，本研究?jī)H對(duì)海藻糖酶基因進(jìn)行克隆及低溫馴化后基因的表達(dá)變化分析，后續(xù)還需對(duì)基因進(jìn)行RNA干擾，對(duì)其功能進(jìn)行驗(yàn)證，以進(jìn)一步揭示海藻糖酶基因在意大利蝗卵越冬中的作用機(jī)制。