劉文彬，鐘景斌，王 暉,

（1.廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510006；2.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006）

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人民生活水平得到了顯著改善，我國酒精類飲料的產(chǎn)量和消耗量隨之迅速增長，我國已成為全球飲酒量上升最快的國家[1]。酒精性肝損傷發(fā)病率也呈逐年上升的趨勢(shì)，已成為僅次于肝炎病毒感染的第二大肝病[2]。酒精性肝損傷病情初期一般表現(xiàn)為酒精性脂肪肝，隨后逐步發(fā)展為酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化，嚴(yán)重酗酒還可能導(dǎo)致廣泛肝細(xì)胞壞死甚至肝衰竭[3]。

溪黃草為唇形科植物線紋香茶菜的干燥全草，俗稱熊膽草、血風(fēng)草、黃汁草等，是廣東民間習(xí)用草藥，具有清熱利濕、退黃、涼血散瘀之功能，多用于黃疸性肝炎、急性膽囊炎等疾病[4]。大量研究證實(shí)溪黃草具有明確的保肝作用，如許瓊梅等[5]報(bào)道溪黃草水提物對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型大鼠具有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、減輕肝脂質(zhì)過氧化損傷、抗氧化應(yīng)激反應(yīng)、抑制炎癥因子釋放及TGF-β1蛋白表達(dá)等有關(guān)。葉秋瑩等[6]研究發(fā)現(xiàn)溪黃草水提物對(duì)小鼠酒精性肝損傷有明顯的保護(hù)作用，作用機(jī)制與調(diào)整抗氧化酶系統(tǒng)有關(guān)，但未探討其作用機(jī)制。溪黃草主要含有萜類、揮發(fā)油類、黃酮類[7]、甾醇類、酚類、香豆素類等多種化學(xué)成分[8]。何國林等[9]報(bào)道在體外溪黃草總二萜可通過保護(hù)肝臟線粒體、調(diào)控肝臟內(nèi)源性抗氧化酶系統(tǒng)等作用發(fā)揮保肝功能。鄭玉峰等[10]報(bào)道溪黃草黃酮能通過調(diào)節(jié) MMP-9、TIMP-1、TGF-β及 PPARγ的表達(dá)抑制非酒精性脂肪性肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展。溪黃草同屬植物藍(lán)萼香茶菜來源的藍(lán)萼甲素通過TGF-β1/Smad信號(hào)通路抑制肝星狀細(xì)胞的活化，從而發(fā)揮治療治療肝纖維化的作用[11]。目前，溪黃草對(duì)酒精性肝損傷保護(hù)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和機(jī)制尚不明確，限制了其在解酒保肝中的應(yīng)用。

因此，本研究采用小鼠急性酒精肝損傷模型，觀察溪黃草對(duì)小鼠酒精肝損傷的保護(hù)效果，并首次采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析其潛在有效成分和作用機(jī)制，并對(duì)相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。通過本研究有助于進(jìn)一步明確溪黃草對(duì)急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制，以期為該產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)研究和臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

昆明小鼠 40只 SPF級(jí)，雌性，體重18～22 g，10～12周齡，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)單位使用許可編號(hào)：SYXK（粵）2017-0125，小鼠飼養(yǎng)溫度20～26 ℃，相對(duì)濕度為 50%～60%，每日光照/黑暗時(shí)間12 h；溪黃草飲片 湖北金貴中藥飲片有限公司提供，經(jīng)廣東藥科大學(xué)馬鴻雁副教授鑒定為溪黃草（Rabdosia serra）；水飛薊賓 大連美侖生物技術(shù)有限公司；紅星二鍋頭酒 北京紅星股份有限公司；蘇木素-伊紅染液 武漢谷歌生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒 美國 Pierce公司；anti-βactin抗體、anti-CYP2E1抗體、anti-Nrf2抗體 武漢博士德生物工程有限公司；生化指標(biāo)檢測(cè)試劑盒均購至于南京建成。

MD SpectraMax M2全波長酶標(biāo)儀 美國 MD公司；3K15低溫高速離心機(jī) 德國SIGMA；Tanon-5200凝膠成像系統(tǒng) 上海天能科技有限公司；超低溫冰箱 中科美菱；JJ-12J脫水機(jī) 武漢俊杰電子有限公司；JB-P5包埋機(jī) 武漢俊杰電子有限公司；RM2016病理切片機(jī) 上海徠卡儀器有限公司；正置光學(xué)顯微鏡 日本尼康。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溪黃草提取液制備 稱取20 g溪黃草，加入100 mL去離子水，浸泡過夜，煎煮2 h，多層紗布過濾去除固體殘?jiān)喜V液，旋蒸濃縮，得到溪黃草浸膏，保存于4 ℃冰箱備用，臨用時(shí)用純水配置相應(yīng)濃度溪黃草提取液[5]。

1.2.2 溪黃草提取液對(duì)酒精性肝損傷的改善作用

1.2.2.1 動(dòng)物分組、造模給藥 40只雌性昆明小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、溪黃草組、陽性對(duì)照組各10只。除空白組外，其余各組按0.1 mL/10 g灌胃52°白酒進(jìn)行造模，復(fù)制酒精性肝損傷模型[12]，連續(xù)造模10 d，每次造模1 h后，空白組、模型組給等體積蒸餾水，溪黃草組給藥劑量（相當(dāng)于4 g溪黃草生藥/kg）、陽性對(duì)照組灌胃水飛薊賓（50 mg/kg），共 10 d，造模期間無動(dòng)物死亡。溪黃草組給藥劑量根據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》（第2版）方法折算。

1.2.2.2 肝組織病理觀察 待實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取肝臟組織分為兩份，用濾紙吸干血跡，一份固定于4%的多聚甲醛，并包埋于石蠟中，切片厚度4 μm，HE染色后，顯微鏡下觀察肝臟組織的病理變化。另一份迅速投入液氮中，再轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3 生化指標(biāo)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后（最后一次灌胃結(jié)束后禁食12 h，自由飲水），小鼠眼球取血，離心分離血清。采用試劑盒法測(cè)定谷氨酸脫氫酶（Glutamic acid dehydrogenase，GDH）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）、還原型谷胱甘肽（Reduced glutathione，GSH）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶線粒體同工酶（Mitochondrial aminotransferase，m-AST）、乙醇脫氫酶（Alcohol dehydrogenase，ADH）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione Peroxidase ，GSH-Px）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）。

1.2.2.4 Western blotting檢測(cè)Nrf2、CYP2E1蛋白表達(dá) 取肝臟組織勻漿，加入裂解混合液，并離心（4 ℃，12000 r/min，15 min）。通過 BCA法測(cè)定蛋白濃度。在10% SDS-PAGE凝膠電泳上分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫封閉1.5 h，接著在4 ℃下與一抗孵育過夜：次日用TBST洗滌3次后，加入山羊抗兔IgG HRP作為二抗，室溫下孵育2 h，用 TBST洗膜3次，使用ECL化學(xué)發(fā)光顯色，采用Tanon化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)顯影，image J軟件分析蛋白條帶、計(jì)算灰度值。

1.2.3 溪黃草提取液改善酒精性肝損傷的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.2.3.1 溪黃草成分收集及靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 利用Cancer HSP（https://tcmspw.com/CancerHSP.php）、BATMAN-TCM（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）數(shù)據(jù)庫檢索溪黃草化學(xué)成分信息，結(jié)合文獻(xiàn)補(bǔ)充溪黃草成分。再通過PubChem （https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） 數(shù)據(jù)庫獲取溪黃草成分的SMILES信息，并將其導(dǎo)入 Swiss ADME（http://www.swissadme.ch/）進(jìn)行 ADME的篩選，以 GI absorption、Drug likeness為條件，對(duì)于未符合數(shù)據(jù)庫ADME要求的成分，但有相關(guān)文獻(xiàn)支撐其藥理活性的成分也納入活性成分中進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，通過ADME篩選的成分由Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/） 數(shù)據(jù)庫獲取潛在靶點(diǎn)信息，同時(shí)，將成分的CAS號(hào)輸入TCMSP獲取每個(gè)成分的OB、DL信息[13]。

1.2.3.2 酒精性肝損傷疾病靶點(diǎn)收集及交集靶點(diǎn)獲取 從 GeneCards（https://www.genecards.org/）、Dig-See（http://210.107.182.61/geneSearch/）數(shù)據(jù)庫中以“Alcoholic liver injury”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲取酒精性肝損傷的靶點(diǎn)。將兩數(shù)據(jù)庫的疾病靶點(diǎn)與成分靶點(diǎn)利用 image GP（http://www.ehbio.com/）獲取交集靶點(diǎn)，并進(jìn)行韋恩圖可視化[14]。

1.2.3.3 交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與可視化分析 將“1.2.3.2”項(xiàng)的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING（https://stringdb.org/），選擇“Homo sapiens””類型，運(yùn)行得到PPI相互作用網(wǎng)絡(luò)；設(shè)置interaction score為0.4，PPI數(shù)據(jù)輸出格式為“TSV”，并將其導(dǎo)入Cytoscape3.7.0中進(jìn)行Network Analysis拓?fù)浞治?，并?gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)可視化，利用插件CytoHubba根據(jù)度值（Degree）大小篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)，最后構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)可視化。

1.2.3.4 交集靶點(diǎn)的GO分析與KEGG富集 通過DAVID 6.8 （https://david.ncifcrf.gov/）對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集與KEGG通路富集分析，設(shè)置P＜0.05進(jìn)行篩選，對(duì)溪黃草治療酒精性肝損傷的靶點(diǎn)進(jìn)行生物過程和通路分析，并進(jìn)行可視化[15]。

1.2.3.5 活性成分-交集靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將1.2.3.1項(xiàng)的活性成分、1.2.3.2項(xiàng)的交集靶點(diǎn)、1.2.3.3項(xiàng)的關(guān)鍵通路導(dǎo)入Cytoscape3.7.0中，構(gòu)建活性成分、靶點(diǎn)、通路的作用關(guān)系，在該網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)（node）分別代表成分、靶點(diǎn)、通路，而相互作用關(guān)系以邊（edge）來表示，構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)探究溪黃草治療酒精性肝損傷的多成分，多靶點(diǎn)、多治療途徑的作用機(jī)理[16]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 溪黃草對(duì)酒精性肝損傷的改善作用

2.1.1 溪黃草對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝臟病理組織的影響 肝臟HE染色顯示，空白組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰、具有典型輻射狀結(jié)構(gòu)，胞質(zhì)均勻、紅染，結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞界線清晰，肝板排列整齊規(guī)則，肝細(xì)胞圓潤、飽滿、無變性且呈多邊形；細(xì)胞核大小正常，核質(zhì)分布均勻；模型組肝小葉界限不清，肝細(xì)胞索紊亂，肝細(xì)胞出現(xiàn)廣泛氣球樣變性，大小不一，胞質(zhì)空泡化，可見幾處局灶性壞死，并伴有炎性細(xì)胞浸潤等病理改變；與模型組相比，陽性給藥組、溪黃草組小鼠肝臟未見氣球樣變，少見匯管區(qū)有炎性細(xì)胞浸潤，大部分肝細(xì)胞接近正常形態(tài)，肝臟結(jié)構(gòu)損傷程度明顯減輕，見圖1。

圖1 溪黃草對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝臟病理組織的影響（HE 染色，200×）Fig.1 Effect of Rabdosia serra on liver histopathology of mice with alcoholic liver injury （HE staining, 200×）

2.1.2 溪黃草對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝功能的影響AST和ALT是主要的肝臟細(xì)胞功能酶[17]，m-AST和GDH為肝細(xì)胞線粒體特異酶，均可特異性地反映肝損傷的程度[18]。與空白組相比，模型組小鼠肝臟中ALT、AST、m-AST、GDH蛋白表達(dá)水平極顯著上調(diào)（P＜0.01），提示酒精性肝損傷造模成功；溪黃草組AST、m-AST、GDH蛋白表達(dá)水平顯著低于模型組（P＜0.05或P＜0.01），提示溪黃草具有較好的保肝作用。水飛薊賓組ALT和AST顯著低于溪黃草組（P＜0.05或P＜0.01），m-AST 和 GDH 兩組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表1。

表1 溪黃草對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝功能的影響Table 1 Effect of Rabdosia serra on liver function in mice with alcoholic liver injury

2.1.3 溪黃草對(duì)酒精性肝損傷小鼠酒精相關(guān)代謝酶和抗氧化指標(biāo)的影響 在飲酒初期，肝臟主要依靠酒精相關(guān)代謝酶ADH、CAT代謝酒精。與空白組相比，模型組小鼠肝臟中ADH和CAT蛋白表達(dá)水平極顯著下調(diào)（P＜0.01）；溪黃草組ADH和CAT蛋白表達(dá)水平顯著高于模型組（P＜0.05或P＜0.01），提示溪黃草對(duì)肝臟酒精相關(guān)代謝酶的活性具有促進(jìn)作用。溪黃草組和水飛薊賓組在ADH和CAT無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表2。

表2 溪黃草對(duì)酒精性肝損傷小鼠酒精相關(guān)代謝酶的影響Table 2 Effect of Rabdosia serraon alcohol related metabolic enzymes in mice with alcoholic liver injury

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為當(dāng)飲酒過量時(shí)，將引起機(jī)體酒精代謝酶活性、抗氧化性以及脂質(zhì)氧化等一系列異常反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟的功能性損傷[19]。機(jī)體內(nèi)的抗氧化防御體系分為非酶類的抗氧化物質(zhì)（GSH）和酶類抗氧化物質(zhì)（SOD、GSH-Px）[20]。SOD和 GSH-Px作為肝臟氧化活性酶，參與酒精代謝過程中產(chǎn)生的ROS的氧化代謝，其值大小能夠反映肝臟的受損情況[21]。MDA為脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其值能夠間接反映機(jī)體組織過氧化的損傷程度。因此，SOD、GSHPx、GSH和MDA是反映肝臟氧化損傷的重要指標(biāo)[22]。由表3可知，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠肝臟中SOD和GSH-Px、GSH蛋白表達(dá)水平表達(dá)極顯著下調(diào)（P＜0.01），MDA蛋白表達(dá)水平極顯著上調(diào)（P＜0.01）。溪黃草組SOD和GSH-Px、GSH蛋白表達(dá)水平顯著高于模型組（P＜0.05 或P＜0.01），MDA 蛋白表達(dá)水平顯著低于模型組（P＜0.05）。本研究結(jié)果顯示溪黃草對(duì)酒精性肝損傷具有較好的抗氧化應(yīng)激作用，這與何國林等[9]研究溪黃草總二萜調(diào)控肝臟內(nèi)源性抗氧化酶系統(tǒng)等作用發(fā)揮保肝功能的結(jié)果類似。溪黃草組和水飛薊賓組在SOD、GSH-Px、GSH和MDA無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表3 溪黃草對(duì)酒精性肝損傷小鼠抗氧化指標(biāo)的影響Table 3 Effects of Rabdosia serra on antioxidant indexes in mice with alcoholic liver injury

2.2 溪黃草治療酒精性肝損傷的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

中藥具有多靶點(diǎn)和多組分的特點(diǎn)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過多向藥理學(xué)、蛋白組學(xué)、功能基因?qū)W、網(wǎng)絡(luò)可視化等技術(shù)，可用于揭示中藥的多組分與機(jī)體的復(fù)雜作用[23]，并預(yù)測(cè)其潛在的作用機(jī)制，越來越多的研究者將該方法運(yùn)用于中藥的藥理學(xué)研究[24-25]。

2.2.1 溪黃草成分獲取與靶點(diǎn)收集 經(jīng)過篩選后，以“溪黃草”為關(guān)鍵詞在Cancer HSP、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫篩選出符合靶點(diǎn)預(yù)測(cè)的活性成分5個(gè)，同時(shí)，由文獻(xiàn)補(bǔ)充12個(gè)成分，共收集溪黃草17個(gè)活性成分，信息見表4。由Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)17個(gè)成分的靶點(diǎn)，經(jīng)去重，獲得431個(gè)成分靶點(diǎn)。

表4 溪黃草活性成分Table 4 Active components of Rabdosia serra

2.2.2 疾病靶點(diǎn)構(gòu)建 從GeneCards（紫圈）、DigSee（藍(lán)圈）數(shù)據(jù)庫分別收集到5230、217個(gè)相關(guān)疾病靶點(diǎn)，將疾病靶點(diǎn)（黑圈）與成分靶點(diǎn)取交集獲得34個(gè)溪黃草治療酒精性肝損傷潛在的共同靶點(diǎn)，見圖2。

圖2 共同靶點(diǎn)韋恩圖Fig.2 Wayne diagram of common target

2.2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 由String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape3.7.0中，得到33個(gè)節(jié)點(diǎn)，155條邊的 PPI網(wǎng)絡(luò)，平均度值（degree）為7.42，以 degree≥7.42為篩選條件，篩選出18個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，利用Cyto-Hubba根據(jù)degree大小顯示不同的顏色，顏色越深表示degree越大，該靶點(diǎn)作用關(guān)系越重要。在該網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)為靶點(diǎn)，邊表示靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，見圖3。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選Fig.3 PPI network construction and key target screening

2.2.4 GO生物功能注釋與KEGG富集通路分析結(jié)果 對(duì)溪黃草治療酒精性肝損傷的34個(gè)共同靶點(diǎn)通過DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO功能富集與KEGG通路分析，由GO富集顯示得到生物學(xué)功能條目58個(gè)（P＜0.05），其中，生物過程（BP）為 44 條，細(xì)胞組成（CC）為 4 條，分子功能（MF）為 10 條，見圖4。34 個(gè)靶點(diǎn)參與炎癥應(yīng)答、免疫響應(yīng)、IL-8和一氧化氮生物合成過程的調(diào)控、自噬的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞因子分泌的正調(diào)控、參與活性氧代謝過程、調(diào)控內(nèi)在凋亡信號(hào)通路等發(fā)揮關(guān)鍵治療作用的生物過程；在分子功能方面，發(fā)揮調(diào)節(jié)絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、血紅素結(jié)合、類固醇激素受體活性、過氧化物酶活性、趨化因子受體活性、氧化還原酶活性、脂多糖結(jié)合等功能作用，提示溪黃草通過體內(nèi)的多種生物學(xué)過程發(fā)揮治療酒精性肝損傷的作用。KEGG通路富集得到（P＜0.05）23條信號(hào)通路，提示溪黃草活性主要涉及調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)通路、乙型肝炎、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、細(xì)胞凋亡通路、NF-κB信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、非酒精性脂肪性肝病通路、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路等關(guān)鍵通路發(fā)揮抗酒精性肝損傷治療作用，見圖5。

圖4 GO功能注釋分析Fig.4 GO function annotation analysis

圖5 關(guān)鍵KEGG通路富集分析Fig.5 Enrichment analysis of key KEGG pathways

2.2.5 活性成分-靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 由溪黃草活性成分、共同靶點(diǎn)、關(guān)鍵通路構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)，見圖6。該網(wǎng)絡(luò)中包含61個(gè)節(jié)點(diǎn)，151條邊，紫色倒三角代表活性成分、深紅色橢圓形表示靶點(diǎn)、深綠色方形代表關(guān)鍵通路，邊表示成分、靶點(diǎn)、通路三者的作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。利用Network Aanlyzer 插件對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋽?shù)據(jù)分析，平均度值（Degree）為4.95，平均介數(shù)（Betweenness Centrality）為 0.03，平均中心性（Closeness Centrality）為0.34。根據(jù)度值大小，從活性成分角度，咖啡酸、迷迭香酸、槲皮素、胡麻素、異鼠李素是溪黃草中最有可能的活性物質(zhì)，均具有保肝作用。咖啡酸是一種酚酸，咖啡酸及其衍生物均具有抗氧化和保肝等生物活性，迷迭香酸可通過調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路預(yù)防DEN誘導(dǎo)的大鼠原發(fā)性肝癌，槲皮素[26]可通過加強(qiáng)機(jī)體的抗氧化應(yīng)激水平相關(guān)，而且與抑制NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮保肝作用。度值靠前5位的靶點(diǎn)有Nrf2、CYP2E1、PTGS2、MMP9、MMP2 。由該網(wǎng)絡(luò)可見，多成分作用不同的靶點(diǎn)，靶點(diǎn)參與不同通路的調(diào)控，顯示溪黃草通過在多成分作用于多靶點(diǎn)，參與多通路的調(diào)控發(fā)揮治療酒精性肝損傷的作用機(jī)制。

圖6 溪黃草成分-靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)Fig.6 Network of Rabdosia serra component-target-key pathways

2.2.6 Western-blot驗(yàn)證關(guān)鍵靶點(diǎn)Nrf2、CYP2E1表達(dá)情況 過量飲酒時(shí)，可大幅誘導(dǎo)CYP2E1的上調(diào)且伴隨ROS的產(chǎn)生，導(dǎo)致機(jī)體氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡。當(dāng)酒精誘導(dǎo)CYP2E1水平上升時(shí)，Nrf2被激活且水平上調(diào)來對(duì)抗自身產(chǎn)生的氧化應(yīng)激[27]，引起機(jī)體保護(hù)性適應(yīng)性反應(yīng)，此外藥物上調(diào)Nrf2可進(jìn)一步對(duì)抗酒精引起的氧化損傷發(fā)揮保護(hù)作用[28]。與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠肝臟中Nrf2、CYP2E1蛋白表達(dá)水平表達(dá)極顯著上調(diào)（t=7.767，P＜0.01；t=7.199，P＜0.01）；經(jīng)溪黃草給藥干預(yù)后，溪黃草組與模型組相比，Nrf2 蛋白表達(dá)極顯著上調(diào)（t=5.059，P＜0.01），CYP2E1蛋白表達(dá)極顯著下調(diào)（t=4.112，P＜0.01），見圖7。本研究結(jié)果顯示溪黃草可下調(diào)CYP2E1的表達(dá)降低氧化氧化應(yīng)激反應(yīng)，并上調(diào)Nrf2對(duì)抗酒精引起的氧化損傷作用。

圖7 溪黃草對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)Nrf2、CYP2E1蛋白表達(dá)的影響± s，n=3）Fig.7 Effect of Rabdosia serra on the expression of Nrf2 and CYP2E1 protein± s，n=3）

3 結(jié)論

溪黃草為廣東習(xí)用中藥，尤其是連州產(chǎn)的溪黃草已成為國家地理標(biāo)志性產(chǎn)品。溪黃草雖保肝作用明確，但其作用機(jī)制和物質(zhì)基礎(chǔ)不詳，限制了其在臨床中的應(yīng)用。本研究通過建立小鼠酒精性肝損傷模型，考察了溪黃草對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用，創(chuàng)新性的通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)其有效成分和作用靶點(diǎn)進(jìn)行了推測(cè)并進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示，溪黃草可明顯改善酒精導(dǎo)致的肝損傷，提高肝臟內(nèi)酒精相關(guān)代謝酶，通過增強(qiáng)非酶抗氧化和抗氧化酶的活性而提高對(duì)ROS的清除能力，降低脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，其分子機(jī)制可能與溪黃草抑制CYP2E1水平升高，激活Nrf2的表達(dá)，從而降低氧化應(yīng)激造成的損傷相關(guān)。

本研究明確了溪黃草對(duì)急性酒精性肝損傷的保肝作用及其可能的作用機(jī)制，為該產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)研究和臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。但仍存在諸多不足，如雖對(duì)溪黃草抗酒精性肝損傷的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了推測(cè)，但未對(duì)其加以驗(yàn)證，在分子機(jī)制研究中，只對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行了驗(yàn)證，而缺乏對(duì)其完整信號(hào)通路的調(diào)控研究，上述不足也是課題組下一步研究的重點(diǎn)。