李 開，范譽川，丁 嵐，曾 鳴，宋 昊,

（1.北京一輕研究院有限公司，北京 101111；2.北京市食品工業(yè)研究所，北京 100075）

核桃（Juglans regiaL.），胡桃科胡桃屬，與扁桃、腰果和榛子稱為世界著名的“四大干果”[1]，在我國栽種面積廣，年產(chǎn)量居世界首位。核桃具有極高的營養(yǎng)價值和獨特的風(fēng)味，核桃仁含有61%～74%的油脂，15%～19%的蛋白質(zhì)，8%～13%的碳水化合物[2]。核桃蛋白的氨基酸種類齊全，包含8種必需氨基酸，其中，精氨酸和谷氨酸的含量較高，是重要的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來源[3]。通過蛋白酶解技術(shù)制備核桃蛋白肽越來越受到學(xué)界和工業(yè)界的關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)，核桃蛋白肽具有抗氧化、降血壓、提高免疫力、降尿酸、增強(qiáng)記憶和改善睡眠等功效[4-7]。

核桃蛋白的三級結(jié)構(gòu)在酶的作用下逐漸解離，肽鍵水解，生成能夠被人體更容易吸收的低聚肽、氨基酸。核桃蛋白酶解相關(guān)研究主要集中在核桃肽的工藝優(yōu)化[8-10]、核桃活性肽的分離鑒定[11-14]和酶解產(chǎn)物的活性分析[15-17]等。核桃蛋白酶解制備核桃肽的原料不論是核桃粕還是核桃蛋白粉，都有一定量的脂肪殘留，隨著酶解過程的進(jìn)行，脂肪暴露在空氣中發(fā)生氧化降解生成醛類和酮類等揮發(fā)性化合物[18]，生成的游離氨基酸發(fā)生Strecker降解也能產(chǎn)生醛類和酮類化合物[19]，另外游離氨基酸還會和脂肪氧化產(chǎn)物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)[20]，引起核桃蛋白酶解液的香氣成分發(fā)生變化，影響核桃肽產(chǎn)品最終的感官品質(zhì)，例如，含硫化合物含量的增加會導(dǎo)致異味的產(chǎn)生[21]。目前，研究核桃肽的酶解工藝中關(guān)注的指標(biāo)為核桃蛋白水解度、分子量分布及肽含量，而核桃蛋白酶解過程中香氣成分變化的研究幾乎為空白[17]。

本研究以核桃蛋白為研究對象，采用Protamex?蛋白酶進(jìn)行酶解，通過頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（headspace solid-phase microextractiongas chromatography-mass spectrometry, HS-SPMEGC-MS），結(jié)合相對氣味活度值（relative odor activity value, ROAV）和主成分分析（principal component analysis，PCA）分析核桃蛋白在酶解過程中的揮發(fā)性成分的動態(tài)變化規(guī)律，為核桃蛋白肽的工業(yè)化生產(chǎn)中風(fēng)味品質(zhì)的控制提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

核桃蛋白 武漢林寶萊生物科技有限公司；Protamex?蛋白酶 丹麥諾維信公司；C7～C30正構(gòu)烷烴、α-甲基肉桂醛 色譜純，美國西格瑪奧德里奇公司；其他試劑 均為分析純。

7890A-5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫科技公司；CTC自動進(jìn)樣器 廣州智達(dá)實驗室科技有限公司；SPME萃取頭（50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷） 美國Supelco公司；IKA RCT digital集熱式磁力攪拌器 德國艾卡儀器設(shè)備公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 核桃蛋白酶解 參考本實驗室優(yōu)化得到的酶解條件，按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的比例將核桃蛋白加入蒸餾水中，攪拌均勻，將pH用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)至7.0，按照5000 U/g（酶相對于蛋白的比例）加入Protamex?蛋白酶，于50 ℃水浴鍋中酶解5 h，在 0、1、2、3、4和 5 h時取樣，進(jìn)行揮發(fā)性成分檢測，重復(fù)測定3次。

1.2.2 SPME方法 對文獻(xiàn)[22]的方法適當(dāng)修改，吸取5 mL核桃蛋白酶解液，置于20 mL頂空進(jìn)樣品中，加入 1.0 g NaCl、10 μL 內(nèi)標(biāo)（0.45 mg/L 的α-甲基肉桂醛），密封。設(shè)置自動進(jìn)樣器程序為：50 ℃平衡30 min后，插入SPME萃取頭萃取50 min，最后在 GC-MS進(jìn)樣口240 ℃解析5 min，進(jìn)行 GC-MS分析。

1.2.3 GC-MS方法 參考文獻(xiàn)[22]的方法，氣相色譜柱為 DB-WAX石英毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm），進(jìn)樣口溫度為 240 ℃；升溫程序為：40 ℃保持 3 min，以 5 ℃/min 升至 120 ℃，保持 4 min，然后以10 ℃/min 升至200 ℃，保持4 min，再以20 ℃/min升至 240 ℃，保持 8 min；He流速為 1.0 mL/min，不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件為：電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，傳輸線溫度240 ℃，離子源溫度230 ℃，母離子285 m/z，激活電壓1.5 V，質(zhì)量掃描范圍35.00～500.00 m/z，溶劑延遲3 min。

未知化合物定性通過對質(zhì)譜碎片信息與NIST11譜庫（匹配度大于80）比對得出化合物信息，并將化合物的保留指數(shù)（retention index，RI）與文獻(xiàn)值進(jìn)行驗證。RI是根據(jù)改進(jìn)的Kovats法計算得出的，C7～C30正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品用與樣品分析同樣的儀器條件進(jìn)行GC-MS分析，利用得到的烷烴保留時間計算出未知化合物的保留指數(shù)[23]。同時，各化合物的濃度采用α-甲基肉桂醛為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行半定量分析。

式中：tn和tn+1為碳數(shù)為n、n+1的正構(gòu)烷烴的保留時間（min）；ti為tn與tn+1之間的第i個化合物的保留時間（min）。

式中，Cx、Ci分別為樣品揮發(fā)性化合物和內(nèi)標(biāo)化合物的濃度（μg/L）；Sx、Si分別為樣品揮發(fā)性化合物和內(nèi)標(biāo)化合物的峰面積。

1.2.4 關(guān)鍵香氣成分評價 采用ROAV評價酶解過程各揮發(fā)性化學(xué)成分對核桃蛋白香氣的貢獻(xiàn)，對樣品總體香氣貢獻(xiàn)最大的組分ROAV為100[24-25]，其余組分的ROAV計算公式如下：

式中，Ct、Ti分別是各化合物的濃度及其感官閾值；Cmax、Tmax是對總體香氣貢獻(xiàn)最大的化合物的濃度及其感官閾值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SAS軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（GLM法）、多重比較（Duncan法）和主成分分析，以P＜0.05（差異顯著）作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃蛋白酶解過程中揮發(fā)性成分的變化

2.1.1 揮發(fā)性成分種類與含量分析 如圖1、圖2、圖3所示，核桃蛋白粉酶解前共檢出55種揮發(fā)性化合物，組成及含量見表1，其中醛類化合物18種，含量為 16.10 μg/L；醇類化合物 17 種，含量為 3.35 μg/L；酮類化合物10種，含量為 2.84 μg/L；酯類化合物5 種，含量為 0.98 μg/L；烷烴 2 種，0.23 μg/L；呋喃、萜烯及其他化合物各1種。大多數(shù)化合物在之前對核桃香氣的研究中都有過報道，鮮核桃仁中香氣成分?jǐn)?shù)量比干核桃仁中的香氣成分少，特別是鮮核桃仁中醛酮類化合物較少，這是因為加工過程中會發(fā)生脂肪酸的氧化降解和α-氨基酸的Strecker降解[26-28]。經(jīng)過Protamex?蛋白酶酶解后，前3 h的酶解液都分別檢測出68種揮發(fā)性化合物，4和5 h的酶解液檢測出67種化合物。相對于酶解前，酶解后，醛類化合物增加了3種，醇類化合物增加了1種，酮類化合物還是10種；酯類化合物前3 h新增加了1種，而4、5 h比前3 h減少1種；另外新增加了3種吡嗪類化合物、1種酚類化合物和1種硫醚。酶解過程中，香氣化合物種類數(shù)基本一致，但是各種化合物的含量有一定的差異。

圖1 核桃蛋白酶解過程中揮發(fā)性成分的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components during enzymatic hydrolysis of walnut protein

圖2 核桃蛋白酶解過程中揮發(fā)性成分種類的變化Fig.2 Varieties analysis of volatile components during enzymatic hydrolysis of walnut protein

圖3 核桃蛋白酶解過程中揮發(fā)性組分含量的變化Fig.3 Content analysis of volatile components during enzymatic hydrolysis of walnut protein

2.1.2 醛類化合物分析 核桃蛋白酶解過程中揮發(fā)性化合物的含量變化見表1，醛類化合物是核桃蛋白在酶解前后種類最豐富、含量最多的揮發(fā)性物質(zhì)，而且酶解后種類增加，含量是先減少后增加。堅果中醛類化合物一般是在加工處理過程中由Maillard反應(yīng)、Strecker降解、亞油酸、亞麻酸的氧化降解生成，具有清香、果香和堅果香的特征風(fēng)味[29]。酶解前醛類化合物含量比較多的為苯甲醛（6.270 μg/L）、正己醛（6.253 μg/L）、3-甲基戊醛（0.824 μg/L）和正庚醛（0.630 μg/L），酶解后含量有明顯變化。其中，苯甲醛具有苦杏仁、堅果香[19]，含量從最初逐漸增加到5 h的14.250 μg/L，來源于苯丙氨酸的Strecker降解，并且苯甲醛一直為酶解液中含量最多的化合物；而正己醛和3-甲基戊醛的含量在酶解1 h分別降低至2.304、0.351 μg/L，酶解 1～5 h 過程中無顯著變化（P＜0.05）；正庚醛的含量酶解 5 h 降至 0.104 μg/L。異戊醛的含量從酶解前的0.158 μg/L逐漸增加至1.247 μg/L；Z-4-庚烯醛未在酶解液中檢出，還有一些化合物含量明顯降低，可能是由于酶解前含量極低，在酶解過程中持續(xù)加熱導(dǎo)致?lián)]發(fā)；另外，酶解過程中新增加了4種醛類化合物，分別是具有果香的2-甲基-2-丁烯醛、具有脂肪香的（2E,4E）-癸二烯醛、具有堅果香的2-苯基巴豆醛和E-2-己烯-4-氧代-1-醛[30]。

表1 核桃蛋白酶解過程中揮發(fā)性成分及含量變化Table 1 Changes in volatile components and their contents during enzymatic hydrolysis of walnut protein

2.1.3 醇類化合物分析 醇類化合物的總量從酶解前的3.35 μg/L升高至酶解1 h時的3.89 μg/L，然后緩慢降低至 5 h 的 2.61 μg/L（見圖3）。1-辛烯-3-醇具有蘑菇香氣[30]，是最初及酶解1～4 h時含量最高的醇類化合物，且含量隨著時間明顯降低；正己醇、正戊醇、3-甲基-2-丁醇在酶解前后的醇類化合物中也占據(jù)了很大的比例，同樣酶解5 h后顯著降低（P＜0.05）。苯甲醇和2-乙基己醇的含量酶解5 h后顯著升高（P＜0.05），甚至在5 h時苯甲醇是酶解液香氣成分中醇類含量最高的化合物。另外，糠醇只在酶解液中發(fā)現(xiàn)，它來源于Maillard反應(yīng)中糖類的降解，是Maillard反應(yīng)的重要的中間體，所以隨著酶解的進(jìn)行，酶解5 h后糠醇的含量顯著降低（P＜0.05）。

續(xù)表 1

2.1.4 酮類化合物分析 酮類化合物一般是由氨基酸分解和多不飽和脂肪酸熱氧化降解生成，酶解后含量先升高后逐漸降低。例如，3-辛烯-2-酮、2-庚酮、2-辛酮具有不同的果香和花香[30]，它們的含量經(jīng)過酶解 5 h 后顯著降低（P＜0.05）；（3E, 5E）-辛二烯-2-酮的含量經(jīng)過酶解先升高再降低，最終（5 h）與酶解前（0 h）沒有顯著差異（P＜0.05），但是酶解后其含量為酮類化合物最高。與酶解前相比，酶解5 h后苯乙酮的含量顯著升高（P＜0.05），另外，3-甲基-2-丁酮的含量在酶解后未檢出，新增加了青草香的3-庚烯-2-酮。

2.1.5 酯類及其他化合物分析 酯類化合物與酮類化合物共存時，能調(diào)節(jié)和平衡酶解液的整體風(fēng)味特征，隨著酶解的進(jìn)行，酯類化合物的總含量是逐漸降低的。酶解前含量最高的3-甲基-2-丁醇乙酸酯，酶解4 h后在酶解液中未檢出；另外，新增加了γ-巴豆酰內(nèi)酯，具有甜香和青香風(fēng)味[30]。酶解前后烷烴的種類不變，含量都顯著降低（P＜0.05）。萜烯類化合物只有D-檸檬烯一種，呈現(xiàn)令人愉悅的檸檬香氣，之前的研究發(fā)現(xiàn)，D-檸檬烯對核桃的香氣有非常重要的貢獻(xiàn)，相對含量高達(dá)12.50%[28]；雖然在酶解過程中含量有所波動，但是最終含量與酶解前沒有顯著差異（P＜0.05）。酶解前雜環(huán)類化合物只有2-正戊基呋喃，而在酶解液中檢測出了8種，新增加的有呋喃類、吡嗪類、酚類和吲哚。呋喃類化合物來源于氨基酸的分解以及與還原糖之間的Maillard反應(yīng)，不含硫的呋喃類化合物主要是甜香、水果香、堅果香和焦香。2-正戊基呋喃具有類似火腿的香氣，從酶解前的0.082 μg/L 顯著增加到酶解 5 h 時的 1.310 μg/L（P＜0.05），是呋喃類化合物中含量最高的，2-乙基呋喃具有強(qiáng)烈的焦香味和甜香味[30]。吡嗪類化合物具有明顯的焙烤香氣，對食品風(fēng)味的形成貢獻(xiàn)較大，是由α-氨基酮類化合物自身縮合或者兩種α-氨基酮類化合物之間縮合生成對應(yīng)的烷基吡嗪，取代基的數(shù)量與參與反應(yīng)的α-氨基酮的類別決定[31]。

2.2 核桃蛋白酶解過程中關(guān)鍵香氣成分的變化

核桃蛋白在酶解過程中各階段的香氣風(fēng)格是由香氣成分的含量及其香氣閾值共同決定的，一般來說，ROAV越大，該化合物對香氣貢獻(xiàn)的程度越大。為了分析核桃蛋白在酶解過程中關(guān)鍵香氣成分的變化，結(jié)合文獻(xiàn)已經(jīng)報道的化合物在水中的香氣閾值[32-35]，計算出主要香氣成分的ROAV，見表2。

表2 酶解過程中香氣成分ROAV的變化Table 2 ROAV changes of aroma components during enzymolysis

酶解前，核桃蛋白的關(guān)鍵香氣成分（ROAV≥1）有21種，其中1-辛烯-3-醇、異戊醛、正戊醛、正己醛、正庚醛、Z-4-庚烯醛、正辛醛、正壬醛和E-3-戊烯-2-酮的ROAV大于10，對核桃蛋白的整體風(fēng)味貢獻(xiàn)很大；同時，正己醇、芳樟醇和E-2-辛烯-1-醇等11種化合物對核桃蛋白的整體風(fēng)味起修飾作用（0.1≤ROAV＜1）。由此可見，果香、花香和蘑菇香構(gòu)成了核桃蛋白的主體香氣，同時帶有一定的油脂香和青草香。

隨著酶解的進(jìn)行，有的化合物的ROAV逐漸降低，從關(guān)鍵香氣成分變?yōu)樾揎棾煞?，例?-甲基-1-戊醇、正庚醇、正辛醛和E-2-辛烯醛等；同時，一些化合物的ROAV逐漸升高成為關(guān)鍵香氣成分，例如2-乙基呋喃、2-正戊基呋喃和二甲基二硫醚。酶解液的關(guān)鍵香氣成分主要是異戊醛、二甲基二硫醚、（2E,4E）-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇和正己醛等13種化合物，另有11種化合物起修飾作用，這使得酶解液的主體香氣為花香和果香。二甲基二硫醚來源于含硫氨基酸（例如半胱氨酸、甲硫氨酸）的降解，先通過Strecker反應(yīng)生成硫醇，再通過氧化反應(yīng)生成，它為酶解液帶來了較重的洋蔥香和大蒜香，在蛋白類產(chǎn)品中含硫揮發(fā)性成分往往是產(chǎn)生異味的關(guān)鍵因素[36]。

續(xù)表 2

2.3 主成分分析

為了更好地研究酶解過程中的關(guān)鍵香氣成分，對ROAV≥1的關(guān)鍵香氣成分進(jìn)行了主成分分析，結(jié)果見表3，前兩個主成分的累計貢獻(xiàn)率達(dá)到了95.85%，因此前兩個主成分就能很好地概括原始數(shù)據(jù)的大部分信息。從圖4可見，第一主成分中正戊醛、正壬醛、正庚醛、正己醛、D-檸檬烯、正辛醛、3-辛烯-2酮、3-甲基-2-丁醇乙酸酯、E-2-辛烯醛、癸烷、苯乙醛、Z-4-庚烯醛、1-辛烯-3-醇、3-甲基-1-戊醇和 2-庚酮具有較大的正系數(shù)，二甲基二硫醚和異戊醛具有較大的負(fù)系數(shù)；第二主成分中2-乙基己醇、2-乙基呋喃、（2E,4E）-癸二烯醛和2-正戊基呋喃的系數(shù)最大，Z-4-庚烯醛和二甲基二硫醚的系數(shù)最小。從圖5可以看出，第一主成分能很好地將酶解前和酶解后區(qū)分開，說明酶解前后醛類化合物的差異比較明顯；第二主成分能將1、2 h與3、4和5 h區(qū)分開，說明2-乙基己醇、2-乙基呋喃、（2E,4E）-癸二烯醛、2-正戊基呋喃、Z-4-庚烯醛和二甲基二硫醚對酶解液的香氣構(gòu)成具有重要的影響，這與徐永霞等[19]研究的復(fù)合蛋白酶酶解藍(lán)蛤的結(jié)果類似，生成的呋喃類化合物對酶解液增香作用明顯。酶解3、4和5 h的載荷距離比較接近，說明3～5 h酶解液的香氣趨于穩(wěn)定、特征比較一致。

表3 主成分分析相關(guān)矩陣的特征值Table 3 Eigenvalues of PCA correlation matrix

圖4 酶解過程中關(guān)鍵香氣成分的PCA載荷圖Fig.4 PCA loading plot of key aroma components during enzymolysis

圖5 不同酶解時間的PCA得分圖Fig.5 PCA score plot of different enzymolysis time

3 結(jié)論

采用HS-SPME-GC-MS分析了Protamex蛋白酶對核桃蛋白在酶解過程中的揮發(fā)性成分的動態(tài)變化情況，并結(jié)合ROAV值和PCA分析確認(rèn)了酶解過程中的關(guān)鍵香氣成分。酶解初始時共檢測出55種揮發(fā)性成分，在酶解過程中檢測出67～68種揮發(fā)性成分。通過對香氣成分的ROAV值進(jìn)行分析，核桃蛋白酶解前的關(guān)鍵香氣成分為正戊醛、1-辛烯-3-醇和異戊醛等21種化合物，隨著酶解的進(jìn)行，關(guān)鍵香氣成分逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楫愇烊⒍谆蛎押停?E,4E）-癸二烯醛等13種化合物。PCA分析結(jié)果表明，酶解液香氣結(jié)構(gòu)的改變主要受2-乙基己醇、2-乙基呋喃、（2E,4E）-癸二烯醛、2-正戊基呋喃、Z-4-庚烯醛和二甲基二硫醚的濃度變化的影響，酶解至3 h時，香氣特征趨于穩(wěn)定。研究結(jié)果將為核桃蛋白肽工業(yè)化生產(chǎn)中的品質(zhì)控制提供理論依據(jù)。