任江平， 邱錦飛， 鄒 楊， 蔡曉蓓， 徐承雷， 李 江

昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 肝膽外科， 昆明 650032

原發(fā)性肝內(nèi)膽管結(jié)石(primary intrahepatic stones, PIS)一般是指結(jié)石在左、右肝管匯合處近端的肝內(nèi)膽管發(fā)生，但不包括從膽囊內(nèi)排出并進(jìn)入肝內(nèi)膽管的結(jié)石，也不包括繼發(fā)于損傷性膽管狹窄、膽管囊腫、膽管解剖變異等其他膽道疾病所致的肝膽管結(jié)石[1-2]。肝內(nèi)膽管結(jié)石的成分主要是棕色膽色素結(jié)石。日本學(xué)者[3]進(jìn)行一項(xiàng)持續(xù)40余年共7次流行病學(xué)調(diào)查，研究結(jié)果顯示肝膽管結(jié)石主要是膽色素結(jié)石，膽固醇結(jié)石所占比例較小，為5.7%～13.1%。在中國、日本等許多亞洲國家肝內(nèi)膽管結(jié)石均為常見疾病。我國肝內(nèi)膽管結(jié)石年發(fā)病率為2%～2.5%[4]，主要集中在長江流域地區(qū)、東南沿海和西南的小部分地區(qū)。盡管近年來手術(shù)切除率顯著提升，但因PIS病情遷延、復(fù)雜，治療后復(fù)發(fā)率高。近期有研究[5-6]報道，肝內(nèi)膽管結(jié)石經(jīng)過初始治療后，結(jié)石的殘留和復(fù)發(fā)率依然較高，這使得部分患者不得不再次或多次手術(shù)，術(shù)后仍然反復(fù)復(fù)發(fā)，導(dǎo)致門靜脈高壓癥、膽汁性肝硬變和肝內(nèi)膽管局部惡變等[7]。因此，了解PIS的病因和發(fā)病機(jī)制，才能更合理地選擇防治策略[8]。PIS在病理學(xué)上表現(xiàn)為含有結(jié)石的肝內(nèi)膽管上皮慢性炎癥，膽管周圍腺體增生和壁纖維化的特點(diǎn)[9]。過去有觀點(diǎn)[10]認(rèn)為結(jié)石的發(fā)生主要與膽道感染和膽道梗阻導(dǎo)致的膽汁淤積有關(guān)。隨著進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)存在著更多復(fù)雜因素，如膽道細(xì)菌的存在、腸道菌群失衡、寄生蟲感染后的持續(xù)免疫反應(yīng)、代謝缺陷、飲食習(xí)慣、環(huán)境改變和遺傳等。這些因素均會干擾肝內(nèi)膽管的膽汁成分和膽道流體力學(xué)改變，導(dǎo)致結(jié)石的形成。

細(xì)菌感染仍是PIS的關(guān)鍵因素之一，且被越來越多的研究證實(shí)。本文擬探討細(xì)菌引起PIS的相關(guān)機(jī)理，為肝內(nèi)膽管結(jié)石的治療及術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)防提供參考。

1 細(xì)菌感染與PIS

1.1 PIS的細(xì)菌學(xué)檢測手段 以往國內(nèi)外均將正常的膽道視為一個無菌性環(huán)境[11]。近年來，隨著對膽道微生態(tài)研究的深入，健康膽道無菌的觀點(diǎn)遭受了挑戰(zhàn)。Jiménez等[12]在健康豬的膽道中檢測出細(xì)菌存在。之后Molinero等[13]首次在沒有任何肝膽疾病個體的膽汁中檢測到細(xì)菌群落。因此認(rèn)為正常膽道或許存在一個微生態(tài)系統(tǒng)，若有膽道疾病致病因素存在，該微生態(tài)系統(tǒng)的平衡就會失調(diào)，如優(yōu)勢菌群變化、菌群多樣性降低、微生物代謝改變等，從而引起結(jié)石發(fā)生。細(xì)菌和肝內(nèi)膽管結(jié)石形成之間有著密切的聯(lián)系。Tabata等[14]早在20世紀(jì)80年代研究發(fā)現(xiàn)，美國肝內(nèi)膽管結(jié)石患者并發(fā)膽道感染的發(fā)生率高達(dá)96.3%，這在當(dāng)時與日本、中國及其他東亞國家的報告相一致。以往通常使用培養(yǎng)基進(jìn)行需氧和厭氧菌培養(yǎng)，或者應(yīng)用PCR的方法鑒別出細(xì)菌。近年來，新一代高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)打破了傳統(tǒng)方法，可以從分子生物學(xué)角度研究微生物群體的所有DNA或RNA，對微生物群體的結(jié)構(gòu)多樣性及功能多樣性有了更多的了解[15]。

1.2 PIS的細(xì)菌譜 有文獻(xiàn)[16]報道20世紀(jì)50年代侯寶璋就提出細(xì)菌感染可能會導(dǎo)致肝內(nèi)膽管結(jié)石，但其未進(jìn)行后續(xù)研究。隨著檢測手段的逐漸成熟，國內(nèi)外對PIS患者細(xì)菌譜的認(rèn)識也在不斷深入(表1)。

表1 肝內(nèi)膽管結(jié)石菌群的相關(guān)研究結(jié)果

各研究報道的膽道菌群多樣性及群譜并非完全一致，可能與檢測手段、檢測樣本數(shù)量差異有關(guān)。較具有代表性的為2002年Chang等[19]對過去10年共1394例膽道感染患者的細(xì)菌譜進(jìn)行了分析，其中肝內(nèi)結(jié)石患者的膽汁細(xì)菌陽性培養(yǎng)率為67%，細(xì)菌譜以革蘭陰性菌(74%)為主，主要為大腸桿菌(36%)、克雷伯氏菌(15%)，有少量的革蘭陽性菌(15%)，如腸球菌(6%)、葡萄球菌等；極少量的厭氧菌也被發(fā)現(xiàn)，如類桿菌和梭菌。另有報道[25-26]肝內(nèi)膽管結(jié)石患者膽汁及膽管黏膜中存在幽門螺桿菌感染?？傮w上，PIS膽道感染的細(xì)菌譜在國內(nèi)外近30年來無較大變化，需氧菌中大腸桿菌、克雷伯氏菌、腸球菌、腸桿菌較為常見，而厭氧菌以梭菌和類桿菌較常見，一般厭氧菌都是伴隨著需氧菌存在?，F(xiàn)將肝內(nèi)膽管結(jié)石細(xì)菌培養(yǎng)的細(xì)菌譜占比歸納如下(表2)。

表2 肝內(nèi)膽管結(jié)石膽汁或結(jié)石細(xì)菌譜

由此可以發(fā)現(xiàn)，膽道菌群與腸道菌群譜有大量重合。上文中提到有研究者發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)膽管結(jié)石患者膽道系統(tǒng)中存在幽門螺桿菌感染也證實(shí)了膽道菌群和腸道菌群可能是相互聯(lián)系的。本中心曾于2014年對膽囊結(jié)石患者的膽道核心菌群進(jìn)行了鑒定和分析[27]，以膽囊結(jié)石患者的膽結(jié)石、膽汁及糞便的菌群為研究對象，結(jié)果顯示膽道菌群與腸道菌群譜有大量重合，并探討了膽道菌群和腸道菌群變化與膽結(jié)石形成的關(guān)系，從而對肝膽管結(jié)石的初始外科治療更加規(guī)范[28]。然而，關(guān)于膽道菌群的來源至今還沒有定論，目前普遍認(rèn)為是腸道微生物群逆行感染的重要通路。細(xì)菌通過Oddi括約肌入侵膽道導(dǎo)致感染，這被認(rèn)為是最主要因素[29]。此外，有學(xué)者認(rèn)為細(xì)菌通過門靜脈入侵也是膽道感染的途徑之一。

2 細(xì)菌在PIS發(fā)病中的可能致病機(jī)制

膽道細(xì)菌在人類色素性膽結(jié)石的發(fā)病機(jī)理和形成中發(fā)揮重要作用[30-31]，與膽囊結(jié)石、膽總管結(jié)石一樣，PIS絕大部分為色素性結(jié)石，在這些患者的膽汁樣本中細(xì)菌的16S rRNA檢出率很高[32]。著名的Maki學(xué)說[10]闡述了膽道感染與結(jié)石具有密切關(guān)系，并指出感染膽汁中細(xì)菌產(chǎn)生的大量β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase, β-G)在結(jié)石形成過程中具有著重要的作用。具體機(jī)制如下：β-G能水解結(jié)合膽紅素(conjugatebilirubin, CB)，將其分解為葡萄糖醛酸和非結(jié)合膽紅素(unconjugatebilirubin, UCB)，而后UCB與鈣離子相結(jié)合形成膽紅素鈣。目前已有大量研究發(fā)現(xiàn)許多菌群能通過β-G途徑參與PIS形成，可產(chǎn)生β-G的細(xì)菌主要為大腸桿菌，其次為部分厭氧菌，如脆弱類桿菌和梭形桿菌等，少數(shù)其他需氧菌(如幽門螺桿菌等)、兼性需氧菌也可產(chǎn)生。這種由膽道感染細(xì)菌產(chǎn)生的β-G，稱為細(xì)菌性β-G或者外源性β-G；另一種β-G由肝細(xì)胞、肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞(intrahepatic bile duct epithelial cell，HIBEC)產(chǎn)生，稱為組織性β-G或者內(nèi)源性β-G，當(dāng)組織破壞和細(xì)胞解體時被釋放。隨著對內(nèi)、外源性β-G與PIS之間關(guān)系的深入研究，發(fā)現(xiàn)組織性β-G與色素性結(jié)石形成關(guān)系更為密切[33]。此外，PIS細(xì)菌培養(yǎng)陽性率很高，但仍有極少部分的標(biāo)本中并未檢測到細(xì)菌，提示可能是患者組織性β-G發(fā)揮作用。下面將現(xiàn)階段國內(nèi)外對菌群與PIS關(guān)系的研究進(jìn)行總結(jié)并繪制機(jī)制圖(圖1)。

內(nèi)源性β-G可將CB分解，在促進(jìn)膽色素結(jié)石形成過程中起重要作用。其機(jī)制可能與革蘭陰性桿菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素有關(guān)，內(nèi)毒素引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致膽管上皮細(xì)胞損傷和內(nèi)源性β-G分泌增多，從而促進(jìn)結(jié)石形成[34](圖1途徑1)。

隨著對肝內(nèi)膽管結(jié)石發(fā)病機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)膽管周圍存在腺體組織，這是肝內(nèi)膽管結(jié)石典型的病理特征，腺體的黏液腺泡均含有豐富的中性、羧化和硫酸化黏液糖蛋白。2013年Yang等[35]發(fā)現(xiàn)含結(jié)石的HIBEC因炎癥刺激分泌的黏蛋白明顯高于正常膽管，黏蛋白分子在肝內(nèi)膽管黏膜表面形成一層膠體凝膠，充滿膽管腔內(nèi)，可造成膽汁淤滯和機(jī)械性膽道梗阻，從而為結(jié)石的形成提供條件。其內(nèi)主要包括唾液酸蛋白和硫黏蛋白等酸性物質(zhì)[36]，酸性物質(zhì)會使膽汁環(huán)境的pH值降低，導(dǎo)致膽紅素鈣和UCB的溶解度明顯下降，從而析出結(jié)晶導(dǎo)致結(jié)石形成，酸性環(huán)境亦利于有些細(xì)菌如幽門螺桿菌等生長，從而繼發(fā)細(xì)菌感染。此外，過多的唾液酸蛋白、硫黏蛋白等分子分泌后可能會在肝內(nèi)膽管黏膜表面形成一個特殊的微環(huán)境，該微環(huán)境是一個網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，脫落的細(xì)菌、細(xì)胞上皮和膽汁中的鈣鹽脂質(zhì)等物質(zhì)容易鑲嵌在其中，從而聚集導(dǎo)致結(jié)石形成、復(fù)發(fā)。PIS與膽管狹窄之間存在惡性循環(huán)，結(jié)石本身及其繼發(fā)的膽道感染均可刺激膽管壁持續(xù)增生，導(dǎo)致CPC和膽管狹窄的發(fā)生，CPC的反復(fù)發(fā)作反過來會產(chǎn)生大量的黏蛋白促進(jìn)新結(jié)石的形成，或者誘導(dǎo)膽管狹窄和膽汁淤積[37](圖1途徑2)。

注：LPS，脂多糖；CPC，慢性增殖性膽管炎；Cag A，細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白；Vac A，細(xì)胞空泡毒素。

此外，大部分細(xì)菌如大腸桿菌、克雷伯氏菌等均會產(chǎn)生磷脂酶A1，可將膽道磷脂酰膽堿分解為游離脂肪酸和溶血磷脂酰膽堿，因其具有疏水性，一方面會使脂肪酸鈣快速沉積，另一方面會使HIBEC分泌大量的黏蛋白，進(jìn)而導(dǎo)致結(jié)石形成(圖1途徑3)。

正常情況下，膽囊內(nèi)壁作為黏膜屏障，具有預(yù)防膽囊結(jié)石形成、維持正常生理功能等作用。膽囊結(jié)石患者的膽囊內(nèi)壁被破壞了局部的黏膜屏障[38]，同時會繼發(fā)其他細(xì)菌感染，細(xì)菌產(chǎn)生的外源性β-G大量分泌有利于結(jié)石的形成。由于膽囊黏膜和肝內(nèi)膽管上皮的相似性，可推測肝內(nèi)膽管黏膜屏障受到破壞可能存在相似途徑促進(jìn)結(jié)石形成(圖1途徑4)。

膽道與十二指腸菌群之間具有一定的相似性和關(guān)聯(lián)性[39]。幽門螺桿菌在較低濃度的膽汁酸中存活，通過十二指腸后依然能夠定植、生長。2007年李霆等[40]發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌不僅與大腸桿菌等其他細(xì)菌一樣能通過內(nèi)源性β-G途徑參與PIS的形成，也能通過自身產(chǎn)生的相關(guān)代謝產(chǎn)物導(dǎo)致結(jié)石形成。2006年包文中[25]通過對PIS患者膽汁及膽管黏膜進(jìn)行檢測，證實(shí)了幽門螺桿菌和幽門螺桿菌感染相關(guān)蛋白存在：在膽汁中檢測出Cag A、Vac A、尿素酶A及尿素酶B等多種細(xì)菌產(chǎn)物。除了幽門螺桿菌，大腸桿菌等細(xì)菌也能分泌大量Cag A、Vac A等代謝產(chǎn)物，在PIS患者體內(nèi)可作為一種促成核因子導(dǎo)致結(jié)石形成和復(fù)發(fā)，但其具體致病機(jī)理目前暫無進(jìn)一步研究(圖1途徑5)。

2000年曾勇等[41]對比膽汁、血清和膽囊免疫球蛋白分泌細(xì)胞在成石過程模型中的變化，證實(shí)膽汁免疫球蛋白含量與細(xì)菌感染密切相關(guān)。正常情況下膽管處于“防御”和“損傷”的動態(tài)平衡，即成核和抗成核蛋白共存,通?？钩珊苏純?yōu)勢地位，被膽道細(xì)菌感染后這一動態(tài)平衡被打破，具體機(jī)制可能是膽管內(nèi)水分吸收障礙，導(dǎo)致蛋白質(zhì)濃度升高；此外，大量分泌細(xì)胞生長后，一方面會導(dǎo)致強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，損害膽管黏膜，另一方面成核蛋白增加，為結(jié)石的形成創(chuàng)造了良好的條件(圖1途徑6)。

在PIS患者中，膽道細(xì)菌感染后會產(chǎn)生大量的UCB，與鈣離子結(jié)合從而形成膽色素結(jié)石。研究[42]表明，膽汁酸一定水平上能防止膽色素結(jié)石形成，具體機(jī)制可能是在膽汁中的其酸性能增加膽紅素鈣溶解度。但有學(xué)者[10]通過對肝內(nèi)膽紅素結(jié)石與膽總管結(jié)石的膽汁成分分析比較發(fā)現(xiàn)：肝內(nèi)結(jié)石總膽汁酸水平比膽總管結(jié)石低，其細(xì)菌代謝產(chǎn)物結(jié)合膽汁酸(如甘氨膽酸、牛磺膽酸)含量較高，說明當(dāng)膽汁酸成分改變或鈣離子/UCB水平增加，會導(dǎo)致膽管內(nèi)膽紅素鈣溶解度下降，從而形成結(jié)石(圖1途徑7)。

有研究[43-45]證實(shí)，β-G的上調(diào)可能與LPS的代謝有關(guān)。LPS是一種內(nèi)毒素，位于革蘭陰性桿菌細(xì)胞壁的最外層。2007年孫韶龍等[43]發(fā)現(xiàn)LPS可以增加小鼠肝臟細(xì)胞β-G mRNA的表達(dá)，從而參與膽色素結(jié)石的發(fā)病。目前認(rèn)為可能的機(jī)制是膽道感染菌群產(chǎn)生LPS后，與脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)結(jié)合形成LPS-LBP復(fù)合物，然后與肝細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞膜表面的CD14相結(jié)合，從而能夠被CD14轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上的Toll樣受體4(Toll like receptor 4, TLR4)，以實(shí)現(xiàn)跨膜傳導(dǎo)。當(dāng)LPS與TLR4結(jié)合后通過一系列的信號級聯(lián)反應(yīng)，激活核因子-κB(NF-κB)，活化的NF-κB可以穿梭核膜進(jìn)入核內(nèi)，最終細(xì)胞內(nèi)控制β-G的基因(GUSB基因)被啟動，從而轉(zhuǎn)錄大量的mRNA，合成更多的β-G蛋白。以上從分子水平上闡述了LPS通過相關(guān)途徑合成和釋放大量的內(nèi)源性β-G。LPS也可激活HIBEC的TLR4/NF-κB/c-myc信號通路H和PKC/NF-κB/c-myc信號通路實(shí)現(xiàn)內(nèi)源性β-G大量表達(dá)[44-45]。

迄今為止，相關(guān)研究已檢測出20多種黏蛋白，分布于機(jī)體各個器官，肝內(nèi)主要含6種黏蛋白，分別為MUC1、MUC2、MUC3、MUC5AB、MUC5AC以及MUC6[46-47]，由肝內(nèi)膽管黏膜及周圍腺體分泌，PIS患者膽管分泌的上述黏蛋白較正常肝內(nèi)膽管多。LPS刺激黏蛋白MUC2、MUC5AC上調(diào)的研究主要集中于呼吸道，其機(jī)制可能是LPS通過與TLR4結(jié)合從而轉(zhuǎn)錄和翻譯多種致炎因子，例如TNFα、IL-6等，從而誘導(dǎo)MUC5AC表達(dá)。Shen等[48]將呼吸道上皮細(xì)胞暴露于LPS后，量化了SPC-A1(一種人呼吸道黏膜下腺細(xì)胞系)中MUC5AC表達(dá)水平的變化，導(dǎo)致MUC5AC表達(dá)增加(EGFR-p38/JNK信號傳導(dǎo)通路)。由于呼吸道上皮和肝內(nèi)膽管上皮在胚胎學(xué)具有同源性，可推測LPS誘導(dǎo)肝內(nèi)膽管分泌黏蛋白增多可能存在相似途徑。此外，一些信號通路也為藥物靶點(diǎn)治療PIS提供了潛在的新策略。如LPS可通過多種分子途徑刺激MUC5AC過表達(dá)[49]，p38絲裂原活化蛋白激酶MAPK(p38MAPK)通路參加了PIS的形成過程[50](圖2)。

圖2 LPS誘導(dǎo)結(jié)石形成可能的機(jī)制

以上探討了促結(jié)石形成的機(jī)理，與之作用相反的，部分桿菌菌株具有膽汁鹽水解酶活性，能夠阻止肝膽管結(jié)石的形成[51]。國外研究[52]發(fā)現(xiàn)部分膽道細(xì)菌產(chǎn)生的膽鹽解離和多重耐藥外排泵蛋白均與細(xì)菌的膽汁耐受有關(guān)。2016年葉福強(qiáng)[53]對膽總管結(jié)石的膽汁樣本進(jìn)行宏基因組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)膽汁細(xì)菌中有13個菌種能夠編碼膽鹽水解酶，30個菌種能夠編碼外排泵蛋白，但目前暫無研究報道PIS也有類似機(jī)制。此外，中間普雷沃菌和糞腸球菌產(chǎn)生的細(xì)菌黏液和生物膜，在膽汁耐受中也發(fā)揮重要作用[54]。

3 小結(jié)

綜上所述，致石菌群對于PIS的形成過程，無論是致病菌的多樣性，還是發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，均表明了其舉足輕重的地位。通過對PIS細(xì)菌譜的研究，可以為抗感染等相關(guān)用藥治療提供依據(jù)；而對于致石菌群導(dǎo)致PIS發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識，可以幫助從根源上防治肝膽管結(jié)石形成或復(fù)發(fā)，從而尋找更有效的臨床治療方法。然而，膽道菌群感染被認(rèn)為是肝內(nèi)膽管結(jié)石形成的一個極為重要的因素，但并非獨(dú)立且唯一的因素，因其復(fù)雜性目前國內(nèi)外學(xué)者尚未達(dá)成共識，因此，探索肝內(nèi)各級膽管節(jié)段性和區(qū)域性分布的菌群，以及其代謝和微環(huán)境的相互影響有助于進(jìn)一步探討PIS形成機(jī)制，從而對該領(lǐng)域進(jìn)行多中心、多學(xué)科、多角度、多層次的研究，以便對該病的治療產(chǎn)生積極的影響。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：任江平、邱錦飛、李江負(fù)責(zé)課題設(shè)計，資料分析，撰寫論文；鄒楊、蔡曉蓓、徐承雷、李江參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；李江負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。