劉師文，張艷妮，肖 芳，周 珺，劉曉慶，熊 英，吳楊博文，龔 甜

漢坦病毒(Orthohantavirus，HV)是漢坦病毒科，正漢坦病毒屬有包膜、分節(jié)段的負鏈RNA病毒，嚙齒類動物為其自然宿主，人類通過吸入被HV感染動物的排泄物氣溶膠可引起腎綜合征出血熱(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)或漢坦病毒肺綜合征[1]。HV在世界范圍內(nèi)流行，對人類造成了嚴重危害，HFRS也是中國最嚴重的鼠傳疾病之一[2]。HV病毒基因組分為S、M、L 3個基因片段，分別編碼核衣殼蛋白、糖蛋白前體及RNA依賴的RNA聚合酶。正漢坦病毒屬目前有38個種，在我國流行最廣并明確導(dǎo)致腎綜合征出血熱的種為SEOV和漢灘病毒(Hantaan orthohantavirus，HTNV)。

高安市是江西省歷年HFRS發(fā)病最嚴重的區(qū)縣之一，從2005年開始開展人間和鼠間HFRS監(jiān)測，為國家級HFRS監(jiān)測點。2011年本實驗室基于HV部分M基因測序分析，發(fā)現(xiàn)江西上高(與高安市接壤的縣)地區(qū)出現(xiàn)了與現(xiàn)有流行SEOV株基因序列差異較大，在基因進化樹上獨立分支的SEOV(SG42/2011株)[3]， 后續(xù)在高安市持續(xù)監(jiān)測到與之高度同源的病毒(GAN44/2014、GANS49/2015株等)[4]。因為前期獲得的基因序列信息僅為M基因片段(長400 bp左右)，對流行株整體變異情況、基因組與疫苗株匹配程度等無法進行更深入的分析，所以本實驗室重點對高安市鼠類樣本開展HV病毒分離和全基因組測序研究，以期更深入了解高安市流行的SEOV變異株遺傳變異信息，為HFRS防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本 收集2021年江西省高安市鼠肺標本62份，經(jīng)實時熒光RT-PCR法檢測有6份HV陽性，2份SEOV 和4份HTNV，對6份HV核酸陽性樣本進行病毒分離。

1.2 主要試劑和儀器 Vero-E6細胞、小牛血清、胎牛血清、MEM、細胞刮刀、熒光素標記的漢坦病毒抗體與文獻[5]相同，高通量測序儀ABI Ion Gene Studio S5及測序試劑 (賽默飛)、倒置顯微鏡和熒光顯微鏡(尼康)，組織破碎儀(美國Next Advance)。

1.3 病毒分離及鑒定 采用滅菌手術(shù)剪剪下HV核酸陽性鼠肺至1.5 mL離心管中，加入適量無菌1×PBS溶液，離心管蓋好放至組織破碎儀粉碎，制成10%鼠肺樣本懸液。用封口膜封住離心管口防止離心管蓋彈開。懸液經(jīng)6 000 g，4 ℃離心10 min后，取上清0.8～1 mL接種長成75%單層的Vero-E6細胞。37 ℃吸附2 h；吸去殘留液體加入含2%牛血清的MEM維持液，37 ℃培養(yǎng)。每7 d更換1次維持液，28 d傳代1次，傳代方法按照細胞傳代方式進行。

1.4 培養(yǎng)物鑒定 分別在每次換液前吸取培養(yǎng)物上清進行核酸提取，采用實時熒光RT-PCR檢測HV核酸，方法參照文獻[6]。當實時熒光RT-PCR法檢測Ct值出現(xiàn)明顯降低且低于22時，用刮刀刮取少量細胞涂片進行直接免疫熒光檢測?？乖苽浼爸苯用庖邿晒鈾z測方法參照文獻[5]，抗原片出現(xiàn)特異性綠色熒光說明病毒分離成功。若連續(xù)傳代3次未檢出HV則分離結(jié)果為陰性。

1.5 鼠種鑒定 采用PCR方法擴增鼠肺樣本中鼠線粒體細胞色素氧化酶基因(cytb)并測序，序列通過NCBI Blast比對確定鼠種，引物和擴增方法參照文獻[7]。

1.6 分離株全基因組序列測定和分析 采用ABI Ion Gene Studio S5高通量測序儀對分離株核酸進行全基因組序列測定，采用CLC軟件對測序儀數(shù)據(jù)分析獲得全基因組序列，從GenBank下載HV參考株全基因序列，采用MEGA7.0、DNASatar等軟件對基因序列進行比對分析，以最大似然法構(gòu)建HV系統(tǒng)進化樹(參考株序列信息見表1)。將分離株基因組序列與疫苗株基因組以及文獻發(fā)表的HV B細胞和T細胞免疫表位進行比對分析，從基因?qū)用娣治鲆呙绫Ｗo效果。

表1 進化分析所用參考株的序列信息

2 結(jié) 果

2.1 實時熒光RT-PCR法檢測培養(yǎng)物上清 每次換液前吸取培養(yǎng)物上清進行核酸提取，經(jīng)熒光RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，2份樣本(GAW30/2021，GAW50/2021，均為SEOV型)隨著時間推移熒光Ct值明顯降低。GAW30/2021，GAW50/2021培養(yǎng)物上清熒光RT-PCR檢測擴增曲線圖見圖1、圖2。GAW30/2021隨著時間推移熒光強度逐漸增強，Ct值逐漸降低。GAW50/2021培養(yǎng)物核酸在21 d前熒光強度和Ct值變化不大，而在第28 dCt值發(fā)生明顯變化。其余4份陽性樣本培養(yǎng)物培養(yǎng)至3代，經(jīng)熒光RT-PCR檢測仍無特異性熒光信號，病毒分離結(jié)果為陰性。

圖1 GAW30/2021培養(yǎng)物上清熒光RT-PCR檢測圖

圖2 GAW50/2021培養(yǎng)物上清熒光RT-PCR檢測圖

2.2 直接免疫熒光檢測 分別在接種后28 d、35 d(第2代第7 d)刮取少量GAW30/2021、GAW50/2021細胞制備抗原片，采用直接免疫熒光方法檢測細胞內(nèi)病毒顆粒(圖3)。GAW30/2021、GAW50/2021分別在接種后28 d、35 d，大多數(shù)細胞內(nèi)均可見到特異性綠色熒光顆粒。

注：A為GAW30/2021培養(yǎng)物(28 d)，B為GAW50/2021(35 d)，C為Vero-E6細胞對照。

2.3 鼠種鑒定 擴增GAW30/2021、GAW50/2021鼠肺樣本中鼠cytb基因并測序，獲得兩條長411 bp鼠cytb基因序列，上傳至GenBank，登錄號分別為：MZ420337、MZ420336。 通過NCBI Blast比對確定，GAW30/2021鼠種為褐家鼠，GAW50/2021鼠種為黃毛鼠(也稱羅賽鼠)。

2.4 基因組序列分析 經(jīng)高通量測序獲得分離株GAW30/2021、GAW50/2021基因組序列，2株分離株的3個基因片段大小相同，每個基因編碼區(qū)長度一致。S、M、L基因分別含1 773、3 651、6 530個核苷酸，分別編碼429、1 133、2 151個氨基酸，核苷酸序列同源性分別為99.7%、99.0%、99.4%、氨基酸序列同源性分別為99.8%、99.7%、99.9%。分離株基因序列詳細信息可登錄NCBI網(wǎng)站，GenBank登錄號：MZ504237-MZ504242。

以最大似然法構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹(圖4、5、6)，其中SEOV 參考株S、M、L基因序列分別為21條、17條、11條，HTNV參考株為76-118株，本研究中的序列用黑圓形標志。圖中括號內(nèi)為相應(yīng)參考株基因序列的GenBank登錄號。由圖可見，分離株GAW30/2021、GAW50/2021 S、M、L基因進化樹上都分布在SEOV進化枝，與SEOV參考株遺傳距離較遠，呈獨立分枝。

圖4 漢坦病毒HV S基因核苷酸系統(tǒng)進化分析

圖5 漢坦病毒 M基因核苷酸系統(tǒng)進化分析

圖6 漢坦病毒 L基因核苷酸系統(tǒng)進化分析

GAW30/2021、GAW50/2021 與21株SEOV 參考株S基因編碼區(qū)核苷酸同源性為88.8%～94.9%，氨基酸同源性為97.7%～99.8%，與江西上高SG42/2011株關(guān)系最近；與HTNV 76-118株的M基因核苷酸同源性均為73.3%，氨基酸同源性分別為84.2%、84.5%；與17株SEOV 參考株M基因編碼區(qū)核苷酸同源性為84.3%～87.2%，氨基酸同源性為96.1%～98.3%，與HTNV 76-118株的M基因核苷酸同源性分別為71.9%，72.0%，氨基酸同源性分別為77.4%、77.6%；與11株SEOV 參考株L基因編碼區(qū)核苷酸同源性為84.3%～84.6%，氨基酸同源性為97.2%～97.8%，與HTNV 76-118株的L基因核苷酸同源性均為75.1%，氨基酸同源性均為85.4%。

GAW30/2021株與SEOV疫苗株Z37基因S、M、L基因核苷酸同源性分別為89.7%、84.9%，84.6%，氨基酸同源性分別為98.8%、96.9%、97.6%，氨基酸變異位點數(shù)分別為5個、35個、51個； GAW50/2021株與SEOV疫苗株Z37基因S、M、L基因核苷酸同源性分別為89.5%、84.9%，84.7%，氨基酸同源性分別為99.1%、97.0%、97.7%，氨基酸變異為位點數(shù)分別為4個、34個、49個。

2.5 核蛋白和糖蛋白免疫表位氨基酸變異位點分析 將分離株S和M基因推導(dǎo)氨基酸序列與已發(fā)表的文獻[8-12]中關(guān)于SEOV 核蛋白和糖蛋白上的免疫表位比較，分析分離株在免疫表位上氨基酸的變異情況。結(jié)果分離株核蛋白4 個免疫表位：72GKNIGQDRDPTGVEPGDHLKERSALSYGNTL-DLNSLDID110、165YEDVNGIRKP174、251PIAGSLSGNPVNRD264、338MRNTIMASK346均未發(fā)生氨基酸改變。Z37疫苗株與GAW30/2021、GAW50/2021株糖蛋白2個免疫表位(435GQKKTILTKTLVIGQ451、880PFSCPEFGQFRKKC894)中氨基酸序列一致。

3 討 論

HV病毒分離是HV病原學(xué)研究非常重要的技術(shù)手段，該病毒分離技術(shù)早在20世紀80年代就已建立，在可分離的病毒中HV屬于較難分離的病毒[13]。因為對樣本要求高，分離周期長，病毒分離率低等原因，HV病毒分離技術(shù)應(yīng)用得越來越少。中國現(xiàn)階段使用的HFRS疫苗毒株主要為20世紀80年代分離，隨著病毒的變異，存在現(xiàn)有疫苗對流行株缺乏免疫保護作用的風險。開展病毒分離，儲備新的HV毒株，對開展流行毒株的抗原性及疫苗保護效能研究、指導(dǎo)HFRS疫情防控有非常重要的意義。

本研究從江西省HFRS重點疫區(qū)高安市分離到2株SEOV，2株分離株與國內(nèi)外SEOV參考株全基因組核苷酸差異較大，同源性為84.3%～94.9%，氨基酸同源性為96.1%～99.8%，在系統(tǒng)進化樹上獨立分枝，證實了高安市鼠間流行的SEOV基因組發(fā)生了較大變異。目前尚未在人間HFRS疫情中發(fā)現(xiàn)該病毒，后期應(yīng)加強人間疫情的監(jiān)測。成功分離2株SEOV變異株，豐富了我國SEOV毒種的基因型別。

接種疫苗是預(yù)防HFRS最有效的手段。2株分離株與SEOV疫苗株Z37 基因組核苷酸差異較大，同源性為84.6%～89.7%，但氨基酸同源性仍較高，為97.6%～99.1%；核蛋白和糖蛋白的免疫表位氨基酸序列與Z37一致。因此，推斷流行株雖然發(fā)生了較大變異，但是目前疫苗對流行株仍具有保護力，還應(yīng)當持續(xù)監(jiān)測病毒變異情況。

HV不同種病毒通常有穩(wěn)定的宿主，如HTNV宿主主要是黑線姬鼠，SEOV宿主主要為褐家鼠[14]。本研究現(xiàn)場采樣時，將GAW50/2021鼠種定為臭鼩鼱，通過鼠cytb基因檢測，確定GAW50/2021鼠種為黃毛鼠(也稱羅賽鼠)。因此，我們認為僅依靠鼠種外形特征以及采樣人員的經(jīng)驗判斷鼠種，容易產(chǎn)生誤差。在確定病毒來源物種時，尤其是在得出“宿主溢出”[15]“宿主轉(zhuǎn)換”[16]結(jié)論時應(yīng)結(jié)合分子生物方法對鼠種進行鑒定。

本研究成功分離到2株SEOV變異株，豐富了我國SEOV毒種的基因型別，經(jīng)全基因序列分析，推斷目前疫苗對變異株仍具有保護力，為HFRS防控提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突：無

引用本文格式：劉師文，張艷妮，肖芳，等. 江西省高安市兩株漢城病毒分離鑒定及全基因組序列分析[J]. 中國人獸共患病學(xué)報，2022，38(2)：102-107. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.023