劉 佳，李金鞠

流行性感冒(簡稱流感)是由流感病毒引起的上呼吸道傳染性疾病，對健康的危害極大，是世界衛(wèi)生組織列為實行全球監(jiān)測的首要傳染病。流感病毒屬于正粘病毒科流感病毒屬，由分8個節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA組成，外部有包膜。根據(jù)核蛋白的抗原性分為甲、乙、丙、丁4個型別，根據(jù)血凝素(Hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase，NA)蛋白的抗原性差異，甲型流感病毒又可以分為多種亞型，目前人群中流行的主要是新甲型H1N1，H3N2，乙型Victoria與乙型Yamagata 4種亞型[1]。自1968年香港暴發(fā)H3N2流感大流行后，H3N2型流感病毒已成為流感流行的主要病原之一[2]。HA 和NA作為流感病毒主要表面抗原，是引起流感病毒發(fā)生抗原性漂移的主要因素，在病毒感染和傳播過程中起著至關(guān)重要的作用。本研究通過分析2018-2020 年克拉瑪依市H3N2流感病毒HA和NA基因的變異情況，及時掌握本地流感病毒流行動態(tài)和進(jìn)化方向，為H3N2 的防治工作提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 采集2018年1月至2020年12月哨點醫(yī)院流感樣病例咽拭子2 073份，經(jīng)Real-Time PCR鑒定127份為H3N2，20株用MDCK細(xì)胞完成病毒分離培養(yǎng)，其中18株測序成功(2018年初毒株2株，2019年底毒株9株，2020年初毒株7株)。

1.2 基因擴增和測序測定 采用Sanger測序方法測定HA和NA基因序列。上海伯杰生物有限公司負(fù)責(zé)完成此次擴增及測序工作。

1.3 基因序列比對及進(jìn)化樹構(gòu)建 將WHO推薦的2017-2018年北半球H3N2流感疫苗株A/Hong Kong/4801/2014、2019-2020年北半球H3N2流感疫苗株A/Kansas/14/2017以及2013-2019年國內(nèi)其他省份部分H3N2流感分離株作為參比序列，采用Mega多功能基因分析軟件將已測定序列的分離株同參比序列進(jìn)行比對和分析，比較其基因同源性、受體結(jié)合位點和糖基化位點。

2 結(jié) 果

2.1 HA和NA基因同源性與進(jìn)化分析 HA和NA基因進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示(圖1、圖2)，HA基因經(jīng)計算與A/Hong Kong/4801/2014同源性在98.63%～99.15%，與A/Kansas/14/2017同源性在97.60%～98.02%。2018-2020年克拉瑪依市的流行毒株HA基因與2017-2018年北半球H3N2流感疫苗株A/Hong Kong/4801/2014較為接近，大部分與國內(nèi)其他省份2017-2019年分離株在同一大分支上。NA基因經(jīng)計算與A/Kansas/14/2017基因同源性在98.08%～98.70%，與A/Hong Kong/4801/2014同源性在97.01%～98.24%，與2019-2020年北半球H3N2流感疫苗株A/Kansas/14/2017較為接近，全部與同時期國內(nèi)其他省份分離株在同一大分支上。

注：●為疫苗株 疫為克拉瑪依市分離株；▲為克拉瑪依市分離株；未標(biāo)記為國內(nèi)其他省份分離株。

注：●為疫苗株 疫為克拉瑪依市分離株；▲為克拉瑪依市分離株；未標(biāo)記為國內(nèi)其他省份分離株。

2.2 HA和NA基因抗原決定簇及受體結(jié)合位點分析 流感病毒H3亞型HA上有5個抗原決定簇(A、B、C、D、E)位于重鏈上。A位于由140～146位氨基酸形成的突出環(huán)上及133～137位氨基酸；B位于155～160位及球區(qū)末端圍繞α螺旋結(jié)構(gòu)的187～198位氨基酸；C位于球區(qū)下方52～54、275和277所在的區(qū)；D由207和174位等表面氨基酸組成，E由63、78、81位和83位形成的表面氨基酸區(qū)組成[3]。

相對于A/Hong Kong/4801/2014，克拉瑪依市2018年初的毒株在HA抗原決定簇有6個氨基酸位點(135、142、160、193、198、53)發(fā)生了替換，共涉及3個抗原決定簇位點(A、B、C)；相對于A/Kansas/14/2017，2019年底至2020年初的毒株在HA抗原決定簇有7個氨基酸位點(135、137、144、159、160、53、78)發(fā)生了替換，共涉及4個抗原決定簇位點(A、B、C、E)，見表1。

表1 克拉瑪依市H3N2流感病毒HA1區(qū)抗原位點

流感病毒HA蛋白上具有受體結(jié)合位點(RBS)，呈口袋狀結(jié)構(gòu)，其中5個氨基酸(98、153、183、190、194)是保守的[4-5]。與疫苗株A/Hong Kong/4801/2014比較，2018年初毒株在5個保守位點未發(fā)生變異；與疫苗株A/Kansas/14/2017比較，2019年底至2020年初毒株也未發(fā)生變異。

2.3 糖基化位點分析 疫苗株A/Hong Kong/4801/2014的HA蛋白上有12個糖基化位點，分別為NST8-10、NGT22-24、NAT38-40、NSS45-47、NCT63-65、NWT126-128、NGT133-135、NYT158-160、NVT165-167、NST246-248、NGS285-287、NGT483-485，相對疫苗株，2018年初毒株有1株(實驗室編號A/Xinjiang-Karamay/48/2018)缺少NGT133-135糖基化位點。疫苗株A/Kansas/14/2017的HA蛋白上有10個糖基化位點，分別為NST8-10、NGT22-24、NAT38-40、NSS45-47、NCT63-65、NGT133-135、NVT165-167、NST246-248、NGS285-287、NGT483-485。相對疫苗株，2019年底至2020年初毒株全部缺少NGT133-135，NGT483-485 2個糖基化位點，增加NYT158-160位點。

疫苗株A/Hong Kong/4801/2014和A/Kansas/14/2017的NA蛋白上糖基化位點完全一致，為NIT61-63、NTT70-72、NWS86-88、NNT146-148、NGT234-236、NET367-369，相對疫苗株，2018-2020年所有毒株未發(fā)生任何改變。

2.4 耐藥性分析 與耐藥相關(guān)最常見的位點突變有E119V、R292K、H274Y等，與酶關(guān)鍵位點相關(guān)突變有R118、D151、R152、R224、E276、R292、R371和Y 406，本次研究未發(fā)現(xiàn)上述位點變異，也未發(fā)現(xiàn)具有穩(wěn)定活性中心作用的活性周圍位點突變。

3 討 論

流感病毒之所以在人群中引起多次反復(fù)流行，是由于病毒表面的HA與NA容易產(chǎn)生變異導(dǎo)致抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)換，從而逃避宿主的免疫識別與清除，使疫苗免疫效果降低[6]。從2009年迄今，北半球已更換使用11種H3N2疫苗推薦株[7]，因此，通過分析2018-2020年流感流行期內(nèi)克拉瑪依市分離的H3N2病毒毒株分子遺傳特征，為流感病毒的監(jiān)測和早期預(yù)警提供科學(xué)依據(jù)。

從HA和NA基因進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，2018-2020年克拉瑪依市的流行毒株HA基因與2017-2018年北半球H3N2流感疫苗株A/Hong Kong/4801/2014較為接近，而NA基因卻與2019-2020年北半球H3N2流感疫苗株A/Kansas/14/2017較為接近。目前獲得許可的流感疫苗主要產(chǎn)生靶向病毒HA蛋白的抗體[8]。因此，對于克拉瑪依市居民來說2018-2020年接種2017-2018年WHO推薦含A/Hong Kong/4801/2014成分的疫苗可能會對H3N2起到更好的抵御作用。

在流感病毒中，抗原決定簇與RBS結(jié)構(gòu)上的密切關(guān)聯(lián)與病毒的進(jìn)化和毒力相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，相對疫苗株A/Hong Kong/4801/2014，2018年初毒株有1株(T180049)氨基酸位點同時在2個抗原決定簇(A、B)發(fā)生替換；相對A/Kansas/14/2017，2019年底至2020年初有7株毒株氨基酸位點同時在2個抗原決定簇(A、B)發(fā)生替換，有9株毒株氨基酸替換涉及4個抗原決定簇(A、B、C、E)。一般認(rèn)為，一個新的抗原變異株的出現(xiàn)并有流行病學(xué)意義，要求HA1區(qū)蛋白分子有4個以上氨基酸位點發(fā)生替換，且替換必須涉及2個及以上抗原決定簇位點[9-10]。相對疫苗推薦株，克拉瑪依市毒株RBS雖然未發(fā)生變異，但HA已經(jīng)發(fā)生抗原漂移，可能導(dǎo)致疫苗免疫保護(hù)效果降低，導(dǎo)致流感病毒的流行。

糖基化位點分析結(jié)果表明，2018-2020年克拉瑪依市流行毒株的HA蛋白均發(fā)生了糖基化位點的改變，集中在133、158和483這3個位點，且以糖基化位點消失為主；而NA蛋白未發(fā)生改變。一般認(rèn)為，糖基化位點的改變或數(shù)目的增減會影響病毒的抗原性或?qū)Σ《镜姆€(wěn)定性、傳染性和致病性產(chǎn)生一定的影響[11]。

克拉瑪依市所有H3N2毒株耐藥位點均未發(fā)生突變，因此在發(fā)病早期合理使用神經(jīng)氨酸酶抑制劑類藥物能夠有效治療流感。2019-2020年克拉瑪依市H3N2毒株與2019-2020年疫苗推薦株匹配度低于2017-2018年疫苗推薦毒株，且HA已發(fā)生抗原漂移。說明克拉瑪依市H3N2流行毒株和疫苗匹配度存在降低現(xiàn)象，可能導(dǎo)致本地區(qū)H3N2毒株流行。因此，應(yīng)繼續(xù)加強對流感病毒HA和NA基因監(jiān)測，及時篩選和更新流感疫苗，為克拉瑪依市流感防控提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突：無

引用本文格式：劉佳，李金鞠. 2018-2020年克拉瑪依市甲型H3N2流感病毒分子特征分析[J]. 中國人獸共患病學(xué)報，2022，38(2)：141-144，149. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.028