符雅楠 李進 尹利輝，* 馮芳 姚尚辰 許明哲

(1 中國食品藥品檢定研究院，北京 102629；2 中國藥科大學，南京 211198)

據(jù)國家藥品不良反應監(jiān)測年度報告[1]、北京藥物警戒[2](BPD)和解放軍藥品不良反應報告[3]等數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計，近幾年來抗生素類藥物依舊被歸于藥源性過敏反應(DIA)發(fā)生中的最常見的原因。其中，β-內(nèi)酰胺類抗生素相關過敏反應以頭孢菌素類抗生素為主，發(fā)生頻率最高。其原因可能為頭孢菌素類抗生素在國內(nèi)使用率更高，且頭孢菌素類抗生素的常規(guī)皮試測試敏感性低，可能不適用于預測即時的超敏反應，因此頭孢菌素類抗生素的過敏反應研究值得高度重視。頭孢菌素類抗生素不同于一些青霉素類抗生素，均是由天然頭孢菌素C經(jīng)側(cè)鏈等結(jié)構(gòu)改造形成的一系列半合成抗生素，因此，由發(fā)酵工藝中形成的蛋白結(jié)合物類大分子雜質(zhì)可不作為研究對象[4]，聚合物雜質(zhì)是引起其過敏的關鍵因素。

不同聚合程度的聚合物雜質(zhì)一般有著相似的生物學特性，均可作為多價半抗原引起IgE介導的I型速發(fā)型過敏反應，且聚合物雜質(zhì)的致敏性也會隨著聚合程度的增大而增強[5-6]。因此，在之前的研究中，研究者們多采取控制聚合物雜質(zhì)總量的方式對高分子聚合物雜質(zhì)進行質(zhì)量控制，但隨著分離技術的快速發(fā)展、人們對聚合物雜質(zhì)結(jié)構(gòu)、反應機理、裂解規(guī)律的認識進一步加深，聚合物質(zhì)控的理論也已由總量控制發(fā)展為對指針性聚合物雜質(zhì)進行精準控制[7]。指針性聚合物雜質(zhì)分析方法的建立目前需要運用到二維液相色譜(2D-HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)等分析技術，檢測時間長、工作量較大，聚合物雜質(zhì)標準物質(zhì)的制備難度也較大，因此該類雜質(zhì)在質(zhì)控發(fā)展道路上還存在著一些挑戰(zhàn)。本文綜述了近年來該領域的發(fā)展，對頭孢菌素類抗生素聚合物質(zhì)控的分析方法、結(jié)構(gòu)研究等趨勢及進展，提出了仍需進一步思考和研究的問題。

1 頭孢菌素類抗生素聚合物雜質(zhì)的分析方法

1.1 葡聚糖凝膠G-10分子排阻色譜法(Sephadex G-10 SEC)

SEC法，又稱凝膠色譜法(GPC)，主要依據(jù)混合物分子量大小的差異預測分離，適用于對未知樣品的探索性分析。其中，β-內(nèi)酰胺類抗生素聚合物雜質(zhì)質(zhì)控的難點之一就是聚合物雜質(zhì)峰的識別問題，我國曾首次采用自身對照外標法定量，建立了Sephadex G-10凝膠色譜定量測定聚合物雜質(zhì)的研究方法[8]。采用葡聚糖凝膠G-10柱，利用β-內(nèi)酰胺類抗生素可于特定條件下，如水溶液中形成締合物，在凝膠色譜系統(tǒng)中產(chǎn)生和聚合物雜質(zhì)相似色譜行為的原理[9]，在雜質(zhì)控制過程中可免去標準品雜質(zhì)，較容易地控制聚合物雜質(zhì)的總量。高丹玲等[10]采用G-10凝膠色譜系統(tǒng)測定了注射用頭孢尼西鈉中的聚合物雜質(zhì)，實驗結(jié)果表明聚合物雜質(zhì)的有效分配系數(shù)(Kav)趨近于0，能完全排阻，驗證了方法的可行性。陳霞等[11]對流動相A中緩沖鹽濃度、pH和流動相B中水溶液的組分進行了方法學優(yōu)化，最終建立了G-10柱測定注射用復方頭孢西丁鈉中聚合物雜質(zhì)的分析方法。何建紅[12]在采用Sephadex G-10法分析注射用頭孢唑肟鈉聚合物雜質(zhì)時發(fā)現(xiàn)，藥物濃度越高時，頭孢唑肟鈉中的聚合物雜質(zhì)峰面積雖然更高，但穩(wěn)定性更差，為保持實驗結(jié)果的準確性，需要在配液后立即取樣檢測。

在采用葡聚糖G-10凝膠柱進行分離分析時，所有聚合物雜質(zhì)在該色譜系統(tǒng)中均表現(xiàn)為單一的色譜峰，不具備區(qū)分不同分子量聚合物雜質(zhì)的能力，可能使得某些聚合物雜質(zhì)由于聚合程度小而與后面的小分子藥物峰重疊，難以辨別聚合物雜質(zhì)的存在[13]；此外，無論是對于劑型為干混懸劑、片劑、膠囊劑等可能添加藥用高分子輔料的頭孢菌素類抗生素藥物還是含β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的復方制劑[11，14]，在運用G-10柱分析時，藥用輔料和酶抑制劑都均有可能干擾聚合物雜質(zhì)的出峰情況。其次，該方法檢測靈敏度較低，進樣所需的樣品濃度一般比較大，藥物主峰通常呈現(xiàn)一個超載的色譜峰，使得柱效極低。同時，一些頭孢菌素類抗生素在特定條件下還會出現(xiàn)無法完全締合的情況[15]，導致定量結(jié)果的不準確。

1.2 高效分子排阻色譜法(HPSEC)

HPSEC法采用以高效凝膠色譜填料作為填充劑的色譜柱進行分離，靈敏度相對較高，不需要像Sephadex G-10柱凝膠色譜法一樣采用復雜的流動相體系，操作簡單，具備一定程度上區(qū)分不同分子量聚合物雜質(zhì)的能力。石海英等[16]選用TSK-Gel 2500PWXL柱測定了頭孢克肟干混懸劑中的聚合物雜質(zhì)，一定程度上解決了葡聚糖G-10色譜柱條件下由于其高分子助懸劑輔料的影響，聚合物雜質(zhì)峰無法與主峰完全分離的難題。曹靖等[17]建立了TSK gel G2000SWxl凝膠系統(tǒng)分離分析頭孢克洛分散片聚合物雜質(zhì)的方法，克服了該品種在使用Sephadex G-10系統(tǒng)分析時時間過長，無法完全在流動相B中締合，需尋找合適對照品的問題。張斗勝等[18]通過HPSEC法測定注射用鹽酸頭孢替安聚合物雜質(zhì)發(fā)現(xiàn)采用TSK凝膠系統(tǒng)除了根據(jù)分子量差異進行分離，還可根據(jù)化合物的極性進行分離分析，具有類似液相色譜柱的功能。錢璟[19]在分析頭孢呋辛酯片聚合物雜質(zhì)時，由于該品具有脂溶性，在水中不溶，因而考慮采用流動相含可與水完全互溶的有機溶劑的TSK-gel凝膠色譜系統(tǒng)，方法分離效果佳，也為該類脂溶性藥物提供了有效的聚合物質(zhì)控手段。孫玉雙等[20]建立了TSK凝膠色法測定頭孢丙烯干混懸劑中的聚合物雜質(zhì)含量，克服了Sephadex G-10系統(tǒng)對頭孢丙烯產(chǎn)生的吸附影響。李敏等[21]采用TSK gel G2000HHR柱經(jīng)篩選條件和方法學驗證后建立了測定頭孢妥侖匹酯片中聚合物雜質(zhì)含量的方法，該方法能有效分離其聚合物雜質(zhì)。熊雯等[13]比較了以葡聚糖凝膠G-10和TSK gel G2000SWxl為填充劑的兩種不同的HPSEC法，測定了注射用頭孢地嗪鈉中聚合物雜質(zhì)的含量，結(jié)果表明后者專屬性好、靈敏度更高，能更全面地反映頭孢地嗪鈉中聚合物雜質(zhì)的情況。

HPSEC法雖然較好地克服了Sephadex G-10凝膠色譜系統(tǒng)的不足，但因具有相似的分離機制，聚合物雜質(zhì)峰易受到藥物中某些小分子雜質(zhì)及輔料等共出峰干擾，從而影響聚合物雜質(zhì)定量的準確性。并且，凝膠介質(zhì)除了具有分子排阻作用外，還會產(chǎn)生吸附、疏水等非排阻作用[22]，影響聚合物雜質(zhì)分離的專屬性。同時，還存在待分析化合物在高效分子排阻系統(tǒng)中的洗脫順序不一定完全按照相對分子質(zhì)量大小排列等問題。因此，隨著HPSEC法的廣泛應用，亟需對高效分子排阻色譜分離得到的聚合物雜質(zhì)峰的專屬性予以驗證。

1.3 反相高效液相色譜法(RP-HPLC)

在RP-HPLC中，樣品組分根據(jù)極性大小相繼被洗脫。通過調(diào)節(jié)流動相組成及性質(zhì)、色譜柱填充性能、柱溫、流速等參數(shù)，各組分保留時間、分離能力等將得到不同程度的改善，因此該法專屬性強、靈敏度高且定量準確，應是研究抗生素中聚合物雜質(zhì)的首選分析方法。王建等[23]通過建立HPLC-UV梯度洗脫的方法同時測定了鹽酸頭孢他美酯中的有關物質(zhì)和兩種二聚體雜質(zhì)。彭潔等[24]經(jīng)篩選后采用C8柱，建立了RP-HPLC對頭孢呋辛酯及其制劑中聚合物雜質(zhì)的測定，并對洗脫方式及磷酸鹽濃度等色譜條件進行了優(yōu)化，結(jié)果顯示，方法專屬性強，聚合物雜質(zhì)能實現(xiàn)較好分離。李進等[25]在進行頭孢拉定原料及其制劑中的聚合物雜質(zhì)研究時，對比了HPSEC和RP-HPLC兩種方法。結(jié)果顯示，HPSEC法測定樣品中聚合物雜質(zhì)含量結(jié)果不準確，而新建立的RP-HPLC法柱效更高、專屬性更強，適用于頭孢拉定原料及制劑的聚合物雜質(zhì)相關質(zhì)控，也為精準控制β-內(nèi)酰胺類抗生素中的指針性聚合物雜質(zhì)的分析方法奠定了基礎。

但聚合物雜質(zhì)峰在RP-HPLC系統(tǒng)中較難定位，且聚合物雜質(zhì)極性一般弱于小分子雜質(zhì)，通常在色譜系統(tǒng)中洗脫時間較長，易出現(xiàn)漏檢的情況。因此，在利用RP-HPLC檢測聚合物雜質(zhì)時，方法開發(fā)方面存在著較大的難題。目前，大多數(shù)研究者在研究聚合物雜質(zhì)時通常參照藥典方法，查閱相關文獻資料，通過試錯法或單因素變量法(OFAT)對影響分離的流動相pH及緩沖鹽濃度、檢測波長、強溶劑比例、洗脫時間等因素進行比較摸索與優(yōu)化，最終建立相對合適的檢測方法。但傳統(tǒng)的方法開發(fā)通常只能比較幾個影響因素改變后產(chǎn)生的響應，無法預測當幾個參數(shù)同時發(fā)生波動時可能存在的相互影響，也不能表征單一影響因素對分離結(jié)果的影響大小[26]，因此所建立的方法是否為最優(yōu)化尚未知曉。試驗設計(DOE)作為QbD應用于HPLC分析方法的建立與驗證的主要手段，可同時研究多個變量因素對分離分析方法的影響及交互作用[27]。其主要步驟首先為通過析因設計或經(jīng)驗找到影響方法性能的關鍵方法因素為自變量，難分離雜質(zhì)的分離度、保留情況等直接影響分離結(jié)果的指標為響應因素后，再選擇合適的DOE設計模型對關鍵方法因素和響應值進行擬合，建立并評價統(tǒng)計學回歸方程，從而找到“設計空間”范圍內(nèi)的參數(shù)最優(yōu)值[28]。當前，國內(nèi)外越來越多研究者采用DOE方法開發(fā)優(yōu)化藥物的分析方法[29-33]，該試驗方法可解決傳統(tǒng)液相分析方法開發(fā)存在的方法建立后可調(diào)控性低、方法開發(fā)效率及方法轉(zhuǎn)移等方面的問題[34]，同時還可減少試驗成本、縮短方法研發(fā)時間，將成為今后液相分析方法開發(fā)的一大趨勢。

2 頭孢菌素類抗生素聚合物雜質(zhì)在國內(nèi)外藥典中的質(zhì)控研究現(xiàn)狀

2.1 中國藥典近年來對聚合物雜質(zhì)的質(zhì)控現(xiàn)狀

人們對β-內(nèi)酰胺類抗生素聚合物雜質(zhì)的研究始于20世紀70年代，為了對該類聚合物雜質(zhì)進行更有效的質(zhì)量控制，中國藥典從2000年版起采用葡聚糖凝膠Sephadex G-10法對頭孢他啶、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟鈉、頭孢哌酮鈉這4個品種的β-內(nèi)酰胺類抗生素中聚合物雜質(zhì)制定了相應檢測標準。隨著近年來分析技術的迅速發(fā)展，中國藥典不斷更新并增補對不同β-內(nèi)酰胺類抗生素中聚合物雜質(zhì)的控制。截至目前，《中國藥典》2020年版二部[35]中收載了包括青霉素類和頭孢菌素類抗生素在內(nèi)的一共40個品種。其中，收錄頭孢菌素類抗生素26個品種，48種制劑，已對其11個品種(如頭孢他啶、頭孢尼西鈉等)采用Sephadex G-10系統(tǒng)制定了聚合物雜質(zhì)的控制標準，2個品種(頭孢地嗪鈉、頭孢米諾鈉)采用高效凝膠色譜法控制聚合物雜質(zhì)。另外，對于頭孢泊肟酯和頭孢唑肟鈉這2個品種，最新版《中國藥典》(ChP2020)分別在有關物質(zhì)檢查項下增加了系統(tǒng)適用性溶液的配制方法。其中，給出了頭孢泊肟酯特定雜質(zhì)的RP-HPLC參考色譜圖，包括頭孢泊肟酯二聚體及其異構(gòu)體雜質(zhì)；明確規(guī)定了頭孢唑肟鈉二聚體峰RP-HPLC法的相對保留時間，控制二聚體檢測限度為0.1%，這將有助于今后這兩類品種聚合物雜質(zhì)的定位及控制。

2.2 國外藥典的質(zhì)控現(xiàn)狀分析

目前，《歐洲藥典》第十版(EP 10.0)[36]和《英國藥典》2020年版(BP2020)[37]中分別收錄19和20種頭孢菌素類抗生素，并分別對頭孢西丁鈉、頭孢泊肟酯、頭孢噻肟鈉這3個品種進行了含聚合物雜質(zhì)的質(zhì)量控制?！睹绹幍洹?3版(USP 43)[38]中收載了32種頭孢菌素類抗生素，共對其中7個品種(頭孢丙烯、頭孢呋辛酯、頭孢羥氨芐、頭孢噻肟鈉、鹽酸頭孢吡肟、頭孢噻呋鈉、鹽酸頭孢噻呋)的聚合物雜質(zhì)進行了控制。從各國藥典方法中得知，國際上一般采用反相高效液相色譜梯度洗脫法對聚合物雜質(zhì)進行控制，以相對保留時間對其進行初步定位，將二聚體作為主要特定雜質(zhì)進行質(zhì)量控制，但對于聚合物雜質(zhì)的質(zhì)控限度暫沒有規(guī)定統(tǒng)一的標準(表1)。

表1 國外藥典控制聚合物雜質(zhì)的限度要求Tab.1 Limit requirements for polymer impurities in foreign pharmacopoeias

《中國藥典》收錄的采用葡聚糖G-10系統(tǒng)控制聚合物雜質(zhì)的方式填補了之前國際上聚合物雜質(zhì)質(zhì)控標準中的一項空白，但目前看來，該法對各品種聚合物雜質(zhì)限度確定較為籠統(tǒng)，在實際藥品檢查中仍有需要解決的問題[39]，將無法滿足今后質(zhì)控的需求。同時，后增補的高效凝膠色譜法雖在一定程度上提高了聚合物雜質(zhì)檢測的靈敏度，其方法專屬性也已逐漸受到質(zhì)疑[40-41]。在解決聚合物雜質(zhì)定位難題之后，RP-HPLC法將有望成為聚合物雜質(zhì)控制的主要分析方法。

2.3 原料藥及制劑在聚合物雜質(zhì)質(zhì)控中的異同及進展

國內(nèi)外藥典收載的頭孢菌素類抗生素品種中，聚合物雜質(zhì)控制標準多以原料藥和注射劑為主。原料藥成分單一較易控制，而注射劑劑型較為特殊，凍干藥品經(jīng)溶解后直接注射入人體組織或血管或器官內(nèi)吸收速度快，起效迅速。特別是靜脈注射，藥物可直接進入血液循環(huán)，因聚合物雜質(zhì)而引發(fā)過敏性反應的幾率較其他制劑更大，需要嚴格控制該類制劑聚合物雜質(zhì)限度[5，42]。相對于原料而言，其他制劑如干混懸劑[16]、膠囊劑、分散片劑[17]等劑型中通常含有高分子輔料，若采用分子排阻G-10法，可能會出現(xiàn)聚合物雜質(zhì)和高分子輔料共出峰的情況，在對該類制劑進行質(zhì)量控制時，應重點排除輔料的干擾。

復方制劑的聚合物雜質(zhì)檢測則更為復雜，β-內(nèi)酰胺類抗生素復方制劑多為含β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的制劑，不僅增強了抗菌活性、擴大了抗菌譜，還能從一定程度上解決細菌的耐藥性問題[43]。但研究發(fā)現(xiàn)，在對此類復方制劑進行雜質(zhì)譜研究時，雜質(zhì)生成速度較單方制劑更快，且可能有僅在復方制劑中檢出的新未知雜質(zhì)產(chǎn)生[44]。盡管實驗表明，目前并未發(fā)現(xiàn)β-內(nèi)酰胺酶抑制劑自身聚合雜質(zhì)及β-內(nèi)酰胺類抗生素與β-內(nèi)酰胺酶抑制劑之間發(fā)生聚合的聚合物雜質(zhì)產(chǎn)生[45-46]，但β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的存在是否會影響β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生聚合物雜質(zhì)的含量、聚合程度和雜質(zhì)保留行為，以及通過何種途徑促使β-內(nèi)酰胺類抗生素的降解仍有待于進一步的研究。

3 頭孢菌素類抗生素聚合物雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究

3.1 質(zhì)譜法(MS)

MS技術的應用，讓研究者們對聚合物雜質(zhì)的復雜結(jié)構(gòu)有了更深入的認識。李曼琳等[47]采用LC-MS技術，通過飛行時間質(zhì)譜(TOF/MS)和三重四級質(zhì)譜(MS/MS)分別測定頭孢妥侖匹酯中主要有關物質(zhì)的準確質(zhì)量和子離子特征，最終共鑒定出10個主要有關物質(zhì)，其中包括頭孢妥侖匹酯二聚體和開環(huán)二聚體雜質(zhì)，與其他有關物質(zhì)相比，該類雜質(zhì)對反應溫度和時間更為敏感。蔣惠源等[48]通過超高效親水性液相色譜-電噴霧四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法，對頭孢泊肟酯中的一個二聚體進行了結(jié)構(gòu)推測，經(jīng)裂解途徑和高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)驗證推斷，該二聚體為兩分子的頭孢泊肟酸經(jīng)L型聚合反應形成。侯玉榮等[49]建立了高效液相色譜串聯(lián)離子阱-飛行時間質(zhì)譜(HPLCUV-IT-TOF)的方法對頭孢噻肟鈉進行了雜質(zhì)譜研究。對于無對照品的未知雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定(如聚合物雜質(zhì)等)，通過采用已知結(jié)構(gòu)化合物如頭孢噻肟為模型，分析已知結(jié)構(gòu)物質(zhì)與未知雜質(zhì)多級質(zhì)譜行為的異同性，從而推定其化學結(jié)構(gòu)。其中，樣品中檢出6個二聚體雜質(zhì)，為采用RP-HPLC控制該品種的聚合物雜質(zhì)及其結(jié)構(gòu)研究提供了思路。但是，聚合物雜質(zhì)存在多種聚合位點和方式，較為復雜，且在聚合過程中易產(chǎn)生多種手性異構(gòu)體，而通過質(zhì)譜圖、推斷質(zhì)譜裂解規(guī)律進行結(jié)構(gòu)解析只能初步推測聚合物雜質(zhì)的平面結(jié)構(gòu)，聚合位點以及立體化學結(jié)構(gòu)還有待通過其他波譜學方法進一步確證。

3.2 核磁共振技術(NMR)

NMR法是表征化合物結(jié)構(gòu)的重要手段，也是揭示聚合物雜質(zhì)反應機理的工具之一。Xia等[50]在不同濃度、不同pH值和不同溫度下對比阿培南進行了強制降解實驗。采用RP-HPLC和LC-MS/MS法對降解產(chǎn)物進行了鑒定，最后通過反相制備HPLC得到了一種二聚體雜質(zhì)，結(jié)合NMR法對其進行了表征，并提出了比阿培南可能的降解途徑。王丹丹等[51]通過制備液相法成功制備分離出了鹽酸頭孢他美酯原料藥中含量較大、分離度相對較高的3個雜質(zhì)，并采用NMR法確證了其化學結(jié)構(gòu)，其中包括兩個合成副產(chǎn)物和一個高分子二聚體雜質(zhì)。但由于聚合物雜質(zhì)的不穩(wěn)定及結(jié)構(gòu)復雜性，目前幾乎尚未系統(tǒng)性地對其進行結(jié)構(gòu)確證。然而，聚合物雜質(zhì)對照品的獲得和結(jié)構(gòu)確證對提高頭孢菌素類抗生素聚合物雜質(zhì)控制至關重要，因此也是接下來的聚合物雜質(zhì)研究工作中亟須解決的問題之一。

3.3 二維高效液相色譜法(2D-HPLC)

2D-HPLC法能將兩根互相獨立的色譜柱進行串聯(lián)，使得樣品組分可以在兩個不同的分離系統(tǒng)下進行分離。運用2D-HPLC技術，可實現(xiàn)SEC法與RPHPLC法在線分析的無縫銜接[52]，也為聚合物雜質(zhì)結(jié)構(gòu)研究中因聚合物雜質(zhì)峰定位困難而帶來的繁重工作量提供了解決方案。譚洪泉等[53]建立高效凝膠色譜法(HPGPC)法并聯(lián)合RP-HPLC法，利用兩個色譜系統(tǒng)的互補性對樣品在高效凝膠色譜系統(tǒng)中的未知來源雜質(zhì)(包括聚合物雜質(zhì))進行了歸屬，解決了聚合物雜質(zhì)在RP-HPLC中保留時間較長，可能出現(xiàn)漏檢等問題。秦峰等[54]運用在線二維凝膠色譜反相液相色譜法分別對Sephadex G10和TSK高效凝膠系統(tǒng)中主峰前的洗脫餾分進行了切換分析，成功將凝膠色譜法與指針性雜質(zhì)的定位結(jié)合起來，并聯(lián)用質(zhì)譜技術對致敏性聚合物雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)進行了初步推斷。阮昊等[55]采用二維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術對注射用阿洛西林鈉的聚合物雜質(zhì)進行定位分析和結(jié)構(gòu)鑒定，在反相高效液相色譜上定位出了4種聚合物雜質(zhì)，并分別推導出其可能的化學結(jié)構(gòu)。

3.4 LC/MS-柱切換技術

在分離分析頭孢菌素這類抗生素時，配制流動相通常需要用到磷酸鹽等非揮發(fā)性鹽類成分。由于非揮發(fā)性緩沖鹽進入質(zhì)譜檢測器后會導致靈敏度降低，分離效果變差，污染質(zhì)譜系統(tǒng)[56]。因此，在利用質(zhì)譜技術對目標聚合物雜質(zhì)進行結(jié)構(gòu)鑒定時不適合直接利用LC-MS法進樣分析，操作煩瑣。采用柱切換LC-MS聯(lián)用技術，可實現(xiàn)在切換色譜系統(tǒng)前對流動相進行在線脫鹽，避免在不同色譜系統(tǒng)中因更換流動相而導致目標雜質(zhì)保留時間發(fā)生變化而無法準確定位，既節(jié)省了時間也能夠保證雜質(zhì)定性的準確性。由于《中國藥典》2015年版中注射用頭孢美唑鈉有關物質(zhì)檢測方法的色譜系統(tǒng)中含有不揮發(fā)性的離子對試劑四丁基氫氧化銨，無法直接采用LC-MS法進樣分析，李進等[57]通過柱切換-LC/MSn技術對該制劑中的目標雜質(zhì)進行了富集、脫鹽預處理及質(zhì)譜分析，更為快速、簡便地推定了其主要雜質(zhì)峰結(jié)構(gòu)。胡衛(wèi)國等[58]采用改良親水凝膠色譜柱(Cef-SEC)分析了頭孢硫脲中的聚合物雜質(zhì)，并運用在線脫鹽-高效液相色譜-離子阱-飛行時間質(zhì)譜技術(2D-LC-IT-TOF/MS)對聚合物雜質(zhì)進行了鑒定。柱切換系統(tǒng)中1D色譜條件和2D色譜條件通過一組共用的餾分收集環(huán)進行連接，通過控制程序進行時間切換來捕集目標化合物，可在不改變流動相條件的基礎上實現(xiàn)了雜質(zhì)的切換分離。在鑒定雜質(zhì)結(jié)構(gòu)的同時，又實現(xiàn)了對1D-HPLC色譜圖中聚合物雜質(zhì)的定位。此外，近年來，隨著聚合物雜質(zhì)控制的迫切需要，李進等還通過柱切換-LC/MSn技術分別對阿莫西林克拉維酸鉀[59]、哌拉西林他唑巴坦鈉[46]、頭孢拉定[25]、頭孢噻肟鈉[40]、頭孢他啶[41]、頭孢地尼[60]、頭孢克肟[61]和頭孢鹽酸甲肟[62]等多種β-內(nèi)酰胺類抗生素原料及制劑中的聚合物雜質(zhì)進行了研究，極大地推動了聚合物雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究，為聚合物雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)確證奠定了堅實的基礎。

4 計算化學在探尋聚合規(guī)律中的應用

聚合物雜質(zhì)存在多種聚合方式和位點，之前的研究中，研究者認為β-內(nèi)酰胺類抗生素主要存在兩種聚合方式，分別為發(fā)生在母核的N型聚合反應和發(fā)生在側(cè)鏈的L型聚合反應。但兩種聚合方式的得出僅是根據(jù)多年實驗經(jīng)驗、質(zhì)譜等手段初步推斷，并未得到系統(tǒng)確證。因此，研究并確證不同種類β-內(nèi)酰胺類抗生素中聚合物雜質(zhì)的聚合方式仍是質(zhì)控路上的關鍵及難點之一。只有在明確聚合物雜質(zhì)的聚合位點規(guī)律之后，才能真正做到對不同聚合程度的雜質(zhì)進行精準指針性控制。

日前，隨著計算化學的飛速發(fā)展，使得從理論體系的角度對復雜化合物的反應趨勢進行一定水平上的指導及預測成為了可能。伍啟章[63]首次利用計算化學，通過量子化學軟件模擬了幾種代表性青霉素類抗生素的不同聚合位點的化學反應途徑，比較了它們反應前后的能量變化和反應限速階段的活化能，推測聚合反應發(fā)生的難易程度，從理論上解釋優(yōu)勢聚合產(chǎn)物的存在。然后分別選取部分廠家的原料藥和注射粉針劑進行檢測，在柱切換體系下，采用液質(zhì)聯(lián)用方法分析并驗證了各種二聚體聚合位點的傾向性。研究表明，青霉素類抗生素根據(jù)6位側(cè)鏈上有無自由氨基，共有4種可能的結(jié)合位點，分別為β-內(nèi)酰胺環(huán)之間的聚合，β-內(nèi)酰胺環(huán)開環(huán)與2位羧基側(cè)鏈的結(jié)合(N型聚合反應)；β-內(nèi)酰胺環(huán)與6位側(cè)鏈活潑氨基的聚合，6位側(cè)鏈活潑氨基與2位羧基側(cè)鏈的結(jié)合(L型聚合反應)。以上4種反應途徑理論上均可以發(fā)生，但因反應的活化能不同，反應難易程度不盡相同，最終形成或檢出的優(yōu)勢聚合產(chǎn)物也可能只有一種。

頭孢菌素類抗生素β-內(nèi)酰胺六元環(huán)3位多有側(cè)鏈存在，聚合物雜質(zhì)的結(jié)合位點規(guī)律研究較青霉素類抗生素更為復雜。在對該類抗生素進行聚合位點分析時，可按照頭孢菌素類抗生素3位有無側(cè)鏈及氨基側(cè)鏈，7位側(cè)鏈有無氨基結(jié)構(gòu)或氨噻肟結(jié)構(gòu)將頭孢菌素類抗生素分為6大類[64]。因其7位側(cè)鏈可能存在氨噻肟中活潑氨基基團或游離氨基基團、3位可能具有氨基側(cè)鏈等聚合反應進攻位點，因此可能的聚合位點也更為多樣。對該類抗生素聚合反應的機制進行深度探索的思路仍是需要通過計算化學軟件從化學反應原理上進行理論推斷后通過柱切換-LC/MSn、NMR等技術手段進行結(jié)構(gòu)確證，最終確定聚合規(guī)律。

5 思考及展望

β-內(nèi)酰胺類抗生素聚合物雜質(zhì)穩(wěn)定性極差，出峰情況復雜，兼具多種手性異構(gòu)體和開環(huán)類副產(chǎn)物，因此，其雜質(zhì)對照品的結(jié)構(gòu)確定和制備仍是目前的一大挑戰(zhàn)。針對此問題，首先要對聚合反應的機制進行深度探索，通過量子化學軟件從原理上總結(jié)并分析各類β-內(nèi)酰胺類抗生素聚合物雜質(zhì)的聚合位點和取代機理，找尋聚合物雜質(zhì)的聚合規(guī)律。通過質(zhì)譜技術獲知雜質(zhì)可能的結(jié)構(gòu)及雜質(zhì)來源后采用反合成技術和富集雜質(zhì)后采用制備液相技術是目前常見的雜質(zhì)制備方法。但考慮到合成成本、制備效率等問題，著眼于強降解樣品溶液對聚合物雜質(zhì)進行富集，通過制備型液相色譜分離純化目標雜質(zhì)，并采用核磁共振技術確證結(jié)構(gòu)的方式[65]，將具有更大的現(xiàn)實意義。

實踐證明，RP-HPLC法應是β-內(nèi)酰胺類抗生素聚合物雜質(zhì)質(zhì)控中更為理想的分析方法。2D-HPLC及柱切換LC-MS技術已經(jīng)解決了目前所存在的聚合物雜質(zhì)定位困難的問題，但液相方法的開發(fā)與優(yōu)化仍是需要進一步探究的重點，以QbD理念中的DOE手段為突破口，利用統(tǒng)計學原理篩選最優(yōu)化方法將是今后復雜化合物分析方法建立的一大趨勢。其次，只有在了解最有利于聚合物雜質(zhì)產(chǎn)生的具體條件，如確切的放置時間、溫度范圍、溶劑pH等后，才能更加明確頭孢菌素類等β-內(nèi)酰胺類抗生素的最佳生產(chǎn)環(huán)境、貯存條件和使用途徑，解決聚合物雜質(zhì)制備過程中雜質(zhì)不穩(wěn)定、濃度過低等難題，因此，也是亟須解決的一大問題。

最后，大量文獻表明，歸屬于青霉素類抗生素的氨芐西林、阿莫西林，因其6位側(cè)鏈上存在自由氨基，更易成為進攻位點與另一分子β-內(nèi)酰胺環(huán)發(fā)生聚合[59，66]。研究者[63]也通過計算化學軟件模擬后發(fā)現(xiàn)，氨芐西林的聚合反應過程從熱力學角度來說屬于放熱反應，相對于其他青霉素類抗生素而言可在相同降解條件下產(chǎn)生更多數(shù)量的聚合物雜質(zhì)，有利于聚合物雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)等研究。目前，國內(nèi)外藥典均已收載有關這類藥物的聚合物雜質(zhì)質(zhì)控標準。而對于頭孢菌素類抗生素，研究表明，其C7位的R1側(cè)鏈與青霉素的C6位側(cè)鏈結(jié)構(gòu)相同或相似是導致交叉過敏反應的關鍵原因[67]。同理，頭孢氨芐7位側(cè)鏈上也有游離氨基的存在，同時β-內(nèi)酰胺環(huán)3位無活性側(cè)鏈干擾，推測該品種與氨芐西林相似易發(fā)生聚合反應。但值得注意的是，頭孢氨芐聚合物雜質(zhì)的有關研究及其在實際藥物中是否威脅著公眾的用藥安全卻鮮有報道。因此，后續(xù)研究將以頭孢氨芐等7位含有游離氨基的頭孢菌素類抗生素為切入點，深入探討該類聚合物雜質(zhì)的確切結(jié)構(gòu)和聚合規(guī)律。在今后的聚合物雜質(zhì)結(jié)構(gòu)研究中，總結(jié)并歸納具有不同結(jié)構(gòu)特征的頭孢菌素類抗生素生成聚合物雜質(zhì)的難易程度，將有利于形成控制指定品種聚合物雜質(zhì)的策略，在保證公眾用藥安全的同時，提高聚合物雜質(zhì)控制的效率，節(jié)約質(zhì)控成本，將具有重大意義。同時，也可為將來的聚合物雜質(zhì)致敏性研究奠定基礎。