唐浩 張勝男 周麗娜 江芳 呂慧敏 張靜，2，*

(1 揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，泰州 225300；2 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，大連 116000)

藥品雜質(zhì)譜控制是當(dāng)前藥物研發(fā)中的熱點(diǎn)[1]。雜質(zhì)譜分析可以更好地反映產(chǎn)品中雜質(zhì)的來源，進(jìn)而針對(duì)性地提出控制策略，更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量[2-3]。β-內(nèi)酰胺類抗生素(如青霉素、頭孢菌素等)是臨床上最為常用的抗感染藥物，其生產(chǎn)工藝及自身結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)決定了產(chǎn)品中有機(jī)雜質(zhì)的種類復(fù)雜，其中不僅包括各種異構(gòu)體和降解物[4-7]，還可以發(fā)生聚合反應(yīng)形成各類聚合物雜質(zhì)[8-10]，使得雜質(zhì)譜分析更加困難。

頭孢哌酮鈉為第三代頭孢菌素類抗生素，主要用于由敏感菌引起的呼吸系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)感染等的治療。《中國(guó)藥典》2020年版采用高效液相色譜(RP-HPLC)法和凝膠色譜法分別對(duì)其有關(guān)物質(zhì)和聚合物雜質(zhì)進(jìn)行控制，JP17、USP43、EP10.0僅采用RP-HPLC法控制其有關(guān)物質(zhì)。鑒于凝膠色譜法對(duì)聚合物類雜質(zhì)的分離專屬性較差[9-10]，采用RP-HPLC法同時(shí)控制小分子雜質(zhì)和聚合物雜質(zhì)已經(jīng)成為β-內(nèi)酰胺類抗生素雜質(zhì)譜控制的發(fā)展方向[11]。

本文對(duì)中國(guó)藥典頭孢哌酮鈉有關(guān)物質(zhì)RP-HPLC方法進(jìn)行優(yōu)化，通過提高有機(jī)相比例，增強(qiáng)色譜洗脫能力，建立了一個(gè)可同時(shí)控制頭孢哌酮鈉中小分子雜質(zhì)和聚合物雜質(zhì)的新方法；并利用質(zhì)譜分析手段，對(duì)兩個(gè)新未知雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了推測(cè)。

1 儀器與試藥

1.1 藥品與試劑

頭孢哌酮對(duì)照品(批號(hào)130420-201105，含量為93.8%)、頭孢哌酮雜質(zhì)A(批號(hào)130428-201605，含量為98.1%)、頭孢哌酮雜質(zhì)F(批號(hào)130412-200902，含量為100.0%)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；頭孢哌酮雜質(zhì)B(批號(hào)PN5254-IMP-B-180719，含量為95.8%)、頭孢哌酮雜質(zhì)C(批號(hào)PN5254-IMP-C-170922，含量為99.8%)購(gòu)自藥渡公司；頭孢哌酮雜質(zhì)D(批號(hào)1530-014A4，含量為95.0%)購(gòu)自TLC公司；頭孢哌酮雜質(zhì)E(批號(hào)151203，含量為98.6%)購(gòu)自Molcan Corporation公司；頭孢哌酮鈉原料藥(批號(hào)8021HK81D、8022HK81D、8023HK81D )購(gòu)自齊魯安替制藥有限公司；頭孢哌酮鈉原料藥(批號(hào)11C0171810002、11C0171810005、11C0171810006)購(gòu)自山東羅欣藥業(yè)有限公司；色譜級(jí)乙腈購(gòu)自美國(guó)默克公司；分析純?nèi)野?、冰醋酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉購(gòu)自國(guó)藥化試有限公司；超純水由Millipore純水儀制備。

1.2 儀器

Agilengt 1260高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫有限公司)，Waters e2695高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)，XP205十萬分之一天平(美國(guó)梅特勒公司)，SCIEX QTRAP 4500三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀(美國(guó)AB Sciex公司)。

2 方法

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(推薦使用Agilent Eclipse XDB-C18，150 mm×4.6 mm，5 μm或效能相當(dāng)色譜柱)，流動(dòng)相A：三乙胺醋酸溶液(取三乙胺14 mL與冰醋酸5.7 mL，加水稀釋至100 mL，搖勻，取1.2 mL與880 mL水混勻，并用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至2.5)，流動(dòng)相B：乙腈，流速：1.0 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：30 μL，梯度洗脫程序和LC-MS色譜條件詳見表1～2。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution procedure

表2 LC-MS 色譜條件Tab.2 LC-MS chromatographic conditions

2.2 溶液的配制

2.2.1 供試品溶液

取頭孢哌酮鈉適量，精密稱定，加少量磷酸鹽緩沖液(稱取磷酸二氫鉀1.0 g和磷酸氫二鈉1.8 g，加水1000 mL使溶解，即得)溶解，再用稀釋劑[流動(dòng)相A-乙腈(91:9)]定量稀釋制成約含2 mg/mL的溶液，即得。

2.2.2 對(duì)照溶液

精密量取“2.2.1”項(xiàng)供試品溶液1 mL，置200 mL量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 混合雜質(zhì)對(duì)照品溶液

精密稱取頭孢哌酮雜質(zhì)A對(duì)照品和頭孢哌酮雜質(zhì)C對(duì)照品各適量，加少量乙腈溶解，超聲3 min，再用稀釋劑定量稀釋制成每1 mL含頭孢哌酮雜質(zhì)A和頭孢哌酮雜質(zhì)C分別約為30 μg和10 μg的溶液，即得。

2.2.4 系統(tǒng)適用性溶液

分別取頭孢哌酮對(duì)照品和頭孢哌酮各雜質(zhì)對(duì)照品適量，用稀釋劑溶解并稀釋制成每1 mL含頭孢哌酮雜質(zhì)E、頭孢哌酮雜質(zhì)D、頭孢哌酮雜質(zhì)C、頭孢哌酮雜質(zhì)A、頭孢哌酮、頭孢哌酮雜質(zhì)F、頭孢哌酮雜質(zhì)B分別約為10μg、10 μg、10 μg、30 μg、2 mg、10 μg和10 μg的溶液，即得。

2.3 方法驗(yàn)證

參考中國(guó)藥典通則《9101分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》對(duì)新建立的分析方法進(jìn)行驗(yàn)證。

2.3.1 系統(tǒng)適用性與專屬性

取空白溶液(稀釋劑)、供試品溶液、系統(tǒng)適用性溶液，分別注入色譜儀，空白溶液應(yīng)不干擾測(cè)定，系統(tǒng)適用性溶液各色譜峰與相鄰色譜峰分離度均大于1.5。

利用強(qiáng)制降解試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證方法的專屬性。取頭孢哌酮鈉約100 mg，共6份，分別進(jìn)行不破壞、固體光照(4500±500 Lx，7 d)、固體高溫(60℃，7 d)、氧化(0.3%雙氧水5 mL，室溫放置4 h)、酸(0.01 mol/L HCl，室溫放置25 h)、堿(0.01 mol/L NaOH，室溫放置10 min)破壞處理后，用稀釋劑溶解并稀釋制成2 mg/mL的溶液；分別精密量取30 μL注入色譜儀，采用二極管陣列檢測(cè)器( DaD)進(jìn)行紫外掃描，掃描范圍為200～400 nm波長(zhǎng)。

2.3.2 線性范圍

分別精密稱取頭孢哌酮、雜質(zhì)A、B、C、D、E和F各適量，配制成LOQ、限度濃度40%、80%、100%、120%、200%和400%的系列混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，分別記錄頭孢哌酮及各雜質(zhì)的色譜峰面積。將峰面積(A)與各自的質(zhì)量濃度(C)作線性回歸，計(jì)算頭孢哌酮以及各雜質(zhì)的線性方程。

2.3.3 檢測(cè)限(LOD)與定量限(LOQ)

精密稱取頭孢哌酮對(duì)照品和雜質(zhì)A、B、C、D、E、F對(duì)照品各適量，逐步進(jìn)行稀釋，進(jìn)樣，信噪比的10倍值作為各雜質(zhì)的定量限，信噪比的3倍值作為各雜質(zhì)的檢測(cè)限。

2.3.4 儀器精密度

精密吸取30 μL混合雜質(zhì)對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5針，用各雜質(zhì)峰面積的RSD表征儀器的精密度。

2.3.5 重復(fù)性

取頭孢哌酮鈉適量，按“2.2.1”和“2.2.2”項(xiàng)方法平行制備6 份供試品溶液和對(duì)照溶液，分別進(jìn)樣30 μL測(cè)定，按加校正因子的主成分自身對(duì)照法測(cè)定各樣品中雜質(zhì)含量的RSD。

2.3.6 中間精密度

由不同的分析人員，使用不同的儀器和不同的色譜柱在不同的日期進(jìn)行試驗(yàn)。按“重復(fù)性”項(xiàng)下方法對(duì)相同批次頭孢哌酮鈉進(jìn)行分析，計(jì)算6份供試品中各雜質(zhì)含量的RSD。

2.3.7 準(zhǔn)確度

精密稱取已知雜質(zhì)含量的供試品約22 mg，分別置于9個(gè)10 mL量瓶中，分別加入雜質(zhì)A、B、C、D、E和F適量，制成含各雜質(zhì)約為限度濃度40%、100%和200%的溶液，測(cè)定其含量，計(jì)算回收率。

2.4 校正因子測(cè)定

按“2.3.2”項(xiàng)方法，分別采用2臺(tái)儀器系統(tǒng)由不同的分析人員在不同的時(shí)間做2組線性，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算各已知雜質(zhì)的相對(duì)校正因子[12]。

3 結(jié)果與討論

3.1 方法建立

頭孢哌酮鈉RP-HPLC有關(guān)物質(zhì)分析方法在ChP2020、EP10.0、BP2020和JP17中均有收載，各方法均采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱；以三乙胺醋酸液-乙腈為流動(dòng)相，等度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；僅在供試品濃度、柱溫等存在差異。該色譜系統(tǒng)對(duì)頭孢哌酮鈉中的已知雜質(zhì)(雜質(zhì)A、B、C、D、E和F)可以進(jìn)行有效的控制，但不能檢測(cè)聚合物類雜質(zhì)。鑒于聚合物類雜質(zhì)在RP-HPLC色譜系統(tǒng)中通常具有更長(zhǎng)的保留值[9-10]，以ChP2020為基礎(chǔ)，采用梯度洗脫，利用已知雜質(zhì)進(jìn)行色譜峰的定位；逐步提高流動(dòng)相中有機(jī)相的比例增強(qiáng)洗脫能力，保證強(qiáng)保留雜質(zhì)被洗脫；對(duì)頭孢哌酮鈉有關(guān)物質(zhì)RP-HPLC分析方法進(jìn)行了優(yōu)化。新建立的分析方法不僅可以檢出各國(guó)藥典中所有收載的已知雜質(zhì)(雜質(zhì)A、B、C、D、E和F)，且在雜質(zhì)B后相對(duì)頭孢哌酮峰保留時(shí)間為1.5～2.5處發(fā)現(xiàn)兩個(gè)新的未知雜質(zhì)(圖1)。

圖1 新優(yōu)化的頭孢哌酮鈉有關(guān)物質(zhì)RP-HPLC分析方法色譜圖Fig.1 Chromatograms of related substances of cefoperazone sodium by the optimal RP-HPLC

3.2 對(duì)新未知雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)推測(cè)

采用LC-MS方法對(duì)新發(fā)現(xiàn)的未知雜質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析。在未知雜質(zhì)1色譜峰的+ESI圖中存在m/z679.51130、m/z717.46758的準(zhǔn)分子離子峰(圖2a)，推測(cè)分別為[M+H]+和[M+K]+峰，提示該雜質(zhì)的分子量為678 Da；其可能結(jié)構(gòu)見圖2b(結(jié)構(gòu)推測(cè)過程略)。

圖2 未知雜質(zhì)1的+ESI圖(a)和可能結(jié)構(gòu)(b)Fig.2 +ESI diagram(a)and possible structure(b)of unknown impurity 1

未知雜質(zhì)2 色譜峰的+E S I 圖中存在m/z792.15286、m/z830.16803的準(zhǔn)分子離子峰(圖3a)，推測(cè)分別為[M+H]+和[M+K]+峰，聚合物1雜質(zhì)的(a)+ESI質(zhì)譜圖和(b)可能結(jié)構(gòu)提示該雜質(zhì)的分子量為791 Da；其可能結(jié)構(gòu)見圖3b(結(jié)構(gòu)推測(cè)過程略)。根據(jù)頭孢菌素已知的聚合反應(yīng)機(jī)理，母核羧基可以作為活性基團(tuán)與另一分子的3位側(cè)鏈發(fā)生聚合反應(yīng)[13]，該雜質(zhì)可能為合成過程中頭孢哌酮氧化物與7-ACA的3位側(cè)鏈反應(yīng)產(chǎn)物。

圖3 未知雜質(zhì)2的+ESI圖(a)和可能結(jié)構(gòu)(b)Fig.3 +ESI diagram(a)and possible structure(b)of unknown impurity 2

冀峰等[8，13]采用在線體積排阻色譜-反相液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法對(duì)注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉中頭孢哌酮聚合物雜質(zhì)進(jìn)行了分析，推測(cè)出了2對(duì)閉環(huán)二聚物的可能結(jié)構(gòu)(分子量分別為1174和1290 Da)，并發(fā)現(xiàn)一個(gè)分子量為760 Da的雜質(zhì)。但實(shí)際樣品中未能檢測(cè)到文獻(xiàn)報(bào)道的頭孢哌酮二聚體，提示頭孢哌酮鈉本身不易發(fā)生聚合反應(yīng)，或形成的二聚體穩(wěn)定性較差。鑒于未知雜質(zhì)2在實(shí)際樣品中存在，且在各種加速實(shí)驗(yàn)中不增加(表3)，提示其可以作為合成過程中頭孢哌酮的指針性聚合物雜質(zhì)。

3.3 方法驗(yàn)證

專屬性：在酸、堿、氧化及高溫強(qiáng)制降解條件下，頭孢哌酮鈉均有不同程度的降解(表3)，對(duì)各降解樣品進(jìn)行分析，主峰與雜質(zhì)峰的分離度均大于1.5(圖略)，主峰純度角均小于純度閾值，質(zhì)量平衡均在90%～110%之間(表4)。

表3 降解雜質(zhì)匯總表Tab.3 Summary of impurities of stress conditions test

表4 強(qiáng)制降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果匯總表Tab.4 Summary of experimental results of stress conditions test

線性：頭孢哌酮以及各雜質(zhì)在各自的測(cè)定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(表5)。頭孢哌酮、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E和雜質(zhì)F的檢測(cè)限(S/N=3)分別為9.06、1.86、8.11、0.62、0.52、0.54和10.05 ng；定量限(S/N)分別為18.12、18.60、16.22、2.05、1.75、18.16和20.10 ng，連續(xù)進(jìn)樣6針峰面積的RSD分別為1.5%、0.4%、2.1%、5.8%、0.8%、2.5%和4.3%。

表5 頭孢哌酮及各雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍Tab.5 Stan Dard curve and linearity range of cefoperazone sodium and the impurity

儀器精密度：混合雜質(zhì)對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5針，頭孢哌酮雜質(zhì)A峰面積RSD為0.5%，保留時(shí)間RSD為0.2%；頭孢哌酮雜質(zhì)C峰面積RSD為0.2%，保留時(shí)間RSD為0.1%。重復(fù)性：分別測(cè)定6份供試品，雜質(zhì)A的含量均為0.26%，雜質(zhì)B的含量均為0.12%，雜質(zhì)C的含量均為0.15%，最大未知單雜含量均值為0.11%(極差為0.03%)，新未知雜質(zhì)1含量均為0.11%，新未知雜質(zhì)2含量均值為0.07%(極差為0.02%)，其他總雜含量均值為0.25%(極差為0.05%)。中間精密度：分別測(cè)定6 份供試品，雜質(zhì)A的含量均值為0.28%(極差為0.01%)，雜質(zhì)B的含量均值為0.12%(極差為0.01%)，雜質(zhì)C的含量均為0.15%，最大未知單雜含量均值為0.12%(極差為0.01%)，新未知雜質(zhì)1含量均為0.10%，新未知雜質(zhì)2含量均值為0.05%，其他總雜含量為0.28%(極差為0.05%)。

供試品溶液放置12 h，各已知雜質(zhì)及未知雜質(zhì)均無明顯變化；對(duì)照溶液中12 h內(nèi)頭孢哌酮峰面積的變化RSD為0.12%，即供試品溶液及對(duì)照溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法評(píng)價(jià)各雜質(zhì)測(cè)定的準(zhǔn)確度(表6)。各濃度水平雜質(zhì)的回收率均在90%～108%之間，回收率RSD均小于10.0%。

表6 頭孢哌酮及各雜質(zhì)回收率結(jié)果(%)Tab.6 Recovery of cefoperazone sodium and the impurity(%)

調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH2.5±0.1、柱溫為30℃±2℃、流速為(1.0±0.1)mL/min，評(píng)價(jià)方法的耐用性。在上述條件下各雜質(zhì)峰之間、各雜質(zhì)峰與主峰之間的分離度均良好，主峰及各雜質(zhì)的保留時(shí)間有變化，但各雜質(zhì)相對(duì)于主峰的相對(duì)保留時(shí)間無明顯變化，理論塔板數(shù)及拖尾因子均符合要求。

綜上所述，新建立的頭孢哌酮鈉有關(guān)物質(zhì)分析方法，具有良好的專屬性、重現(xiàn)性、準(zhǔn)確性和耐用性，可以滿足有關(guān)物質(zhì)質(zhì)控的需要。

3.4 校正因子

對(duì)頭孢哌酮鈉已知雜質(zhì)校正因子的測(cè)定結(jié)果見表5。當(dāng)校正因子不在0.9～1.1范圍內(nèi)時(shí)，采用雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法定量是理想的方法，采用加校正因子的主成分自身對(duì)照法定量，較主成分自身對(duì)照法定量可得到更準(zhǔn)確的定量結(jié)果。中國(guó)藥典2020年版對(duì)頭孢哌酮雜質(zhì)A(校正因子為0.86)和雜質(zhì)C(校正因子為0.40)采用外標(biāo)法定量，但對(duì)頭孢哌酮雜質(zhì)B、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F(校正因子分別為0.86、1.14、0.77和1.19)采用主成分自身對(duì)照法定量，建議引入校正因子提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

3.5 樣品測(cè)定

按新建立的方法，測(cè)定齊魯安替制藥有限公司的頭孢哌酮鈉(批號(hào)：8021HK81D、8022HK81D、8023HK81D )和山東羅欣藥業(yè)有限公司的頭孢哌酮鈉(批號(hào)：11C0171810002、11C0171810005、11C0171810006)樣品中的有關(guān)物質(zhì)(表7)，結(jié)果可見，國(guó)產(chǎn)樣品中普遍存在雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、新未知雜質(zhì)1和新未知雜質(zhì)2，也進(jìn)一步提示利用未知雜質(zhì)2雜質(zhì)作為合成工藝中的指針性聚合物雜質(zhì)控制頭孢哌酮工藝是可行的。

表7 不同廠家頭孢哌酮鈉雜質(zhì)檢測(cè)結(jié)果Tab.7 The test results of cefoperazone sodium from different manufacturers

4 結(jié)論

本文通過對(duì)中國(guó)藥典頭孢哌酮鈉RP-HPLC法的優(yōu)化，建立了新的頭孢哌酮鈉有關(guān)物質(zhì)分析方法。對(duì)方法的系統(tǒng)驗(yàn)證結(jié)果提示，該方法可以檢出目前已知的全部頭孢哌酮鈉小分子雜質(zhì)及指針性聚合物雜質(zhì)，利用測(cè)定的校正因子可以準(zhǔn)確定量已知雜質(zhì)，可以方便地用于大批量樣品的質(zhì)量分析。