王 全,王子澳,周 柯,陳 攀*

(1.湖北科技學院醫(yī)學部基礎(chǔ)醫(yī)學院，湖北 咸寧 437100；2.桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院)

頭頸腫瘤是目前患者數(shù)較多的腫瘤之一，其中喉癌(LSCC)是頭頸腫瘤中發(fā)病率較高的惡性腫瘤，也是呼吸道腫瘤中發(fā)病率較高的惡性腫瘤[1]，它的病理類型主要以鱗狀細胞癌為主。隨著目前工業(yè)的迅速發(fā)展，人們生活環(huán)境的污染越來越嚴重，喉癌每年以25%的比例呈逐年增長[2]?；疾∫蛩刂饕俏鼰?，其次是空氣污染，其他的流行因素還包括職業(yè)因素、體內(nèi)激素水平失調(diào)、病毒感染等。喉癌目前的治療方法是手術(shù)為主，放化療聯(lián)合輔助治療為輔。保守治療對于早期患者的3年無病生存率到達80%以上，5年生存率可以達到60%[3]。但是對于復發(fā)或者局部轉(zhuǎn)移的患者，中晚期喉癌的患者5年的存活率大約為25%～70%，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者死亡率約占無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的2.8倍[4]。因此，要想深入了解喉癌的病理特征與治療，找尋新的腫瘤標志物成為解決問題的關(guān)鍵。

研究表明TRPC家族參與許多腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，TRPC家族的分支中TRPC3促進了卵巢癌的形成，TRPC6參與了肝癌、前列腺癌等癌癥的發(fā)生[5]。本項實驗課題運用免疫組織化學法研究TRPC1在喉癌組織中的表達并進一步探討該因子在喉癌的臨床診斷及治療中的潛在價值。

1 材料與方法

1.1 研究材料

收集桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院2008年1月至2014年1月經(jīng)耳鼻咽喉-頭頸腫瘤外科及病理科診斷的喉癌患者石蠟組織標本78例，其中男70例，女8例；年齡37～81歲，平均(62.41±0.13)歲；通過國際抗癌協(xié)會(UICC)2002年(第6版)公布的TNM分類分期修改方案：其中Ⅰ期10例，Ⅱ期28例，Ⅲ期17例，Ⅳ期23例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移53例。分別取上述喉癌患者的喉癌組織和癌旁組織，再取23例正常成人喉部組織的石蠟標本作為對照組。對所有喉癌患者隨訪1～3年，確定死亡病例為19例，失訪病例18例，復發(fā)病例19例。

1.2 免疫組織化學法

石蠟切片經(jīng)過脫蠟、脫苯、EDTA抗原修復液高溫高壓抗原修復。3%雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，3%BSA進行血清封閉后滴加TRPC1抗體(1∶100)，室溫孵育60min，PBS漂洗3次，每次5min，滴加與 Ⅰ 抗相應種屬的 Ⅱ 抗(1∶1 000)，室溫孵育15min，PBS漂洗3次，每次5min。DAB顯色、水洗，蘇木素復染，中性樹膠脫水封片。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，描述性技術(shù)資料通過卡方檢驗，相關(guān)性分析通過配方設(shè)計卡方檢驗和Kappa一致性檢驗，生存時間分析采用Kaplan-Meier法及COX回歸分析法，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化結(jié)果

TRPC1蛋白表多數(shù)達于細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，也可表達于胞質(zhì)、包膜、胞內(nèi)囊泡等部位，組織切片中，細胞為淡黃色至棕褐色者為陽性細胞。見圖1。

喉癌組織×200 喉癌組織×400

正常組織×200 正常組織×400

癌旁組織×200 癌旁組織×400

2.2 TRPC1在喉癌組織、癌旁組織、正常組織中的表達

經(jīng)檢測，TRPC1在喉癌組織的陽性表達率為71.8%(56/78)，在癌旁組織中的陽性表達率為21.8%(17/78)，在正常組織中的陽性率為8.7%(2/23)，TRPC1在喉癌組織的表達要高于癌旁組織和正常組織，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.3 TRPC1在喉癌組織中的表達和臨床病理特征相關(guān)性

TRPC1在喉癌組織中的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復發(fā)等特征有相關(guān)性(P<0.01)；與年齡、性別、臨床分期等無相關(guān)性。見表1。

表1 TRPC1在喉癌組織中的表達和臨床病理特征相關(guān)性

2.4 生存時間分析

TRPC表達陽性及陰性組的患者生存情況Kaplan-Meier方法計算。TRPC陽性組及陰性組生存均值分別為(48.309±2.457)月和(56.818±2.145)月；陽性95% CI：43.494～53.125，陰性95% CI：52.614～61.023；log rank檢驗P=0.041。TRPC陽性和陰性對患者生存時間差異有意義。見圖2。

圖2 TRPC1表達陽性和陰性的生存分析(刪除失訪的患者)

2.5 Cox回歸分析

使用Cox回歸分析，從是否復發(fā)、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移2個因素來分析影響生存率的因素。結(jié)果顯示，復發(fā)情況95% CI相對危險度為69.781，P<0.001；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的95%CI相對危險度為5.889，P=0.008；說明是否復發(fā)和是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況差異均具有統(tǒng)計學意義。見表2。

表2 Cox回歸分析喉癌組織預后相關(guān)因素

3 討 論

喉癌作為國內(nèi)最常見的頭頸部惡性腫瘤，它的發(fā)病呈線性增高趨勢，目前國內(nèi)的治療手段是手術(shù)為主，綜合治療為輔[6]，對于早期聲門型喉癌，放化療及探索中的生物治療能夠有效的保全患喉功能，已成為患者的首選[7]。但對于中晚期的患者，保守治療難以達到預期效果，許多患者難以耐受藥物的副作用且復發(fā)率較高。因此，很多中晚期的喉癌患者會選擇部分喉切除術(shù)甚至全喉切除術(shù)，患者術(shù)后會出現(xiàn)長久性的聲音嘶啞甚至喪失聲音、吞咽功能紊亂、呼吸道感染等術(shù)后并發(fā)癥[8-9]。因此，尋找合理治療癌癥的生物因子及確定治療方案后需檢測的重要指標是目前醫(yī)學急需解決的關(guān)鍵問題。

TRPC1作為TRP的哺乳類同源物，在人類中，它定位于三號染色體上，該蛋白由六個跨膜段組成，N-末端和C-末端都位于細胞質(zhì)內(nèi)，連接跨膜段5和6的胞外環(huán)參與了離子孔區(qū)域的形成在細胞內(nèi)[10]，TRPC1存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞膜、胞內(nèi)囊泡和纖毛中，可以把它看做一種類似于天線的感覺器官。作為信號傳導的一個平臺,在許多組織中，它都表現(xiàn)了密不可分的作用[11]。TRPC1通過與多種蛋白相互結(jié)合與作用，借助ROCE及SOCE介導其對Ca2+通道的影響，從而調(diào)整細胞中Ca2+的平均水平。目前研究最多的就是借助SOCE(鈣庫操縱性鈣內(nèi)流)通道，有研究[12]表明SOCE發(fā)生在細胞內(nèi)的等離子體膜域內(nèi)，SOCE通道在分子組件間產(chǎn)生的激活和失活的等離子膜促進了直接的物理或功能的耦合，SOCE被激活后刺激與細胞內(nèi)Ca2+的動員相關(guān)的等離子體膜受體。雖然有以上資料表明，激活SOCE的信號是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中產(chǎn)生，但目前還不知道SOCE激活或失活的機制。在以往的研究中顯示，Ca2+信號涉及的關(guān)鍵分子與窩泡的脂質(zhì)皮具有關(guān)，從而暗示了Ca2+信號中的小凹的重要性，同時TRPC1與TRPC3和支架蛋白Cav1相關(guān)，并在一個含有關(guān)鍵Ca2+信號蛋白的復合物中進行組裝，所以有學者提出SOCE通道的調(diào)控是通過TRPC1相關(guān)復合物或在復合物中補充相關(guān)蛋白質(zhì)來完成[13]。目前有文獻[14]表明，TRPC1中有兩個Cav1結(jié)合位點，重要的是，在全長或C端截斷的TRPC1中刪除N-末端的Cav1結(jié)合域，就阻止了蛋白質(zhì)的質(zhì)膜定位，對SOCE產(chǎn)生了顯性的負面影響，顯著降低了Ca2+的流入，然而相反的是，如果刪除的是C端自身，包括C-末端的Cav1結(jié)構(gòu)域，并不會改變TRPC1的結(jié)構(gòu)域。因此，TRPC1等離子體膜的定位依賴于N端的相互作用?？偟膩碚f，TRPC1與Cav1的相互作用在TRPC1的轉(zhuǎn)運過程中扮演了關(guān)鍵的角色，它被組裝成與其他關(guān)鍵Ca2+信號蛋白結(jié)合的信號復合物，除了作為信號復合物組裝的平臺外，Cav1蛋白還作為一種負調(diào)控因子參與小泡的轉(zhuǎn)運，所以Cav1的作用是巨大的[15]。

綜上所述，盡管SOCE在十多年前首次被描述，但其調(diào)控機制尚不清楚，根據(jù)相關(guān)研究，我們只能知道SOCE與一種關(guān)鍵的Ca2+信號蛋白的血漿膜信號復合物有關(guān)[16]。與此相一致的是，TRPC1、TRPC3和TRPC4等一些TRPC通道已被報告與這個信號通路的一個或多個成員有關(guān)，之前描述TRPC1的等離子體膜定位依賴于一個N-末端Cav1結(jié)合位點[17]，當?shù)入x子體膜發(fā)生局部化時，就抑制了TRPC1的產(chǎn)生，繼而抑制SOCE通道的生成。所以Cav1有助于在血漿膜窩脂質(zhì)筏域中形成含有TRPC1的SOCE通道。接下來需要進一步研究確定如何刺激Ca2+信號級聯(lián)結(jié)果激活這些SOCE通道。

SOCE的激活通常用來響應PIP2水解、IP3生成和IP3介導的Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中釋放的等離子體膜受體的刺激，它的主要觸發(fā)器就是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+的流失，因為Ca2+對許多與腫瘤組織的進展起重要作用的功能細胞有重大影響，如細胞的增殖、分化與血管的形成[18-19]。因此，TRPC1作為可調(diào)控Ca2+功能的非選擇性陽離子通道。有研究表明，人腎癌A498細胞在TRPC1下調(diào)后，PI3K和AKT的表達水平均較之前降低；在肝癌細胞中，也有學者通過RNAsi技術(shù)有效的抑制基因和細胞的表達，從而發(fā)現(xiàn)TRPC1 siRNA轉(zhuǎn)染HCCLM3后，HCCLM3細胞在缺氧條件下的惡化能力較之前下降[20]。

在本次實驗研究中，TRPC1在喉癌組織中的陽性表達率達到71.8%，與癌旁組織21.8%及正常組織的陽性表達率8.7%相比較，說明TRPC1參與了喉癌的發(fā)生與發(fā)展。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和復發(fā)的喉癌組織中，TRPC1的陽性表達率分別為96.0%和94.7%，與非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉癌組織60.4%和未復發(fā)的喉癌組織64.4%相比，說明TRPC1與腫瘤組織的侵襲性與惡性程度呈正相關(guān)性，提示我們可能是因為當細胞內(nèi)的Ca2+被消耗過多時，激活了細胞質(zhì)內(nèi)的TRPC1通道，促使細胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+濃度大量增加，使得細胞異常增殖和非正常分化，從而導致腫瘤的擴散和惡化，但其中具體的作用機制還有待于進一步研究和討論。

通過本次實驗運用免疫組織化學法研究TRPC1在喉癌組織中的表達得出TRPC1的高陽性率表達與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和復發(fā)有密切的關(guān)系，我們可以通過抑制TRPC1通道，起到阻斷Ca2+向細胞內(nèi)流動的作用，在一定程度上阻止喉癌組織的進一步擴散與惡化。在未來的某一天，TRPC1不僅可以作為喉癌患者的診斷及復查依據(jù)，也可以為喉癌的治療提供了一個新的方向與思路。