王曉茵 宋翠平 孫曉亮 李木子 曹旭敏 秦立得 王淑婷 隋金鈺 王玉東 趙思俊

摘 要：建立改良的磺胺類藥物與熒光胺反應(yīng)的衍生化方法，并應(yīng)用于豬肉中11 種磺胺類藥物的高效液相色譜-熒光法測定。選用0.1 mol/L KH2PO4溶液（pH 3.0）0.8 mL、0.3 mg/mL熒光胺溶液0.2 mL與磺胺類藥物發(fā)生衍生化反應(yīng)，4 ℃避光反應(yīng)40 min，得到磺胺-熒光胺衍生產(chǎn)物。該衍生化方法穩(wěn)定、可靠，衍生化產(chǎn)物在4 ℃條件下12 h內(nèi)維持良好的穩(wěn)定性。豬肉樣品經(jīng)0.1 mol/L KH2PO4溶液提取，HLB固相萃取柱凈化，經(jīng)該方法衍生化后進行高效液相色譜測定。結(jié)果表明：11 種磺胺類藥物在1～200 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系（R2≥0.999 4）;方法的定量限為0.8～1.6 μg/kg;在2、50、100 μg/kg 3 個加標(biāo)水平下，11 種磺胺類藥物的加標(biāo)回收率為62.0%～108.0%，日內(nèi)、日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.0%～8.8%和1.8%～8.6%。

關(guān)鍵詞：磺胺;熒光胺;衍生化;豬肉;高效液相色譜-熒光法

Determination of 11 Sulfonamide Residues in Pork by Modified Fluorescamine Precolumn Derivatization-High Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detection

WANG Xiaoyin， SONG Cuiping， SUN Xiaoliang， LI Muzi， CAO Xumin， QIN Lide， WANG Shuting， SUI Jinyu， WANG Yudong， ZHAO Sijun*

（China Animal Health and Epidemiology Center， Qingdao 266032， China）

Abstract： An analytical method using high performance liquid chromatography （HPLC） with fluorescence detection after modified precolumn derivatization with fluorescamine was established for the determination of 11 sulfonamide residues in pork. The optimized reaction conditions were as follows： 0.8 mL of phosphate buffer （0.1 mol/L， pH 3.0） and 0.2 mL of fluorescamine solution （0.3 mg/mL） were mixed， vortexed， and kept in darkness at 4 ℃ for 40 min. The derivatization method was stable and reliable and the resulting product was stable for 12 h at 4 ℃. The sample was extracted with

0.1 mol/L phosphate buffer solution， purified by an HLB solid phase extraction column， and then derived by this method， before being analyzed by HPLC. The calibration curves for the 11 sulfonamides showed a good linear relationship in the concentration range between 1 and 200 μg/L with a correlation coefficient higher than 0.999 4. The limit of quantification for the analytes was 0.8–1.6 μg/kg. At spiked concentrations of 2， 50 and 100 μg/kg， the developed method showed excellent recoveries ranging from 62.0% to 108.0% with intra- and inter-relative standard deviations （RSDs） of 2.0% to 8.8% and 1.8% to 8.6%， respectively.

Keywords： sulfonamides; fluorescamine; derivatization; pork; high performance liquid chromatography-fluorescence detection

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210810-198

中圖分類號：TS251.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2022）02-0033-06

引文格式：

王曉茵， 宋翠平， 孫曉亮， 等. 改良柱前熒光胺衍生化-高效液相色譜法測定豬肉中11 種磺胺類藥物殘留[J]. 肉類研究， 2022， 36（2）： 33-38. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210810-198.? ? http：//www.rlyj.net.cn

WANG Xiaoyin， SONG Cuiping， SUN Xiaoliang， et al. Determination of 11 sulfonamide residues in pork by modified fluorescamine precolumn derivatization-high performance liquid chromatography with fluorescence detection[J]. Meat Research， 2022， 36（2）： 33-38. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210810-198.? ? http：//www.rlyj.net.cn

磺胺類藥物是一類以對氨基苯磺酰胺為基本母核結(jié)構(gòu)的合成抗菌藥物，具有廣譜抗菌性，而且價格低廉，作為預(yù)防、治療細(xì)菌感染性疾病的藥物被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖過程中[1-3]。然而，由于在畜禽養(yǎng)殖過程中存在不合理使用甚至濫用藥物的情況，極易導(dǎo)致其在畜禽產(chǎn)品中的殘留，對人類健康產(chǎn)生極大的威脅和危害[4-6]，為此，我國規(guī)定動物組織中磺胺類藥物總最大殘留限量為100 μg/kg[7]。

國內(nèi)外學(xué)者對磺胺類藥物殘留的檢測方法開展了廣泛研究，包括液相色譜技術(shù)[8-11]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[12-15]、免疫學(xué)分析法[16-18]和毛細(xì)管電泳法[19-20]等，其中，液相色譜和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)以其高分辨率和高靈敏度被普遍應(yīng)用。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)能夠同時分析多種物質(zhì)，方法的準(zhǔn)確性和靈敏度高，但儀器設(shè)備價格昂貴，且對操作人員要求較高。而采用高效液相色譜-紫外檢測器進行檢測時，由于大多數(shù)磺胺類藥物的最佳紫外吸收波長為270～280 nm，但是該波長范圍選擇性較低，而且動物組織中的蛋白（最大吸收波長為280 nm左右）及其他共萃取物極易對分析過程產(chǎn)生干擾，容易造成誤判現(xiàn)象。

磺胺類藥物分子中磺酰胺的對位氨基（伯胺）活潑性高，可與衍生試劑熒光胺進行反應(yīng)，生成具有熒光特性的磺胺衍生物[21]，而非伯胺類化合物不發(fā)生類似反應(yīng)。通常，在酸性條件下，熒光胺中的氧原子被質(zhì)子化后，帶有正電荷，向相鄰環(huán)的碳原子吸引電子，削弱了C-O鍵，內(nèi)酯環(huán)開環(huán)，使碳原子帶有部分正電荷，溶液中的水進攻碳正離子，然后失去氫離子，得到環(huán)氧化合物繼續(xù)質(zhì)子化、異構(gòu)化，得到中間體羰基化合物;然后磺胺中活潑的伯氨基與中間體化合物的羰基發(fā)生縮合反應(yīng)，成環(huán)，最終得到磺胺衍生物（圖1）。

熒光胺與磺胺類藥物發(fā)生衍生化反應(yīng)，產(chǎn)物具有很高的熒光強度，利用熒光檢測器測定，可有效降低其他組分的干擾，提高檢測的靈敏度和可靠性[22-24]。但由于該衍生化產(chǎn)物性質(zhì)不穩(wěn)定，會隨著時間延長逐漸分解，需要在短時間內(nèi)完成測定，否則容易影響定量的準(zhǔn)確性，這對批量檢測樣品工作帶來極大不便。鑒于熒光衍生產(chǎn)物易分解，導(dǎo)致定量不準(zhǔn)確、批量檢測工作不方便等原因，針對目前磺胺類藥物多殘留檢測的實際需要，本研究根據(jù)磺胺類藥物與熒光胺可能發(fā)生的反應(yīng)機理，對影響衍生化反應(yīng)的各個因素系統(tǒng)地進行選擇、優(yōu)化，確定維持衍生化反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定性的方法。對豬肉樣品的磺胺-熒光胺衍生產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜法測定，大大提高了方法的準(zhǔn)確度和實用性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

50 份豬肉樣品，均隨機購自青島市各農(nóng)貿(mào)市場。

熒光胺（純度≥99%） 美國Sigma公司;乙腈（色譜純） 德國Merck公司;甲酸（色譜純） 上海安譜實驗科技股份有限公司;KH2PO4（分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品：磺胺二甲異嘧啶（sulfisomidine，SM2，純度94.0%）、磺胺嘧啶（sulfadiazine，SD，純度99.1%）、磺胺二甲嘧啶（sulfamethazine，SM2，純度99.4%）、磺胺間甲氧嘧啶（sulfamonomethoxine，SMM，純度98.0%）、磺胺甲噻二唑（sulfamethizole，STZ，純度99.3%）、磺胺對甲氧嘧啶（sulfamethoxydiazine，SMD，純度98.0%）、磺胺鄰二甲氧嘧啶（sulfadoxine，SDO，純度99.1%）、磺胺甲惡唑（sulfamethoxazole，SMZ，純度99.5%）、磺胺間二甲氧嘧啶（sulfadimethoxine，SDM，純度99.4%） 德國Dr. Ehrenstorfer公司;磺胺甲氧吡嗪（sulfamethoxypyrazine，SMPZ，純度98%） 加拿大TRC公司;磺胺曲沙唑（sulfatroxazole，STX，純度99.8%） 澳大利亞國家計量研究院。

1.2 儀器與設(shè)備

e2695高效液相色譜儀（配備Waters 2475熒光檢測器） 美國Waters公司;Centrifuge 5804 R臺式高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司;MilliQ超純水儀 美國Millipore公司;N-EVAP 112氮吹儀?美國Organomation公司;Oasis HLB固相萃取柱（60 mg，3 mL） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100 μg/mL）：精密稱取各磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品2.5 mg，分別置于25 mL棕色容量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，-20 ℃保存。磺胺類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（1.0 μg/mL）：準(zhǔn)確量取各標(biāo)準(zhǔn)儲備液100 μL于10 mL棕色容量瓶中，混勻，并用甲醇稀釋定容至刻度。磺胺類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（0.1 μg/mL）：準(zhǔn)確量取1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液1 mL于10 mL棕色容量瓶中，混勻，并用甲醇稀釋定容至刻度。-20 ℃保存。

提取溶液（0.1 mol/L KH2PO4）：取KH2PO4 6.80 g，用超純水溶解并定容至500 mL。

衍生溶液（0.1 mol/L KH2PO4，pH 3.0）：取KH2PO4 0.68 g，超純水溶解，并用0.1 mol/L H3PO4溶液調(diào)節(jié)pH值至3.0，最后用超純水定容至50 mL。

衍生試劑（0.3 mg/mL熒光胺）：精確稱取熒光胺7.50 mg，丙酮溶解并定容至25 mL。

1.3.2 樣品前處理

取豬肉樣品，經(jīng)勻漿制備成肉糜狀，準(zhǔn)確稱?。?.00±0.01） g于50 mL具塞離心管中，加入提取液10 mL，多管渦旋儀渦旋5 min，8 000 r/min離心8 min后倒出上清液;重復(fù)提取1 次，合并上清液，混勻;取5 mL合并后的上清液，加入經(jīng)3 mL甲醇、3 mL水活化的HLB固相萃取柱，分別用3 mL水和3 mL體積分?jǐn)?shù)20%甲醇水溶液淋洗，真空抽干后用3 mL甲醇洗脫，45 ℃水浴氮氣吹干，待用。

1.3.3 衍生化反應(yīng)

經(jīng)前處理后的樣品，加入0.1 mol/L KH2PO4（pH 3.0）溶液0.8 mL渦旋溶解，再加入0.3 mg/mL熒光胺溶液0.2 mL，混合均勻后，4 ℃條件下反應(yīng)40 min，待測。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;柱溫25 ℃;流速1.0 mL/min;進樣量10 μL;檢測波長：激發(fā)波長405 nm，發(fā)射波長495 nm;流動相：A為體積分?jǐn)?shù)0.2%甲酸水溶液，B為乙腈;梯度洗脫程序如下：0～3.0 min，流動相A體積分?jǐn)?shù)66%;3.0～15 min，流動相A體積分?jǐn)?shù)線性變化至60%;15～30 min，流動相A體積分?jǐn)?shù)保持60%;30～33 min，流動相A體積分?jǐn)?shù)線性變化至66%;33～35 min，流動相A體積分?jǐn)?shù)保持66%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

折線圖采用Graphpad Prism 5軟件繪制;色譜圖采用Waters Empower 2工作站進行數(shù)據(jù)采集和處理，自動計算擬合線性回歸曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生化反應(yīng)條件優(yōu)化

磺胺類藥物中含有芳香伯氨基，在酸性溶液中加入一定濃度的熒光胺衍生試劑，11 種磺胺類藥物都顯示出良好的反應(yīng)活性，室溫下反應(yīng)40 min衍生產(chǎn)物峰面積最大，并基本穩(wěn)定，但是，隨著時間的延長，衍生產(chǎn)物會發(fā)生降解，24 h后基本衰減完全，嚴(yán)重影響準(zhǔn)確定量。為了更好地應(yīng)用于日常檢測工作，本研究根據(jù)衍生化反應(yīng)可能發(fā)生的反應(yīng)機理，對該衍生化反應(yīng)條件加以優(yōu)化。主要從衍生溶液pH值、衍生反應(yīng)時間、熒光胺質(zhì)量濃度等方面進行研究，以期得到最優(yōu)反應(yīng)條件。

2.1.1 衍生溶液pH值對峰面積的影響

根據(jù)磺胺與熒光胺的反應(yīng)機理，衍生溶液的pH值對衍生化反應(yīng)的影響至關(guān)重要，分別對不同pH值條件下（pH 3.0、7.0、10.0）衍生化產(chǎn)物峰面積進行比較。在堿性條件下（pH 10.0），衍生化產(chǎn)物幾乎沒有響應(yīng);在中性條件下（pH 7.0）響應(yīng)很微弱，而在酸性條件下（pH 3.0）響應(yīng)明顯增強。

為進一步確認(rèn)最佳溶液pH值，在pH 2.0～7.0做加密測試，由圖2可知，在pH 2.0～5.0范圍內(nèi)均可獲得較強的熒光強度，而且低pH值條件可降低熒光產(chǎn)物的衰減速率，因此，選擇pH 3.0的KH2PO4緩沖溶液。

2.1.2 衍生反應(yīng)時間對峰面積的影響

比較衍生化反應(yīng)0～100 min產(chǎn)物的峰面積，由圖2可知：反應(yīng)時間0～40 min時，隨著時間延長，峰面積增大;40～80 min峰面積趨于穩(wěn)定，80 min后衍生產(chǎn)物峰面積開始下降，因此，選擇40 min作為衍生化反應(yīng)時間。

2.1.3 熒光胺質(zhì)量濃度對峰面積的影響

不同質(zhì)量濃度熒光胺溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL）對衍生反應(yīng)有影響。由圖2可知，隨著熒光胺質(zhì)量濃度的升高，衍生化產(chǎn)物峰面積逐漸增大，當(dāng)熒光胺質(zhì)量濃度達(dá)到0.3 mg/mL時，峰面積達(dá)到最大并趨于穩(wěn)定，因此，選用0.3 mg/mL熒光胺溶液。

2.1.4 衍生產(chǎn)物的反應(yīng)條件對峰面積的影響

磺胺-熒光胺衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性差，室溫下長時間放置衍生產(chǎn)物會逐漸衰減，對準(zhǔn)確定量造成影響。為此，衍生化后的樣品分別在室溫和4 ℃下避光保存，分別于0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、10.0、12.0、15.0、18.0 h測定。室溫條件下，衍生產(chǎn)物在80 min內(nèi)穩(wěn)定，隨后開始降解（圖2和圖3）;而在4 ℃條件下，衍生產(chǎn)物在12 h內(nèi)維持穩(wěn)定，未出現(xiàn)顯著衰減情況（圖3）。因此，本方法采用低溫條件進行反應(yīng)和檢測，可實現(xiàn)批量樣品的篩查分析。

11 種磺胺類藥物具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，且SMM與SMD、SDO與SDM互為同分異構(gòu)體，增加了液相色譜分離的難度。考察XBridge Shield RP 18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Symmetry C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）3 種色譜柱對目標(biāo)化合物的分離效果。結(jié)果表明，3 種色譜柱均能有效保留11 種化合物，但XBridge Shield RP 18和Symmetry C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）分離效果不好，色譜峰得不到完全分離。而Symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）在35 min內(nèi)可有效分離11 種磺胺類藥物。圖4為該色譜柱條件下空白豬肉樣品和空白豬肉添加11 種磺胺類藥物后的色譜圖。

2.3 方法學(xué)評價

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

配制不同質(zhì)量濃度（1、5、10、20、50、100、200 μg/L）的11 種磺胺類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.3節(jié)方法衍生化后，經(jīng)高效液相色譜-熒光檢測器檢測，以各藥物峰面積（y）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x，μg/L）為橫坐標(biāo)，進行線性回歸。

由表1可知，11 種磺胺類藥物在1～200 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R2≥0.999 4）。分別以3 倍和10 倍信噪比對應(yīng)的質(zhì)量濃度，計算本方法測定豬肉樣品中磺胺類藥物的檢出限和定量限，其中SM2、SD、SM2、SMM、STZ和SMD的檢出限為0.3 μg/kg，定量限為0.8 μg/kg，SMPZ、SDX、SMZ和STX的檢出限為0.4 μg/kg，定量限為1.2 μg/kg，SDM的檢出限為0.5 μg/kg，定量限為1.6 μg/kg。

2.3.2 準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度

在空白豬肉中添加11 種磺胺類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，加標(biāo)量分別為2、50、100 μg/kg，進行加標(biāo)回收實驗，考察方法的加標(biāo)回收率、日內(nèi)和日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。由表2可知，11 種磺胺類藥物的平均加標(biāo)回收率為62.0%～108.0%，日內(nèi)RSD為2.0%～8.8%，日間RSD為1.8%～8.6%。

2.4 方法比較

本研究比較了高效液相色譜-紫外法、柱前和柱后衍生高效液相色譜-熒光法測定豬肉中磺胺類藥物殘留量的方法，其中，高效液相色譜-紫外法選擇性低，雜峰干擾明顯，信號峰弱;柱后衍生法是在線衍生，從進樣器吸取樣品到檢測器檢測到信號，磺胺類藥物不能在短時間內(nèi)完全反應(yīng)，熒光響應(yīng)值明顯低于柱前衍生法。磺胺與熒光胺反應(yīng)得到的衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定性差，有文獻(xiàn)報道要在1 h內(nèi)完成測定[25-26]，否則會影響定量的準(zhǔn)確性;而在本研究中，4 ℃條件下衍生化產(chǎn)物維持12 h不發(fā)生衰減。綜上，在本研究條件下，方法的定量限低（0.8～1.6 μg/kg）、雜質(zhì)干擾程度低、信號峰響應(yīng)高、重現(xiàn)性好，提高了方法的準(zhǔn)確性和批量操作的可靠性。

2.5 方法應(yīng)用

使用GB/T 20759—2006《畜禽肉中十六種磺胺類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》和本方法對青島市各農(nóng)貿(mào)市場隨機抽取的50 份豬肉樣品中磺胺類藥物殘留進行測定，結(jié)果表明，有1 份樣品SM2為陽性，2 種方法測定得到樣品中SM2的殘留量分別為190、192 μg/kg，無明顯差異，表明本方法準(zhǔn)確、可靠，可用于基層豬肉樣品中磺胺類藥物殘留的檢測。

3 結(jié) 論

根據(jù)磺胺類藥物與熒光胺可能發(fā)生的反應(yīng)機理，對衍生化反應(yīng)條件進行系統(tǒng)優(yōu)化，建立熒光胺柱前衍生-高效液相色譜檢測豬肉中11 種磺胺類藥物殘留的分析方法。該方法靈敏度高、重復(fù)性好而且對儀器設(shè)備要求不高，操作快速簡便，可用于畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測，如批量樣品中磺胺類藥物殘留的篩查和確證工作，為基層一線的實際檢測提供可靠的技術(shù)支持。

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收稿日期：2021-08-10

基金項目：青島市科技惠民專項（18-6-107-NSH）

第一作者簡介：王曉茵（1989—）（ORCID： 0000-0001-8457-4121），女，助理研究員，碩士，研究方向為動物源性食品安全檢測及風(fēng)險評估。E-mail： 550584620@qq.com

通信作者簡介：趙思?。?979—）（ORCID： 0000-0002-8690-7193），男，副研究員，博士，研究方向為動物源性食品安全檢測及風(fēng)險評估。E-mail： zhsjun@126.com