劉 鵬，徐淼焱，李光耀，常皓云，黃 鵬,2*

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230012； 2.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 中藥研究與開發(fā)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012）

近年來隨著生活水平的提高，中老年人群中高血脂發(fā)病率不斷升高，嚴(yán)重影響患者身體健康和生活質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)高血脂癥可導(dǎo)致動脈粥樣硬化（AS）進(jìn)而引發(fā)其它心腦血管疾病[1]。目前，臨床常用降血脂藥是他汀類，但是此類藥物長期服用易造成輕度肝損傷，如何研發(fā)更加安全有效的新型降血脂藥是藥物研究的熱點(diǎn)。大量研究發(fā)現(xiàn)一些天然酚類和黃酮類化合物均具有較好的降血脂作用[2]。因此，以天然活性酚類化合物作為先導(dǎo)化合物進(jìn)行新型降血脂藥物研發(fā)符合現(xiàn)代中醫(yī)藥發(fā)展的趨勢。

天然酚類化合物丹皮酚（Paeonol）是中藥丹皮的主要活性成分，具有多種生物功能，如抗炎、抗菌、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、抗動脈硬化、預(yù)防心血管系統(tǒng)疾病[3-9]等。但由于水溶性差、口服生物利用度低等缺點(diǎn)[10]，阻礙了其在臨床上的應(yīng)用與開發(fā)。氯貝丁酯是臨床常用的降血脂藥物，通過對苯氧乙酸類降脂藥物氯貝丁酯的結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)丹皮酚與其芳環(huán)結(jié)構(gòu)類似。鑒于此，基于生物電子等排原理，以丹皮酚取代氯貝丁酯的芳環(huán)部分，設(shè)計(jì)、合成了6個(gè)苯氧乙酸類結(jié)構(gòu)的丹皮酚類衍生物[11-12]，通過建立高血脂HepG2 細(xì)胞模型、脂肪酶活性抑制和膽酸鹽結(jié)合能力實(shí)驗(yàn)對6 個(gè)不同結(jié)構(gòu)的目標(biāo)化合物進(jìn)行體外降血脂活性評價(jià)研究，以期獲得具有降血脂效果好、生物利用度高的丹皮酚類衍生物。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

人肝癌細(xì)胞HepG2（上海弘順生物科技有限公司）。

1.2 儀器與試劑

Nicolet-6700 型傅立葉變換紅外光譜儀（美國尼高力科學(xué)儀器有限公司）；AV300 型核磁共振儀（德國Bruker 公司）；LCQ Advantage MAX 型液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀（美國Finnigan 公司）。iMark 型酶標(biāo)分析儀（美國BioRad 公司）。丹皮酚（分析純，廣州美懿生物科技有限公司）；α-溴代異丁酸（分析純，山東西亞化學(xué)股份有限公司）；無水甲醇、無水乙醇、異丙醇、正丁醇、正戊醇、環(huán)己醇（分析純，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司）；EDCI-HCl、TBAB、DMAP（分析純，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司）；PBS 粉末（武漢賽維爾生物科技有限公司）；油酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；胎牛血清（雙洳生物科技有限公司）；BSA、Western 及IP 細(xì)胞裂解液（江蘇省凱基生物技術(shù)股份有限公司）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司）；胰蛋白酶、膽固醇、脂肪酶、甘氨膽酸鈉、牛黃膽酸鈉（上海麥克林生物科技有限公司）；非諾貝特（Merck Sharp& Dohme Limited U.K.）；BCA 法蛋白試劑盒、TC、TG、LDL-C、HDL-C 試劑盒（南京建成生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 合成實(shí)驗(yàn)研究

以丹皮酚為先導(dǎo)化合物，堿性條件下與α-溴代異丁酸反應(yīng)，得到2-（2-乙?；?5-甲氧基苯氧基）-2-甲基丙酸（丹皮酚異丁酸）（1）；利用丹皮酚異丁酸的羧基與不同的醇發(fā)生酯化反應(yīng)得到目標(biāo)化合物（2）。合成線路見圖1。

圖1 目標(biāo)化合物2a-2f 的合成路線Fig.1 The Synthesis route for compound 2a-2f

2.1.1 2-（2-乙?；?5-甲氧基苯氧基）-2-甲基丙酸（丹皮酚異丁酸）的制備 參考文獻(xiàn)[13]并略作改動：分別稱取1.0 g（6.1 mmol）丹皮酚、3.0 g（18 mmol）α-溴代異丁酸、5.0 g（125 mmol）NaOH加入50 mL 圓底燒瓶中，加入11 mL DMF 溶解，室溫?cái)嚢?，薄層色譜法（TLC）監(jiān)測反應(yīng)結(jié)束后，加入110 mL 水，再 加HCl 溶 液 調(diào) 節(jié)pH = 2，EA 萃 ?。?0 mL × 3）， 飽 和NaHCO3洗（60 mL×3）， 無 水Na2SO4干燥，濃縮，柱層析［V（乙酸乙酯）∶V（石油醚）= 1 ∶5］得橘紅色油狀物640 mg，收率42.0%。

2.1.2 2-（2-乙酰基-5-甲氧基苯氧基）-2-甲基丙酸甲酯（2a）的制備 分別稱取253 mg（1 mmol）丹皮酚異丁酸、328 mg（1 mmol）TBAB、123 mg（1 mmol）DMAP、330 mg（1.5 mmol）EDCI-HCl置于50 mL 圓底燒瓶中，加入5 mL 無水甲醇溶解，30℃攪拌，TLC 監(jiān)測反應(yīng)結(jié)束后，加入100 mL 水，DCM 萃?。?0 mL×3），飽和NaHCO3洗（30 mL × 3），無水Na2SO4干燥，濃縮，柱層析［V（乙酸乙酯）∶V（石油醚）=1 ∶4］得淡黃色油狀物133 mg，收率50.0%。1H-NMR（600 MHz，CDCl3） δ：7.76（d，J= 8.8 Hz，1H），6.53（d，J= 8.8，2.0 Hz，1H），6.17（d，J= 2.0 Hz，1H），3.78（s，3H），3.76（s，3H），2.60（s，3H），1.70（s，6H）。IR（KBr），ν，cm-1: 1 500，1 606，1 657，1 263，1 733。ESI-MS（m/z）：267.125 5[M+H]+（理論值：267.115 4）。

化合物2b-2e 按照化合物2a 的方法合成。

2b：淡黃色油狀物，145 mg，收率51.8%。1H-NMR（600 MHz，CDCl3） δ：7.77（d，J= 8.7 Hz，1H），6.53（d，J= 8.8，2.1 Hz，1H），6.21（d，J= 2.2 Hz，1H），4.23（q，J= 7.1 Hz，2H），3.77（s，3H），2.60（s，3H），1.70（s，6H），1.22（t，J= 7.1Hz，3H）。IR （KBr），ν，cm-1: 1 737，1 667，1 602，1 573，1 267，1 204，1 173，1 136，1 070，1 035。ESI-MS（m/z）：281.143 3[M+H]+（理論值：281.131 1）。

2c：黃色油狀物，138 mg，收率46.9%。1H-NMR（600 MHz，CDCl3） δ：7.75（d，J= 8.8 Hz，1H），6.51（d，J= 8.8，2.2 Hz，1H），6.22（d，J= 2.2 Hz，1H），5.06（m，J= 6.3 Hz，1H） ，3.76（s，3H），2.59（s，3H），1.68（s，6H），1.18（s，6H）。IR（KBr），ν，cm-1: 1 735，1 667，1 602，1 496，1 267，1 177，1 137，1 103，1 071，1 035。ESI-MS（m/z）：295.157 5[M+H]+（理論值：295.146 7）。

2d：黃色油狀物，145 mg，收率45.5%。1H-NMR（600 MHz，CDCl3） δ：7.76（d，J= 8.8，1.0 Hz，1H），6.51（dd，J= 8.7，2.3，0.9 Hz，1H），6.20（d，J= 2.3，1.1 Hz，1H），4.15（t，2H），3.76（s，3H），2.59（s，3H），1.69（d，J= 1.1 Hz，6H），1.55（p，2H），1.24（h，J= 7.4 Hz，2H），0.84（t，J= 7.4，1.0 Hz，3H）。IR（KBr），ν，cm-1：1 737，1 669，1 601，1 573，1 267，1 204，1 176，1 137，1 070，1 037。ESI-MS（m/z）：309.168 0[M+H]+（理論值：309.374 0）。

2e：黃色油狀物，141 mg，收率43.8%。1H-NMR（600 MHz，CDCl3） δ：7.76（d，J= 8.8，1.3 Hz，1H），6.51（dd，J= 8.7，2.3，1.2 Hz，1H），6.20（d，J= 1.8 Hz，1H），4.15（t，J= 6.6，1.3 Hz，2H），3.76（s，3H），2.60（s，3H），1.70（s，6H），1.55（tt，2H），1.27 - 1.22（m，2H），1.20 - 1.14（m，2H），0.85 - 0.79（m，3H）。IR（KBr），ν，cm-1：1 737，1 669，1 601，1 573，1 267，1 205，1 175，1 137，1 070，1 038。ESI-MS（m/z）：323.183 9[M+H]+（理論值：323.401 0）。

2f：淡黃色油狀物，148 mg，收率44.3%。1H-NMR（600 MHz，CDCl3） δ：7.75（d，J= 8.8，1.2 Hz，1H），6.50（dd，1H），6.23（d，1H），4.85（p，J= 8.4，3.7 Hz，1H），3.76（s，3H），2.60（s，3H），1.71 -1.67（m，6H），1.51（s，4H），1.46-1.32（m，4H），1.32-1.20（m，2H）。IR（KBr），ν，cm-1：1 735，1 669，1 601，1 573，1 267，1 204，1 176，1 137，1 070，1 037。ESI-MS （m/z）：335.183 9[M+H]+（理論值：335.412 0）。

2.2 體外降血脂實(shí)驗(yàn)

2.2.1 高血脂HepG2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 將HepG2 細(xì)胞（1×105個(gè)/mL）接種于24 孔板內(nèi)，孵育24 h 后取出，設(shè)空白組、模型組、非諾貝特組、丹皮酚組和目標(biāo)化合物2a-2f 組，各組均設(shè)置3 個(gè)平行孔。各給藥組濃度為25 μmol/L 條件下，空白組加入2% BSA、1%FBS 高糖DMEM 培養(yǎng)基，模型組加入含1 mmol/L油酸、1% FBS 高糖DMEM 培養(yǎng)基，各給藥組加入1 mmol/L 油酸、1% FBS 高糖DMEM 培養(yǎng)基，然后將24 孔板放置于恒溫培養(yǎng)箱，孵育24 h 后移除培養(yǎng)液，PBS 輕洗3 遍，Western Blot、IP 細(xì)胞裂解液冰浴30 min 后，收集裂解液，將裂解液置于離心機(jī)離心10 min（4℃、12 000 r/min）后，取上清液，參照試劑盒操作說明分別測定TC、TG、LDL-C、HDL-C含量，每組均設(shè)3 個(gè)平行孔，結(jié)果以mmol/gprot 表示[14]。

2.2.2 脂肪酶活性抑制實(shí)驗(yàn) 在試管中分別加入4 mL PBS 緩沖液（pH 7.4）、4 mL 聚乙烯醇、橄欖油（0.330 g/mL），同時(shí)加入2 mL（1 ～5 mg/mL）的2c、2f 溶液進(jìn)行混合，37℃水浴孵育10 min，再加入1 mL 濃度為2 mg/mL 胰脂肪酶液，反應(yīng)15 min后，加入15 mL 95%乙醇終止酶反應(yīng)。滴加酚酞，用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定至略帶紅色?？瞻讓?shí)驗(yàn)中，停止反應(yīng)后加入胰脂肪酶液[15]。實(shí)驗(yàn)平行處理3 次。計(jì)算公式：胰脂肪酶活性抑制率（%）=（不加目標(biāo)化合物酶活性-加入目標(biāo)化合物酶活性）/不加目標(biāo)化合物酶活性×100%。

2.2.3 結(jié)合膽酸鹽能力實(shí)驗(yàn) 以甘氨膽酸鈉和?；悄懰徕c作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別取甘氨膽酸鈉（0.05、0.10、0.15、0.20、0.30 mmol/L），?；悄懰徕c（0.05、0.10、0.15、0.20、0.30 mmol/L）2 mL 于試管中，加入4 mL 60% H2SO4，70℃條件下，先水浴20 min，再冰浴5 min，于387 nm 波長處測定吸光度，繪圖得膽酸鹽含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程，分別為Y=1.99X+ 0.049 和Y= 2.725 7X+ 0.003 9，相關(guān)系數(shù)分別為R2= 0.998 9 和R2= 0.999 3。

另外分別取2.0 mL 目標(biāo)化合物2c、2f 溶液于具塞燒瓶中，模擬胃消化過程：加入 2 mL 10 mg/mL胃蛋白酶（溶于0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液中，pH = 6.3）和0.5 mL 0.01 mol/L HCl，在37℃下消化1 h。然后，用0.1 mol/L 的NaOH 溶液通過調(diào)節(jié)控制溶液pH 至6.3，加入2 mL 10 mg/mL 胰蛋白酶，在37℃條件下，恒溫系統(tǒng)振蕩消化1 h，模擬體內(nèi)腸道生態(tài)環(huán)境。各樣品中平行四組加入2 mL 0.20 mmol/L 甘氨膽酸鈉、?；悄懰徕c，37℃條件下，振蕩1 h，然后將溶液轉(zhuǎn)至離心管中離心30 min（2 000 r/min），收集上清液，使用比色法測定甘氨膽酸鈉和?；悄懰徕c含量[16]。每個(gè)樣品平行3 次。分別制備1.6 μmol/mL 和2.0 μmol/mL的甘氨膽酸鈉和?；悄懰徕c溶液作為檢測2c、2f 對膽酸鹽結(jié)合率的標(biāo)準(zhǔn)溶液。計(jì)算公式：膽酸鹽結(jié)合率（%）=（膽酸鹽加入量-膽酸鹽剩余量）/膽酸鹽加入量×100%。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 高血脂HepG2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

與空白組相比，模型組TC、TG、LDL-C 水平升高（P< 0.05），HDL-C 水平降低（P< 0.05），表明造模成功；與模型組相比，2c、2f 組TC、TG、LDL-C 水平降低（P< 0.05），HDL-C 水平升高（P<0.05），其它4 個(gè)化合物與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）；與丹皮酚組相比，2c、2f 組中TC、TG、LDL-C 水平降低（P< 0.05），HDL-C 水平升高（P< 0.05）；其它4 個(gè)化合物與丹皮酚組相比，TC、TG、LDL-C 水平均升高（P< 0.05），HDL-C水平均降低（P< 0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，合成的6 個(gè)丹皮酚異丁酸酯類衍生物中，化合物2c、2f 降血脂活性比先導(dǎo)化合物丹皮酚更佳，見表1。

表1 各組濃度為25 μmol/L 對HepG2 細(xì)胞TC、TG、LDL-C 和HDL-C的影響（±s，n = 3）Tab.1 Effects of 25 μmol/L on TC，TG，LDL-C and HDL-C in HepG2 cells（±s，n = 3）

表1 各組濃度為25 μmol/L 對HepG2 細(xì)胞TC、TG、LDL-C 和HDL-C的影響（±s，n = 3）Tab.1 Effects of 25 μmol/L on TC，TG，LDL-C and HDL-C in HepG2 cells（±s，n = 3）

注：模型組與空白組相比，#P < 0.05；各給藥組與模型組相比，*P < 0.05；各目標(biāo)化合物組與丹皮酚組相比，+P < 0.05。

HDL-C /（mmol/gprot）2a 0.09 ± 0.01*+ 1.04 ± 0.02*+ 1.71 ± 0.21*+ 0.40 ± 0.18+2b 0.09 ± 0.01*+ 1.49 ± 0.12*+ 1.81 ± 0.20+ 0.37 ± 0.14+2c 0.03 ± 0.04*+ 0.43 ± 0.10*+ 0.87 ± 0.11*+ 0.72 ± 0.21*+2d 0.10 ± 0.01+ 1.63 ± 0.12+ 2.01 ± 0.24+ 0.19 ± 0.13+2e 0.11 ± 0.02+ 1.72 ± 0.09+ 2.06 ± 0.33+ 0.21 ± 0.14+2f 0.03 ± 0.03*+ 0.62 ± 0.21*+ 0.85 ± 0.22*+ 0.74 ± 0.07*+丹皮酚組 0.04 ± 0.01* 0.74 ± 0.14* 1.06 ± 0.19* 0.69 ± 0.08*非諾貝特組 0.02 ± 0.01* 0.13 ± 0.14* 0.88 ± 0.12* 0.98 ± 0.18*模型組 0.13 ± 0.02# 1.88 ± 0.20# 2.30 ± 0.52# 0.23 ± 0.22#空白組 0.04 ± 0.01 0.20 ± 0.21 0.88 ± 0.25 1.63 ± 0.42 F 12.872 32.280 8.414 8.188 P 0.000 0.000 0.000 0.000組別 TC /（mmol/gprot）TG /（mmol/gprot）LDL-C /（mmol/gprot）

3.2 脂肪酶活性抑制實(shí)驗(yàn)

在濃度為1 ～5 mg/mL 范圍內(nèi)，隨著濃度增加，2c、2f 對脂肪酶的抑制作用也逐漸增強(qiáng)，當(dāng)濃度達(dá)到5 mg/mL 時(shí)，其對脂肪酶的抑制率均可達(dá)到60%左右，濃度與抑制率之間呈現(xiàn)量效關(guān)系，見圖2。

圖2 化合物2c、2f 對脂肪酶的抑制率（±s，n = 3）Fig.2 Inhibition rate of 2c，2f to lipase（±s，n = 3）

3.3 結(jié)合膽酸鹽能力實(shí)驗(yàn)

化合物2c、2f 對兩種膽酸鹽均有較強(qiáng)的結(jié)合能力，當(dāng)濃度為5 mg/mL 時(shí)，化合物2c、2f 對甘氨膽酸鈉、牛黃膽酸鈉的結(jié)合率分別達(dá)到了80%和90%左右，并呈現(xiàn)計(jì)量依賴效應(yīng)，見圖3、圖4。

圖3 化合物2c、2f 與甘氨膽酸鈉的結(jié)合率（±s，n = 3）Fig.3 Binding rate of 2c，2f with sodium glycocholate （SG）（±s，n = 3）

圖4 化合物2c、2f 與牛黃膽酸鈉的結(jié)合率（±s，n = 3）Fig.4 Binding rate of 2c，2f with sodium taurocholate（ST）（±s，n = 3）

4 討論

丹皮酚作為天然酚類化合物，具有一定的降血脂作用，但由于生物利用度低，常被修飾為成磷酸酯類、醚類、糖苷化類[17]等來增強(qiáng)生物利用度。本課題組采用生物電子等排原理將其酚羥基醚化后再制成酯類化合物，以提高穩(wěn)定性和降血脂活性。

油酸誘導(dǎo)HepG2高血脂細(xì)胞是體外降血脂活性研究最佳模型，為快速篩選降血脂活性化合物提供便捷平臺。前期實(shí)驗(yàn)中所有給藥組在濃度5 ～ 250 μmol/L范圍內(nèi)對油酸誘導(dǎo)HepG2 高血脂細(xì)胞進(jìn)行研究，結(jié)果均無細(xì)胞毒活性。綜合考慮篩選出25 μmol/L 為給藥濃度，并以TC、TG、LDL-C、HDL-C 為指標(biāo)考察目標(biāo)化合物降血脂活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與丹皮酚相比，合成的6 個(gè)目標(biāo)化合物中2c、2f 降血脂活性尤為突出，這兩個(gè)化合物能降低HepG2 高血脂模型細(xì)胞內(nèi)TC、TG、LDL-C 水平、升高HDL-C 水平。其作用機(jī)制一方面可能與提高了Akt 通路的磷酸化水平以及GCK 和LDLR 的蛋白質(zhì)水平有關(guān)[18]；另一方面可能與通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體-α，刺激脂蛋白酶、載脂蛋白基因表達(dá)，增強(qiáng)脂蛋白酶的脂解活性有關(guān)?；谏鲜黾?xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇化合物2c、2f 進(jìn)行脂肪酶活性抑制和結(jié)合膽酸鹽能力實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物2c、2f 不僅能有效抑制脂肪酶活性，還與兩種膽酸鹽有著較強(qiáng)的結(jié)合能力。究其原因，其一，化合物2c、2f 可能是有效的脂肪酶活性抑制劑，能夠阻止脂肪酶將脂肪水解為甘油和游離脂肪酸；其二，可能是通過對先導(dǎo)化合物丹皮酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾增加了化合物2c、2f 脂溶性，促進(jìn)了與兩種膽酸鹽的偶聯(lián)能力，提高了膽酸鹽肝腸循環(huán)，進(jìn)而減少膽固醇含量，達(dá)到降血脂目的[19]。

此外，對體外降血脂活性研究結(jié)果綜合分析，化合物2c、2f 降血脂活性最為突出，這主要?dú)w因于其具有與氯貝丁酯類似的苯氧異丁酸藥效基團(tuán)?；衔?c 降血脂活性稍優(yōu)于2f，可能是化合物2c 上酯基為異丙酯基團(tuán)，而2f 為環(huán)己烷酯，異丙酯基更容易促進(jìn)藥物吸收，增強(qiáng)降血脂活性。當(dāng)然，其具體降血脂機(jī)制還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

5 結(jié)論

設(shè)計(jì)合成了6 個(gè)丹皮酚異丁酸酯類衍生物，高血脂HepG2 細(xì)胞降血脂實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其中，化合物2c、2f 比先導(dǎo)化合物丹皮酚降脂活性更突出。體外脂肪酶活性抑制和膽酸鹽結(jié)合能力實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，化合物2c、2f 對脂肪酶的抑制作用呈量效關(guān)系；化合物2c、2f 對兩種膽酸鹽均顯現(xiàn)出較強(qiáng)的結(jié)合能力。這些研究為丹皮酚的開發(fā)利用提供了新的研究思路，亦為丹皮酚類衍生物在體外降血脂活性研究方面提供參考。