趙宇萌，陳吉聰，肖洪賀，田 雨，李 賀，田晉明，楊靜嫻

（遼寧中醫(yī)藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，病理表現(xiàn)為大腦皮層和海馬區(qū)出現(xiàn)老年斑、神經(jīng)纖維纏結和神經(jīng)元丟失。在AD 早期患者的腦內(nèi)普遍存在過量的活性氧，這將導致細胞膜的脂質(zhì)過氧化，進而促進細胞外Aβ 的沉積和細胞內(nèi)tau 蛋白的異常磷酸化，從而影響突觸功能，加速AD 進程，導致神經(jīng)元凋亡[1]。盡管國內(nèi)外現(xiàn)有藥物能部分緩解AD 癥狀，但無法有效改善腦內(nèi)的過氧化狀況，且長期使用均存在一定的副作用。因此，建立一種消除腦內(nèi)過多氧自由基的新方法對治療AD 具有重要意義。

核因子E2 相關因子2（Nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）是機體內(nèi)重要的氧化應激調(diào)控蛋白。過度的氧自由基會激活Nrf2，使其由胞漿向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，同時誘導血紅素氧合酶-1（Heme oxygenase-1，HO-1）的表達[2]。HO-1 是機體內(nèi)主要的抗氧化蛋白，可以促進血紅素的降解以及膽綠素的生成，并清除氧化還原失衡所積累的自由基，從而發(fā)揮抗氧化作用[3]。

人參皂苷Rg1（Ginsenoside Rg1，Rg1）是中藥人參的主要活性成分之一，相關研究表明，其具有增強免疫、神經(jīng)保護、抗氧化等多重生物活性[4]。另外，本課題組前期研究結果顯示[5]，以Rg1 為主要藥效成分的參棗健腦口服液能有效改善APP/PS1 小鼠的學習記憶能力并促進腦內(nèi)神經(jīng)再生?；谝陨涎芯拷Y果，推測Rg1 能通過抑制氧化應激損傷，改善腦內(nèi)微環(huán)境來發(fā)揮抗AD 的作用。因此，本實驗利用H2O2誘導小鼠神經(jīng)瘤母細胞構建體外細胞模型，采用Western Blot、免疫熒光染色等方法進一步探究Rg1 對H2O2-N2a 的影響，從而為其治療AD 提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 人參皂苷Rg1（四川省維克奇生物科技有限公司，批號：wkq19040208）；胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司，批號：19110505）；青-鏈雙抗（美國Hyclone 公司，批號：J190007）；Caspase3 抗 體（批號：WL02117）、Nrf2 抗體（批號：WL02135）、HO-1 抗 體（ 批 號：WL02400），GAPDH 抗體（批號：WL01114）、HRP 標記山羊抗兔lgG （批號：WLA023）、山羊抗兔CyTM3 標記二抗、Hoechst33258 染色液（批號：WLA036a）均購自沈陽萬類生物技術有限公司；CCK-8 細胞增殖檢測試劑盒（G021-1）、乳酸脫氫酶試劑盒（A020-2-2）、總超氧岐化酶測定（LDH）試劑盒（A001-1-2）和丙二醛（MDA）測定試劑盒（A033-1-2）均購自南京建成生物工程研究所。

1.1.2 實驗儀器 Ti-S 型倒置熒光顯微鏡（日本尼康株式會社）；C00I01HW 型CO2培養(yǎng)箱（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；MR-96A 型酶標儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；SH-510 型凝膠成像系統(tǒng)（杭州申花科技有限公司）。

1.1.3 實驗細胞 小鼠神經(jīng)瘤母細胞（N2a）購于賽業(yè)（蘇州）生物科技有限公司，批號：210409G61。在37℃、5% CO2條件下，用含10%胎牛血清、1% P/S的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)N2a細胞，選擇對數(shù)生長期細胞進行實驗。

實驗分為對照組、模型組、給藥組。對照組不進行處理；模型組加入濃度為500 μmol/L 的H2O2；給藥組加入50 μmol/L 的人參皂苷Rg1，同時給予濃度為500 μmol/L 的H2O2，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后進行檢測。

1.2 實驗方法

1.2.1 CCK-8 法檢測細胞活力 取N2a 細胞以5×103個/孔的密度接種于96 孔板中，待細胞貼壁后，給藥組分別加入不同濃度的Rg1（6.25、12.5、25、50、100 μmol/L）預保護24 h 后，模型組和給藥組給予H2O2（500 μmol/L）孵化5 h[6-9]，之后每孔加入10 μL CCK-8 溶液，37℃孵育2 h，并用酶標儀在450 nm 處檢測各組細胞的吸光度，繪制量效曲線。

1.2.2 Hoechst 33258 染色法檢測細胞凋亡率 取N2a 細胞以5×103個/孔的密度接種于96 孔板中，待細胞貼壁后，給藥組加入濃度為Rg1（50 μmol/L），藥物預保護24 h后，模型組和給藥組更換成H-DMEM基礎培養(yǎng)基，加入H2O2（500 μmol/L）孵育5 h。培養(yǎng)結束后，棄去培養(yǎng)基，加入100 μL 4%多聚甲醛溶液固定細胞10 min。棄去固定液，PBS 清洗3 min，重復兩次。再加入500 μL Hoechst 33258 染色液，置于搖床上染色5 min。棄去染色液，PBS 清洗3 min，重復兩次，使用抗淬滅封片液封片，熒光顯微鏡下拍照觀察。

1.2.3 免疫熒光細胞化學法檢測Caspase 3 的表達

細胞分組、接種方法、給藥方法同 “1.2.2”，培養(yǎng)結束后，各組細胞用4%多聚甲醛固定30 min，PBS 清洗3 次，每次5 min，0.5% Triton 室溫下透化5 min；PBS 洗 滌3 次， 每 次5 min。 隨 后 加 入Caspase 3 一抗孵育，4 ℃過夜。次日棄去液體，PBS清洗，再用CyTM3 標記二抗室溫孵育60 min；PBS洗滌3 次，每次5 min；加入DAPI 染色液（1 ∶10）避光反應2 min，PBS 洗滌3 次，每次5 min，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 LDH 釋放量的檢測 細胞分組、接種方法、給藥方法同 “1.2.2”，培養(yǎng)結束后，吸出96 孔板中各組細胞的培養(yǎng)基于1.5 mL 的EP 管中，4℃，3 000 r/min離心5 min，吸取上清液，并根據(jù)LDH 試劑盒使用說明進行檢測。

1.2.5 抗氧化指標的檢測 細胞分組、接種方法、給藥方法同 “1.2.2”，培養(yǎng)結束后，棄培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 1%，Triton 溶液破碎細胞30 min，隨后反復凍融細胞3 次，將溶液轉(zhuǎn)移至EP 管中，4℃，1 500 r/min，取上清液，按照試劑盒的說明測定SOD活性和MDA 含量。

1.2.6 檢測Nrf2 和HO-1 蛋白表達 細胞分組、接種方法、給藥方法、細胞透化同“1.2.3”，每空加入Nrf2 和HO-1 一抗（1 ∶150），4 ℃孵育過夜。次日棄去液體，PBS 清洗，再用CyTM3 標記的二抗（1 ∶200）室溫孵育60 min；PBS 洗滌3 次，每次5 min；加入DAPI 染色液（1 ∶10）避光反應2 min，PBS洗滌3次，每次5 min，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7 Western Blot 法檢測Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平 取N2a 細胞以1×105個/mL 的密度接種于6孔板中，細胞分組、給藥方法同“1.2.2”，培養(yǎng)結束后，棄培養(yǎng)基，預冷的PBS 洗滌3 次，根據(jù)全蛋白試劑盒說明書提取蛋白，根據(jù)BCA 蛋白定量試劑盒進行蛋白定量并調(diào)整蛋白濃度；兩端各加入5 μL 預染的Marker，122 V 恒壓電泳90 min，當指示劑達到分離膠底部停止電泳[10]，轉(zhuǎn)膜后，使用5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入Nrf2、HO-1 和GAPDH 一抗抗體，4 ℃過夜，次日，將PVDF 膜用TBST 液清洗后，孵育二抗，TBST 洗膜3 次，用超敏ECL 化學發(fā)光試劑盒顯色，用Image J 圖像分析軟件對條帶掃描；以GAPDH 作為內(nèi)參，分析目的蛋白表達。

1.2.8 統(tǒng)計學方法 用SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 Rg1 改善H2O2-N2a 的細胞形態(tài)并促進存活

模型組細胞在給予500 μmol/L H2O2損傷5h 后，與對照組相比，細胞存活率明顯下降（P< 0.01）。而經(jīng)不同濃度Rg1 預保護24 h 后，與模型組相比，各給藥組細胞存活率均有不同程度的提升；其中，25、50 μmol/L Rg1 組更明顯（P< 0.05）。根據(jù)實驗結果，選擇50 μmol/L Rg1 預保護24 h 進行后續(xù)實驗。光鏡下可見，對照組細胞胞體飽滿，生長狀態(tài)良好，模型組細胞胞體皺縮，存在凋亡情況；而經(jīng)過50 μmol/L Rg1 預保護24 h 后，細胞形態(tài)有所改善，凋亡細胞數(shù)目減少，見圖2。以上結果證明，Rg1 預保護能改善H2O2-N2a 的細胞形態(tài)并促進存活。

圖1 不同濃度Rg1 對H2O2 誘導N2a 細胞的保護作用（n = 6）Fig.1 Protective effect of different concentrations of Rg1 on H2O2 induced N2a cell damage （n = 6）

圖2 Rg1 對細胞影響的光鏡圖Fig.2 Microscopic view of the effect of Rg1 on cells

2.2 Rg1 減少H2O2-N2a 的凋亡

LDH 釋放量的結果見圖3，模型組細胞在給予H2O2損傷后，與對照組相比，LDH 的釋放量明顯升高（P< 0.01），而經(jīng)50 μmol/L Rg1 預保護24 h后，與模型組相比，給藥組LDH 的釋放量下降（P<0.01）。使用Hoechst 33258 染色以及免疫熒光化學染色進一步驗證Rg1 的抗凋亡作用。Hoechst 33258 染色結果見圖4、圖5，細胞損傷后，與對照組相比，模型組凋亡發(fā)生率明顯上升（P< 0.01）；而經(jīng)Rg1預保護后，給藥組細胞凋亡率較模型組相比明顯下降（P< 0.01）。Caspase 3 是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，Caspase 3 表達的升高意味著細胞逐漸趨于凋亡。與對照組相比，模型組Caspase 3 陽性細胞率明顯上升（P< 0.01），而給予Rg1 預保護后，給藥組細胞內(nèi)Caspase 3 陽性細胞率較模型組相比明顯下降（P< 0.01），見圖6、圖7。綜上所述，Rg1能有效減少H2O2-N2a 的凋亡。

圖3 LDH 釋放量統(tǒng)計圖（n = 6）Fig.3 Statistical plot of LDH release（n = 6）

圖4 Hoechst 33258 法檢測細胞凋亡Fig.4 Detecting cell apoptosis by Hoechst 33258

圖5 Hoechst 33258 統(tǒng)計圖（n = 6）Fig.5 Statistical plot of Hoechst 33258 （n = 6）

圖6 免疫熒光染色法檢測Caspase 3 陽性細胞的表達Fig.6 Immunofluorescence staining detect the expression of Caspase 3 positive cell

圖7 Rg1 對Caspase 3 陽性細胞率統(tǒng)計圖（n = 6）Fig.7 Statistical plot of Caspase 3 positive cell rate（n = 6）

2.3 Rg1 抑制H2O2-N2a 的氧化應激損傷

MDA 是脂質(zhì)氧化的終產(chǎn)物，反映機體脂質(zhì)過氧化的程度。SOD 是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)。因此測定MDA 和SOD 可有效的放映細胞的氧化應激狀態(tài)。與對照組相比，模型組細胞在與給予H2O2損傷后，MDA 含量明顯上升，SOD 活性明顯降低（P< 0.01）；而經(jīng)Rg1 預保護后，與模型組相比，細胞內(nèi)MDA 的含量下降，SOD 的活性有所上升（P< 0.05），見圖8。根據(jù)以上結果，認為Rg1 能有效抑制H2O2-N2a 的氧化應激損傷。

，圖8 Rg1 對MDA、SOD 影響的統(tǒng)計圖（n = 6）Fig.8 Statistical plot of Rg1 effect on MDA and SOD（n = 6）

2.4 Rg1 對N2a 細胞Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平的影響

為了探討Rg1 抑制H2O2誘導的N2a 細胞氧化損傷作用的機制，我們采用免疫熒光化學法和Western Blot 法檢測Nrf2 和HO-1 的表達情況。免疫熒光結果見圖9 -圖12，給予H2O2損傷后，與對照組相比模型組細胞Nrf2 和HO-1 的表達量減少（P< 0.01），而給予Rg1 后，細胞內(nèi)Nrf2 和HO-1 的表達水平明顯上升（P< 0.05，P< 0.01）。Western Blot 結果見圖13、圖14，與對照組相比，模型組細胞Nrf2 和HO-1 的表達明顯降低（P< 0.01）；而與模型組相比，給予Rg1 后，細胞內(nèi)Nrf2 和HO-1 的表達明顯增加（P< 0.05，P< 0.01）。

圖9 免疫熒光染色法檢測Nrf2 陽性細胞的表達Fig.9 Immunofluorescence staining detect the expression of Nrf2positive cell

圖10 Nrf2陽性細胞率統(tǒng)計圖（n = 6）Fig.10 Statistical plot of Nrf2 positive cell rate（n = 6）

圖11 免疫熒光染色法檢測HO-1 的表達Fig.11 Immunofluorescence staining detect the expression of HO-1

圖12 Rg1 對HO-1 陽性細胞率統(tǒng)計圖（n = 6）Fig.12 Statistical plot of HO-1 positive cell rate（n = 6）

圖13 Western Blot 條帶圖Fig.13 Western Blot strip plot

圖14 Nrf2、HO-1 相對表達量的統(tǒng)計圖（n = 3）Fig.14 Statistical plot of relative expression levels of Nrf2 and HO-1（n = 3）

3 討論

由于目前AD 的發(fā)病機制尚未完全闡述清楚，使得AD 體外細胞模型的構建呈現(xiàn)多樣性。眾多研究表明，氧化應激參與AD 的病理過程，能夠?qū)е律窠?jīng)元凋亡并加速AD 的產(chǎn)生。H2O2是機體內(nèi)常見的活性氧，被認為是神經(jīng)元凋亡的啟動劑，N2a 細胞具有神經(jīng)干的特性，常被用于研究神經(jīng)退行性疾病，因此本實驗采用H2O2損傷N2a 建立氧化應激損傷模型。

文獻報道顯示，Rg1 對腦缺血和血管性癡呆大鼠的認知功能障礙具有明顯改善作用，可以抑制海馬CA1 區(qū)細胞凋亡[11]，說明Rg1 具有良好的神經(jīng)保護作用。實驗結果證實，Rg1 能提升H2O2-N2a 細胞的存活率并降低其LDH 的釋放量，具有明顯的神經(jīng)保護作用。

為明確Rg1 對H2O2-N2a 細胞氧化應激的影響，實驗檢測了MDA 的含量和SOD 的活性，發(fā)現(xiàn)模型組細胞的MDA 含量增高，SOD 活性降低，細胞抗氧化水平降低，而Rg1 可有效降低MDA 含量，增加抗氧化物的活性，使細胞氧化與抗氧化保持平衡，保護細胞免受氧化應激損傷。為了進一步探究其作用機制，通過Western Blot 及免疫熒光檢測Nrf2 及其下游HO-1 蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)Rg1 能夠明顯增加H2O2損傷后總Nrf2 及HO-1 的表達，表明Rg1 可以通過激活Nrf2/HO-1 信號通路抑制神經(jīng)細胞的氧化應激反應。

4 結論

本實驗通過H2O2誘導N2a 構建體外細胞氧化損傷模型，探討Rg1 對AD 神經(jīng)細胞的保護作用。研究證明Rg1 能通過激活Nrf2/HO-1 信號通路抑制H2O2-N2a細胞的氧化應激損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。從機體氧化平衡角度出發(fā)，為Rg1 用于治療AD 提供了實驗基礎。另外，Rg1 通過抑制神經(jīng)細胞氧化應激損傷發(fā)揮抗AD 作用的結果仍有待利用動物模型進一步驗證。