李欣南 ， 葉 齊， 田曉玲， 馬新宇， 趙曉云， 韓鐫竹

（1.遼寧省檢驗檢測認證中心遼寧省農(nóng)產(chǎn)品及獸藥飼料產(chǎn)品檢驗檢測院，遼寧沈陽 110016；2.沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧沈陽 110016；3.沈陽市第四十三中學(xué)，遼寧沈陽 110036）

隨著蛹蟲草培育技術(shù)的成熟與發(fā)展，其產(chǎn)量也隨之不斷增大，據(jù)調(diào)查，平均每個生產(chǎn)廠家蛹蟲草的產(chǎn)量可達2000 kg/月，而栽培蛹蟲草剩余的廢棄米基多達6000 kg 以上 （肖千明，2017）。然而， 這些廢棄米基都作為廢棄的原料被扔掉，不僅造成環(huán)境的污染，也造成了能源的浪費。 蛹蟲草廢棄米基是在蛹蟲草采摘后所剩的蛹蟲草的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（文庭池等，2017；韋強等，2009），富含大量的氨基酸、多糖、蟲草素等營養(yǎng)物質(zhì)，可利用價值很高 （王建芳等，2005； 韋會平等，2004）， 因此對其開發(fā)利用有可觀的經(jīng)濟效益和社會效益（汪晶晶等，2016）。

當前，人民生活水平日益提高，人類對肉類、蛋類等食物需求不斷提高， 促使相關(guān)產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展， 同時造成飼養(yǎng)畜類禽類的飼料不同程度上的短缺（劉艷新等，2017；喬楓等，2013）。 因此，將生產(chǎn)蛹蟲草剩余的廢棄米基作為一種基礎(chǔ)培養(yǎng)基用于發(fā)酵生產(chǎn)，開發(fā)新型飼料，不僅可以減少對環(huán)境的污染也可避免資源的浪費（阮萍等，2017）。 因此，本試驗以蛹蟲草廢棄米基為發(fā)酵培養(yǎng)基，利用酵母菌作為發(fā)酵菌株，以蛋白質(zhì)、蟲草素等營養(yǎng)指標為參考，確定發(fā)酵工藝，為開發(fā)出以廢棄米基為原料的新型飼料產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 釀酒酵母、 嗜酸乳桿菌均由遼寧省檢驗檢測認證中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 蛹蟲草廢棄米基由沈陽蟲林密寶北蟲草食品科技有限公司提供； 酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（YPD）、乳酸細菌培養(yǎng)基（MRS）購自青島高科園海博生物科技有限公司。

1.1.3 試劑及儀器設(shè)備 尿素、氯化鈉等試劑購自國藥集團； 蟲草素標準品購自上海安譜科技公司； 甲醇 （色譜純） 購自默克股份有限公司；ESJ182-4 電子天平 （沈陽龍騰電子有限公司）；FW 80 高速粉碎機 （天津市泰斯特儀器有限公司）；三洋高壓滅菌鍋（MLS-3750-3780）；電熱鼓風(fēng)干燥箱YLA-6000 （上海實驗儀器有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱（Memmert 260 INplus）；近紅外光譜儀（Foss NIRS DS 2500）；高效液相色譜儀Agilent 1100（美國安捷倫科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備 10%半固體廢棄米基（以下稱為10%固體米基），廢棄米基與水的混合比例為1:10（m/m），經(jīng)121 ℃高壓滅菌15 min，冷卻備用， 其余比例半固體培養(yǎng)基均按照料水質(zhì)量比配制，滅菌方法同上。

1.2.2 平板計數(shù) 采用平板涂布法， 將樣品用0.85%的生理鹽水按1:10 依次稀釋至適宜濃度，選取3 個稀釋濃度， 分別吸取菌懸液0.1 mL 于事先準備好的培養(yǎng)基上（酵母菌使用YPD，嗜酸乳桿菌使用MRS， 混合菌使用兩種平板分別計數(shù)）， 用一次性無菌涂布棒將菌懸液在培養(yǎng)基表面涂布均勻，放置培養(yǎng)箱內(nèi)（酵母菌28 ℃，嗜酸乳桿菌30 ℃，混合菌29 ℃），培養(yǎng)72 h 計數(shù)（龔軍輝等，2018）。

1.2.3 衛(wèi)生指標的測定 霉菌總數(shù)按國標GB/T 13092 飼料中霉菌總數(shù)測定方法； 大腸菌群按國標GB/T 18869 飼料中大腸菌群的測定方法。

1.2.4 營養(yǎng)指標 按國標GB/T 18868 飼料中水分、粗蛋白質(zhì)、粗纖維、粗脂肪、賴氨酸、蛋氨酸快速測定方法近紅外光譜法； 沙門氏菌按照國標GB/T 13091 飼料中沙門氏菌的檢測方法 （湯旭等，2013）。

1.2.5 蟲草素的測定 采用高效液相色譜法進行測定，以甲醇：水=85:15 等度洗脫，流速為1 mL/min，柱溫為35 ℃。 取蟲草素標準品， 分別配制1、5、10、20、50、100 μg/mL 濃度的標準品溶液，測定標準品的峰面積，并以標準品的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

空白米基及樣品的含量測定：稱取6 份發(fā)酵樣品以及1 份空白米基，每份0.5 g，分別置于100 mL錐形瓶中， 加入80 mL 水，85 ℃水浴加熱3 h，30 min混勻一次，取出冷卻后轉(zhuǎn)移到100 mL 容量瓶中，定容至刻度線，搖勻；取1 mL 樣品溶液離心后過0.22 μm 微孔濾膜，用于高效液相分析；每次進樣10 μL，在260 nm 波長紫外燈下檢測，每份樣品重復(fù)測定3 次（李娟等，2012）。

1.2.6 正交試驗 通過正交試驗對二次發(fā)酵的主要影響因素發(fā)酵時間、米基添加量、接種量以及適當添加尿素等（汪倫記等，2012；焦靜等，2012；楊麗英等，2008）進行篩選，找出顯著性高的影響因素。 試驗對米基添加量、接種量、發(fā)酵時間進行3因素3 水平L9（34）正交試驗設(shè)計，以粗蛋白質(zhì)含量為檢測指標進行試驗研究。 因素水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平

根據(jù)正交試驗設(shè)計法得到3 因素3 水平L9（34）正交試驗設(shè)計表（表2）。 根據(jù)設(shè)計試驗，每個試驗號做3 組平行處理，共27 組試驗。

表2 L9（34）正交試驗設(shè)計

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵菌種的確定 使用10%半固體米基分別接種1%（m/m） 酵母菌、 嗜酸乳桿菌或混合菌（酵母菌：嗜酸乳桿菌=1：1），培養(yǎng)24 h 后進行菌落計數(shù)。 對照組則采用生理鹽水稀釋至適宜濃度后進行菌落計數(shù)。 通過比較試驗組和對照組菌體生長狀況， 篩選出適用于此種培養(yǎng)基的最佳發(fā)酵菌種（江成英等，2018）。一次發(fā)酵試驗的菌落計數(shù)結(jié)果見表3，從表中可以看出，三種發(fā)酵菌種方案中， 只有酵母菌在米基培養(yǎng)基中較對照組的菌落總數(shù)有所提高， 且廢棄米基發(fā)酵前pH 為4.9，符合酵母菌發(fā)酵適宜pH 范圍， 因此選擇酵母菌作為最終的發(fā)酵菌種。

表3 發(fā)酵菌種菌落總數(shù)計數(shù)結(jié)果

2.2 一次發(fā)酵主要影響因素的確定 主要考察了添加量分別為7.5%、10%、12.5%（m/m） 的半固體米基，接種量為1%（m/m）發(fā)酵培養(yǎng)24 h 對菌落總數(shù)的影響。結(jié)果如表4 所示。三個米基添加量發(fā)酵得到的菌種菌落計數(shù)均有提高，10%米基添加量的培養(yǎng)基干濕度適中， 營養(yǎng)成分足夠且有一定流動性，菌落計數(shù)最高，適用于酵母菌發(fā)酵，因此米基選用10%添加濃度。

表4 一次發(fā)酵米基添加量對菌落總數(shù)的影響

確定好米基最適添加量后， 考察發(fā)酵時間對菌落總數(shù)的影響。 從第10 小時開始，每隔2 h 觀察菌落生長狀況，保證菌種正常生長繁殖。選用在菌絲生長出前1 h 作為一次發(fā)酵的最適時間，經(jīng)過試驗得出最佳一次發(fā)酵時間為20 h。

2.3 二次發(fā)酵主要影響因素的確定 正交試驗結(jié)果如表5 所示， 并由表7 和表8 的極差分析和方差分析可知，當因素為B（接種量）時極差最大，F(xiàn)B 值大于F 0.05（2，2），且水平在k2時出現(xiàn)最大值。 因此各影響因素中對粗蛋白質(zhì)含量影響最顯著的是因素B（接種量），最佳接種量為6%；其次影響顯著的因素是時間； 米基添加量對粗蛋白質(zhì)含量影響最小，以12.5%米基添加量為最佳。

表5 L9（34）正交試驗結(jié)果與極差分析

表6 L9（34）正交試驗方差分析

2.4 二次發(fā)酵單因素考察

2.4.1 米基添加量及發(fā)酵時間的確定 利用廢棄米基和水配制成米基占總體積7.5%、10%、12.5%的廢棄米基培養(yǎng)基，經(jīng)121 ℃高壓滅菌15 min 作為二次發(fā)酵的培養(yǎng)基， 一次發(fā)酵得到的菌液作為二次發(fā)酵的母液， 以6%接種量接入到二次發(fā)酵培養(yǎng)基中， 放入28 ～30 ℃恒溫箱中分別發(fā)酵培養(yǎng)24、48、72 h 后，于烘箱中60 ℃烘干，冷卻后粉碎，測定各項指標。 以粗蛋白質(zhì)含量作為指標，結(jié)果如圖1 所示。從圖中可以看出，在米基添加量為12.5%，發(fā)酵時間為48 h 時，粗蛋白質(zhì)含量最高。因此二次發(fā)酵的米基添加量和時間初步確定為12.5%米基添加量，發(fā)酵48 h。

圖1 二次發(fā)酵米基添加量和時間對發(fā)酵的影響

2.4.2 接種量對發(fā)酵結(jié)果的影響 通過正交試驗結(jié)果可知接種量對于發(fā)酵的影響最顯著。 在一次發(fā)酵前期試驗的基礎(chǔ)上， 進行二次發(fā)酵接種量的確定，選取接種量為2%、4%、6%、8%、12%這5 個梯度進行試驗， 并通過測定粗蛋白質(zhì)含量確定最佳的接種量。試驗結(jié)果如圖2 所示。從圖中可以看出，接種量為6%時粗蛋白質(zhì)含量達到最大，隨后便隨接種量增大逐漸降低。因此，確定二次發(fā)酵接種量6%為最佳。

圖2 接種量對發(fā)酵結(jié)果的影響

2.4.3 添加尿素對發(fā)酵結(jié)果的影響 作為畜禽飼料， 粗蛋白質(zhì)含量是一項重要的指標（李勁松等，2018），而外加氮源不僅能影響菌種的生長發(fā)育，還能夠有效提高粗蛋白質(zhì)含量，因此發(fā)酵過程中尿素的添加量也是一項重要因素。本試驗在前期試驗基礎(chǔ)上， 分別在二次發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.1%、0.5%、1%、2%、4%尿素（m/m），發(fā)酵48 h 后，粗蛋白質(zhì)含量如圖3 所示。粗蛋白質(zhì)含量隨著尿素添加量的增加而增大，但過大的尿素濃度會影響菌種的正常發(fā)育，因此綜合考慮，尿素添加量為2%。

圖3 尿素添加量對發(fā)酵結(jié)果的影響

2.5 發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)與衛(wèi)生指標檢測 根據(jù)試驗最終得出廢棄米基發(fā)酵工藝的最佳發(fā)酵條件，發(fā)酵3 批次，每批次3 組平行對照，每組發(fā)酵量約500 g，經(jīng)60 ℃烘干，得到粗制品進行營養(yǎng)成分測定，結(jié)果見表7。經(jīng)過酵母菌發(fā)酵后，粗蛋白質(zhì)含量增加25.61%，Ca 含量增加2.51%，P 含量增加1.61%，粗脂肪含量增加23.42%，食鹽含量增加23.4%。這說明廢棄米基中的營養(yǎng)成分有不同程度的增加， 發(fā)酵過程對于提升廢棄米基的營養(yǎng)價值有一定的作用， 可為進一步研究米基二次發(fā)酵條件提供參考。 試驗對9 批次粗制品中霉菌總數(shù)、大腸菌群和沙門氏菌進行了檢測，結(jié)果均為陰性。

表7 廢棄米基發(fā)酵前后營養(yǎng)成分含量%

2.6 發(fā)酵產(chǎn)物中蟲草素的含量測定 依據(jù)標準品分析的測定結(jié)果， 測得蟲草素濃度與峰面積的標準曲線方程為：y＝36.819x-15.265（r2＝0.9996），在1 ～20 μg/mL 內(nèi)線性關(guān)系良好，蟲草素標準品HPLC 圖見圖4-B。 發(fā)酵產(chǎn)物以及空白米基HPLC圖見圖4-C、圖4-A。 6 份樣品蟲草素含量測定結(jié)果見表8，與發(fā)酵前米基中蟲草素含量相比，經(jīng)發(fā)酵后蛹蟲草廢棄米基中保留了蟲草素， 并且發(fā)酵過程對蟲草素沒有影響， 這對廢棄米基作為一種新型發(fā)酵飼料具有極大價值。

圖4 發(fā)酵產(chǎn)物中蟲草素含量測定

表8 發(fā)酵產(chǎn)物蟲草素的含量測定結(jié)果（n=3）

3 討論

本試驗通過對廢棄米基的二次發(fā)酵， 優(yōu)化確定了一套廢棄米基發(fā)酵的最適條件：以釀酒酵母為發(fā)酵菌種，一次發(fā)酵米基添加量為10%（m/m），接入1% （m/m）酵母菌，30 ℃發(fā)酵20 h；二次發(fā)酵米基添加量為12.5%（m/m），接入6%（m/m）一次發(fā)酵酵母混合物，2%尿素添加量，30 ℃發(fā)酵48 h。發(fā)酵過程中應(yīng)注意衛(wèi)生問題，并隨時排查雜菌污染。

發(fā)酵過程中最關(guān)鍵的就是發(fā)酵菌種的選擇，優(yōu)良的菌種能保證發(fā)酵飼料產(chǎn)品的質(zhì)量， 且最大量地提高飼料中的菌體蛋白。 發(fā)酵菌種應(yīng)該具有以下特性：（1）有較強的環(huán)境適應(yīng)性，能在以原料為培養(yǎng)基的環(huán)境中正常生長；（2）繁殖速度快，產(chǎn)蛋白效率高；（3）自身及代謝產(chǎn)物無毒無致病性。 其次，在生產(chǎn)中接種量也很關(guān)鍵，接種量過小，發(fā)酵菌種發(fā)育緩慢，接種量過大，易導(dǎo)致發(fā)酵菌種生長過快，營養(yǎng)物質(zhì)過快消耗，影響菌種正常發(fā)育。 因此確定最佳的接種量是發(fā)酵試驗成功的重要一步。

有報道稱，將發(fā)酵后的米基飼料添加到日糧中，可一定程度地提高蛋雞日糧營養(yǎng)物質(zhì)含量，滿足蛋雞每日所需的營養(yǎng)物質(zhì) （李勁松等，2018；吳良柱等，2009）。 本試驗通過對廢棄米基進行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)廢棄米基中的粗蛋白質(zhì)、無機物Ca、P 等營養(yǎng)物質(zhì)的含量均有所提高， 且保留了蛹蟲草廢棄米基中特有的蟲草素， 發(fā)酵產(chǎn)物顏色棕黃色，具有酒香味，氣味和色澤均較發(fā)酵前有所改善。 蛹蟲草廢棄米基作為目前一種產(chǎn)量大，利用率低的生物資源，如果能夠?qū)ζ渖钊胙芯?，對于開發(fā)天然、綠色、抗病的新型飼料，減少抗生素的濫用（邵建忠等，2017）及環(huán)境污染等，具有重要意義。