賀 瑩， 馮彩平

（呂梁學(xué)院生命科學(xué)系，山西呂梁 033000）

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）是一種中草藥植物，屬被子植物門，其根莖直立呈圓柱形，不分枝具有多節(jié)；花期是3 ～7 月，有很高的觀賞價(jià)值，適宜在涼爽、相對濕潤、空氣流通的環(huán)境下生長。 近年來有關(guān)鐵皮石斛的研究已成為生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)， 國內(nèi)外學(xué)者從各石斛植物中分離鑒定出約100 種化合物（鄭成江等，2010）。我國主要研究的是鐵皮石斛的成分與功能（蔡鵑等，2014）。目前， 獸藥正朝著無農(nóng)藥殘留、 療效高等方向努力， 中草藥作為飼料添加劑具有增強(qiáng)動(dòng)物體質(zhì)和抗應(yīng)激能力、 改善動(dòng)物肌肉等功效 （閆如霞等，2021；肖琎等，2016），而且還具有無藥物殘留、無污染等優(yōu)點(diǎn)（曹日亮等，2020；玄家潔，2018）。

本試驗(yàn)通過參考國內(nèi)外鐵皮石斛提取物及復(fù)方飼料添加劑制備工藝的研究， 以鐵皮石斛為原料，采用恒溫水浴提取法、離心分離、濃縮、干燥、壓片等方法制作復(fù)方飼料添加劑。 通過單因素試驗(yàn)先確定響應(yīng)面的因素和水平， 經(jīng)過響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)， 確定鐵皮石斛提取物復(fù)方飼料添加劑的最佳配方，并對其質(zhì)量進(jìn)行驗(yàn)證，以期為鐵皮石斛復(fù)方飼料添加劑在動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)推廣提供一定的幫助（Kuorwel 等，2011；劉洪明，2009）。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 鐵皮石斛條， 產(chǎn)自安徽省霍山縣；檸檬酸，碳酸氫鈉；氫甜菊糖、乳糖、聚乙二醇6000、PVP K30（食品級），河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備 MiniiG2500 微孔板離心機(jī)，長沙綜儀生物科技有限公司; LED 小型中藥打粉機(jī)， 湖南省長沙市常宏制藥機(jī)械設(shè)備廠；HPX－9052MBE 電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HC-100 電子天平，溫州科爾特計(jì)量檢測儀器有限公司；PHS－3E pH 計(jì)， 上海精密化學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 鐵皮石斛提取物粉末制備工藝流程 新鮮鐵皮石斛條→清洗→干燥→粉碎→過篩→恒溫水浴浸提→過濾→提取液（濾渣重復(fù)提取2 次）→合并3 次提取所得濾液→濃縮→沉淀→離心→沉淀干燥→粉碎→過篩→提取物粉末（張?jiān)姾剑?018；陳曉梅等，2013）。

操作要點(diǎn)：新鮮鐵皮石斛條洗凈，于87 ℃烘干至恒重，粉碎后過80 目篩，得鐵皮石斛粗粉，稱取適量鐵皮石斛提取物粗粉，按照1:20 的料液比加入蒸餾水，于70 ℃水浴加熱、攪拌、浸提2 h，過濾， 濾渣同法提取2 次， 合并3 次提取所得濾液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀75 ℃濃縮后，加入95%乙醇，先沉淀，后離心10 min，然后放入干燥箱50 ℃烘干，再粉碎過80 目篩，即得鐵皮石斛提取物粉末。

1.3.2 復(fù)方飼料添加劑制備工藝流程 收集鐵皮石斛提取物→加入酸源、崩解劑、填充劑、黏合劑、甜味劑等混合均勻→壓片；收集鐵皮石斛原料粉→加入堿源、崩解劑、填充劑、黏合劑、甜味劑等混合均勻→壓片，再將兩?；靿海ㄋ挝幕莸?，2020）。

操作要點(diǎn)：稱取鐵皮石斛提取物粉末、檸檬酸及其他輔料均勻混合，于干燥箱50 ℃烘干，制粒。稱取鐵皮石斛提取物、 碳酸氫鈉及其他輔料均勻混合（鐵皮石斛提取物添加量定為10%，酸堿配比定為1:0.8，泡騰崩解劑添加量定為50%，甜菊糖定為2%，PEG 6000 定為5%）， 加適量黏合劑（5% PVP K30）制軟材后制粒，放入干燥箱50 ℃烘干， 將兩片混壓制作3.9 g 的鐵皮石斛提取物復(fù)方飼料添加劑（黃華娟等，2021）。

1.3.3 鐵皮石斛提取物復(fù)方飼料添加劑配方優(yōu)化單因素試驗(yàn) 選擇添加鐵皮石斛提取物添加量（2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%）， 添加酸堿配比質(zhì)量（1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.1、1:1.2），崩解劑添加量（30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%）， 甜味劑添加量 （1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3%、3.5%、4%），其他配方按1.3.2 執(zhí)行，進(jìn)行單因素試驗(yàn)， 用綜合評價(jià)作為標(biāo)準(zhǔn)來確定復(fù)方飼料添加劑中各單因素的添加量（王夢嬌等，2020）。

1.3.4 響應(yīng)面法配方優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素的基礎(chǔ)上， 用響應(yīng)面法對鐵皮石斛復(fù)方飼料添加劑制備配方優(yōu)化，選擇鐵皮石斛提取物添加量（A），酸堿配比（B），泡騰崩解劑添加量（C）和甜菊糖添加量（D）四個(gè)因素，以（Y）綜合評分為因變量，設(shè)計(jì)4 因素3 水平的Box-Benhnken 組合試驗(yàn) （王苗苗等，2019；余彥國等，2018），響應(yīng)面法試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面法試驗(yàn)因素及水平

1.3.5 綜合評價(jià) 依據(jù)表2 的評分標(biāo)準(zhǔn)， 分別對鐵皮石斛復(fù)方飼料添加劑外觀色澤、 口感和湯色3 個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合評分。

表2 鐵皮石斛提取物復(fù)方飼料添加劑綜合品質(zhì)（感觀評分）的評分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.6 鐵皮石斛復(fù)方飼料添加劑的質(zhì)量檢測 外觀狀態(tài)：復(fù)方飼料添加劑表面光滑，具有石斛葉特有的顏色，溶于水后顏色較鮮亮。 pH：準(zhǔn)確稱取一片復(fù)方飼料添加劑，放入100 mL 蒸餾水中使其崩解，待崩解完全，氣泡不再冒出后，用pH 廣泛試紙測定其pH（王文寶等，2020；鄭丹丹等，2016）。多糖含量：按《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)2017 年版（中藥卷）鐵皮石斛“含量測定”項(xiàng)下》規(guī)定執(zhí)行（陳靜慧等，2019；王濤等，2011）。砷：按GB/T 13079 飼料中砷的測定方法。 鉛：按GB/T 13080 飼料中鉛的測定方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理 利用Origin 繪圖軟件繪制單因素的數(shù)據(jù)趨勢圖，通過Design-Expert 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析（林雪媛等，2019）。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛提取物復(fù)方飼料添加劑配方優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 鐵皮石斛提取物添加量的確定 由圖1知，鐵皮石斛提取物添加量越高，復(fù)方飼料添加劑顏色越均勻， 有較濃的石斛香氣， 溶解后口感越好， 但加入過多口感會(huì)變得苦澀。 當(dāng)配方中鐵皮石斛提取物添加量為8% ～12%時(shí)，顏色均勻，溶解后顏色均較鮮亮，均帶有純正的石斛風(fēng)味，口感適中。故選擇鐵皮石斛提取物添加量為8%、10%、12%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 鐵皮石斛提取物添加量對復(fù)方飼料添加劑綜合品質(zhì)的影響

2.1.2 酸堿比例（檸檬酸與碳酸氫鈉）的確定 由圖2 和圖3 得出，隨著碳酸氫鈉添加量的增加，復(fù)方飼料添加劑溶解時(shí)崩解時(shí)間會(huì)越來越長，pH 也快速增大， 但過高的碳酸氫鈉用量會(huì)導(dǎo)致口感不佳。 所以當(dāng)檸檬酸與碳酸氫鈉質(zhì)量比為1:0.8 時(shí)，崩解時(shí)間較短，pH 顯酸性，酸甜口感較好，所以確定檸檬酸與碳酸氫鈉比為1:0.8、1:0.9、1:1 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 酸堿比對復(fù)方飼料添加劑溶解后崩解時(shí)限的影響

圖3 酸堿比對復(fù)方飼料添加劑溶解后pH 的影響

2.1.3 泡騰崩解劑添加量的確定 由圖4 和圖5可得， 復(fù)方飼料添加劑的崩解時(shí)間隨泡騰崩解劑添加量的增加而逐漸縮短。 當(dāng)泡騰崩解劑添加量為45% ～60%時(shí)， 復(fù)方飼料添加劑崩解時(shí)間較短，故選擇泡騰崩解劑添加量45%、50%和55%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。 泡騰崩解劑添加量對pH 的影響不明顯，pH 均在5.1 ～5.6。

圖4 泡騰崩解劑添加量對復(fù)方飼料添加劑溶解后崩解時(shí)限的影響

圖5 泡騰崩解劑添加量對復(fù)方飼料添加劑溶解后pH 的影響

2.1.4 甜味劑（甜菊糖）添加量的確定 由圖6 得出，隨著甜菊糖添加量的增加，復(fù)方飼料添加劑的甜味會(huì)變得更濃郁，但加入超過3%的甜菊糖，復(fù)方飼料添加劑呈現(xiàn)單一的味道， 甜味會(huì)變得較淡直至消失，因此選擇含量為2.0%、2.5%、3.0%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖6 甜味劑（甜菊糖）添加量對復(fù)方飼料添加劑綜合評價(jià)的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面法試驗(yàn)組合及評分

2.2.2 回歸模型的建立 用Design Expert 軟件對響應(yīng)面結(jié)果多元回歸分析， 得到鐵皮石斛提取物復(fù)方飼料添加劑的綜合評分（Y）與各因素的二次回歸模型為：Y ＝94.80+2.58A+3.75B-5.58C+3.25D -0.25AB -1AC -2AD +1.75BC -2.75BD +2.50CD-8.57A2-4.32B2-5.07C2-5.07D2。

上式中， 各項(xiàng)系數(shù)絕對值的大小表示各因素對鐵皮石斛提取物復(fù)方飼料添加劑綜合評分的影響程度，系數(shù)的正負(fù)表示該影響因素的方向。

從表4 中回歸模型方差分析可知， 模型的P＝0.0001＜0.01，說明模型有高度顯著性，鐵皮石斛復(fù)方飼料添加劑的綜合質(zhì)量在不同因素下存在顯著性差異；失擬度P＝0.0701＞0.05，說明擬合程度在選定的因素水平范圍內(nèi)。 該模型可用于分析和預(yù)測試驗(yàn)結(jié)果；A、B、D、C 的影響極顯著（P＜0.01）。

表4 二次回歸模型方差分析

2.3 響應(yīng)曲面分析 曲面的傾斜程度可反映各種因素對鐵皮石斛提取物復(fù)方飼料添加劑綜合品質(zhì)的影響。 等高線圖的形狀可以表示各因素之間的交互作用是否顯著， 橢圓狀表明因素的交互作用顯著，圓形狀表示交互作用不顯著，結(jié)合二次回歸模型方差分析，從圖7、圖8 可以看出，鐵皮石斛提取物量添加量和酸堿比例、 鐵皮石斛提取物添加量和甜菊糖添加量交互作用不顯著；從圖9、圖10 可以看出鐵皮石斛提取物添加量與鐵菊糖添加量、 酸堿配比與泡騰崩解劑添加量交互作用顯著； 從圖11、 圖12 可以看出酸堿配比與甜菊糖添加量、 泡騰崩解劑添加量與甜菊糖添加量交互作用極顯著。

圖7 鐵皮石斛提取物添加量與酸堿配比交互作用的等高線與曲面

圖8 鐵皮石斛提取物添加量與泡騰崩解劑添加量交互作用的等高線與曲面

圖9 鐵皮石斛提取物添加量與甜菊糖添加量交互作用的等高線與曲面

圖10 酸堿配比與泡騰崩解劑添加量交互作用的等高線與曲面

圖11 酸堿配比與甜菊糖添加量交互作用的等高線與曲面

圖12 泡騰崩解劑添加量與甜菊糖添加量交互作用的等高線與曲面

2.4 最佳配方驗(yàn)證 通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化后，得出鐵皮石斛提取物復(fù)方飼料添加劑的最佳配方為：鐵皮石斛提取物添加量10%，酸堿比1:0.8，泡騰崩解劑添加量45%，甜菊糖添加量2.5%；預(yù)測值的綜合評分96 分，在此條件下重復(fù)3 次，復(fù)方飼料添加劑的綜合評分為95.6 分，與預(yù)測值無顯著性差異， 說明通過響應(yīng)面優(yōu)化的回歸方程模型及最佳制備工藝可靠。

2.5 復(fù)方飼料添加劑質(zhì)量檢測結(jié)果 將按照最佳制備工藝制得的鐵皮石斛復(fù)方飼料添加劑，根據(jù)1.3.6 各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量檢測。 可以得出，在最佳制備工藝條件下制得的復(fù)方飼料添加劑表面光滑，外形整齊，pH 為4.6，多糖含量為36.4%，砷含量為≤10.0 mg/kg，鉛含量為≤40.0 mg/kg。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以鐵皮石斛為原料， 首先采用恒溫水浴提取法提取鐵皮石斛活性物質(zhì)， 利用單因素試驗(yàn)， 得到了各因素對鐵皮石斛復(fù)方飼料添加劑綜合品質(zhì)影響趨勢圖， 在此基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立回歸模型，并驗(yàn)證了模型的合理性和可靠性，得到最佳制備工藝：鐵皮石斛提取物添加量10%，酸堿比1:0.8，泡騰崩解劑添加量45%，甜菊糖添加量2.5%，經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)復(fù)方飼料添加劑的綜合評分為95.6 分， 與預(yù)測值無顯著性差異，可為鐵皮石斛復(fù)方飼料添加劑的發(fā)展和應(yīng)用提供一定的幫助。