曲欣怡，丁夢(mèng)平，隋欣宇，高姝娟，金畢回，靳寧梅，周 燕，鄭琳琳，丁 哲

(遼東學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，遼寧 丹東 118001)

稀土元素雖非生物的必需元素，卻能被生物吸收[1]。稀土元素鑭會(huì)經(jīng)消化道、呼吸道以及皮膚進(jìn)入機(jī)體，還可以經(jīng)過胎盤或者哺乳進(jìn)入胎兒和嬰兒的體內(nèi)。流行病學(xué)研究表明，居住在稀土礦區(qū)兒童的智商的平均數(shù)、學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知能力指標(biāo)均比對(duì)照區(qū)兒童明顯降低[2]。腦組織是鑭在機(jī)體內(nèi)蓄積的主要靶器官，血液循環(huán)中的鑭蓄積在大腦皮質(zhì)、海馬和小腦等組織，影響中樞神經(jīng)遞質(zhì)的含量，引起神經(jīng)細(xì)胞死亡[3]。近年來發(fā)現(xiàn)了一種新的細(xì)胞死亡方式，即程序性壞死，它是由信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞死亡，兼具壞死和凋亡的特點(diǎn)[4]。程序性壞死在炎癥、氧化應(yīng)激、腫瘤增殖等疾病生理發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5]。氧化應(yīng)激可導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生一系列病理性損傷，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡和壞死[6]。有研究顯示，稀土元素所致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷可能與氧化應(yīng)激有關(guān)[7]。在此基礎(chǔ)上，本研究通過觀察鑭暴露對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育期仔鼠海馬皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞和學(xué)習(xí)記憶能力的影響，探討鑭誘發(fā)程序性壞死與神經(jīng)細(xì)胞損傷的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

Wistar 雌性大鼠 32 只，與雄性大鼠以 1∶1 配對(duì)的方式進(jìn)行交配，次日晨檢查雌鼠陰道發(fā)現(xiàn)陰栓，記為妊娠第0 d 。將孕鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(飲用蒸餾水)、低劑量組(飲用0.125 g/L的LaCl3水溶液)、中劑量組(飲用0.250 g/L的LaCl3水溶液)、高劑量組(飲用0.500 g/L的LaCl3水溶液)共4組，每組 8 只。孕鼠通過自由飲水的方式進(jìn)行染鑭，仔鼠在斷乳前通過母體的血液循環(huán)和母乳吸吮染鑭，斷乳后則通過自由飲水吸收不同濃度的氯化鑭，至斷乳后49 d結(jié)束。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中記錄孕鼠及仔鼠體質(zhì)量。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

LaCl3(分析純)；Rat MDA ELISA KIT和Rat ROS ELISA KIT試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；BCA蛋白定量測(cè)定試劑盒(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 仔鼠發(fā)育情況測(cè)定

自仔鼠出生起，分別于第14、28、42 d測(cè)定其體質(zhì)量，并在其出生第49 d稱取體質(zhì)量后進(jìn)行麻醉殺死并即刻斷頭取出腦組織，稱取腦組織的質(zhì)量，然后再分離出腦皮質(zhì)組織并稱取質(zhì)量。腦組織系數(shù)和皮質(zhì)組織系數(shù)的計(jì)算公式為：腦組織系數(shù)=腦組織質(zhì)量/體質(zhì)量×100%、皮質(zhì)組織系數(shù)=皮質(zhì)組織質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

1.3.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

Morris水迷宮系統(tǒng)由4個(gè)部分構(gòu)成，包括圓形的水池、內(nèi)部的平臺(tái)、攝像系統(tǒng)以及動(dòng)物行為軌跡分析系統(tǒng)。水池直徑為150 cm，高為60 cm，水溫為(22±2)°C，水深為30 cm，提前加入可食用的黑色素做染料，使水呈不透明狀態(tài)。由電腦隨機(jī)將圓形的水池劃分為4個(gè)象限，在第四象限固定位置上放置一個(gè)直徑為15 cm的圓形隱藏站臺(tái)，站臺(tái)放置在水面下2.0 cm處。將出生后49 d的仔鼠按雌雄1∶1的比例分別放在4個(gè)象限上進(jìn)行訓(xùn)練。如果仔鼠在60 s內(nèi)能夠找到站臺(tái)，就允許其在站臺(tái)上停留大約15 s；否則就引導(dǎo)其到達(dá)站臺(tái)并在站臺(tái)上停留15 s。連續(xù)訓(xùn)練5 d，記錄仔鼠從入水到到達(dá)站臺(tái)所需的時(shí)間，即仔鼠的逃避潛伏期。1 w后，把接受訓(xùn)練的仔鼠再次放置在水迷宮內(nèi)進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)：撤去平臺(tái)，將仔鼠在第二象限同一位置放入，讓其在水池中自由游泳，記錄仔鼠在60 s內(nèi)到各象限的時(shí)間及穿越站臺(tái)原先位置的次數(shù)[4]。

1.3.3 蘇木精-伊紅染色法(HE染色)

取不同劑量仔鼠腦組織蠟塊進(jìn)行切片，將組織薄片轉(zhuǎn)移到載玻片上，烤干至表面無蠟后，脫蠟水化，然后脫水、透明，取出切片，用吸水紙擦干周圍液體，滴加中性樹膠，蓋蓋玻片，室溫晾干。

1.3.4 活性氧簇(ROS)與丙二醛(MDA)含量的測(cè)定

取出冷凍的皮質(zhì)組織按照說明書要求研磨成組織勻漿，放入離心機(jī)中離心后取上清液，BCA法測(cè)蛋白濃度，按比例稀釋后，分別按MDA和ROS試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同劑量染鑭對(duì)仔鼠體質(zhì)量的影響

不同劑量染鑭仔鼠出生后體質(zhì)量均不斷增加，尤其是對(duì)照組增加最快。14 d后不同劑量組仔鼠體質(zhì)量基本相同，在32.67～34.40 g，各劑量組之間無差異 (F=0.366，P=0.778)；28 d后各劑量組仔鼠體質(zhì)量差異不大(F=0.586，P=0.629)，在71.33～74.20 g；42 d后各劑量組仔鼠體質(zhì)量出現(xiàn)差異性，中劑量、高劑量染鑭組與對(duì)照組、低劑量組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，低劑量組與對(duì)照組比較的差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見圖1。

2.2 不同濃度LaCl3對(duì)仔鼠組織發(fā)育的影響

隨著LaCl3濃度的增加，各染鑭組仔鼠49 d的體質(zhì)量、全腦質(zhì)量、皮質(zhì)質(zhì)量均逐漸下降。中劑量組和高劑量組仔鼠體質(zhì)量均低于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中劑量組和高劑量組全腦質(zhì)量均低于對(duì)照組，低劑量組高于高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；低劑量組、中劑量組和高劑量組皮質(zhì)質(zhì)量均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。腦組織系數(shù)和皮質(zhì)組織系數(shù)均逐漸升高。低劑量組、中劑量組和高劑量組腦組織系數(shù)均高于對(duì)照組，中劑量組和高劑量組均高于低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；低劑量組、中劑量組和高劑量組皮質(zhì)系數(shù)均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

表1 建模49 d仔鼠體質(zhì)量及各部分組織質(zhì)量

2.3 不同濃度LaCl3對(duì)仔鼠空間記憶能力的影響

在Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組仔鼠相比，各染鑭組仔鼠進(jìn)入目標(biāo)象限的次數(shù)和穿越隱藏站臺(tái)的次數(shù)較對(duì)照組顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在目標(biāo)象限持續(xù)時(shí)間亦呈下降趨勢(shì)，中劑量組、高劑量組與對(duì)照組、低劑量組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

表2 LaCl3染毒仔鼠水迷宮空間探索數(shù)據(jù)

進(jìn)一步觀察仔鼠尋找原隱藏站臺(tái)位置的路徑發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組尋找能力較強(qiáng)，穿越原隱藏站臺(tái)位置的次數(shù)最多，而隨著LaCl3濃度的增加，染鑭組仔鼠尋找原隱藏站臺(tái)位置的能力逐漸減弱，變得毫無頭緒，穿越原隱藏站臺(tái)位置的次數(shù)愈來愈少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖2)。

2.4 仔鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞HE染色結(jié)果

對(duì)照組中，皮質(zhì)組織結(jié)構(gòu)完整清晰，神經(jīng)細(xì)胞的排列既密集又有序，層次非常分明；神經(jīng)元細(xì)胞的胞漿豐富且胞核居中。隨著染鑭劑量的增加，腦皮質(zhì)的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量遞減，細(xì)胞間隙增寬，大量細(xì)胞丟失且排列稀疏、不規(guī)則。高劑量組可明顯見胞漿濃縮紅染，胞核皺縮或溶解，邊界模糊(見圖3)。

2.5 仔鼠皮質(zhì)組織中丙三醛(MDA)和活性氧簇(ROS)含量

各染鑭組與對(duì)照組比較，皮質(zhì)組織神經(jīng)細(xì)胞MDA含量逐漸增加，高劑量組仔鼠的腦皮質(zhì)中神經(jīng)細(xì)胞的MDA含量明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖4)。

LaCl3染毒使仔鼠皮質(zhì)組織神經(jīng)細(xì)胞ROS表達(dá)增加。各劑量組與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量組與各組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖5)。

3 討論

稀土元素包括元素周期表第Ш類副族元素鑭系元素、釔和鈧共17種[8]。在多數(shù)食品和自然界中含量最多的稀土元素是鑭。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，鑭具有較強(qiáng)的蓄積性，研究人員常選用鑭作為研究稀土元素神經(jīng)毒性作用及其機(jī)制的物質(zhì)。團(tuán)隊(duì)在前期的實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)，稀土元素鑭可以在大鼠大腦皮質(zhì)、小腦組織以及海馬組織中蓄積，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力受損[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，鑭對(duì)生后14和28 d仔鼠的體質(zhì)量影響較小，42 d染鑭組仔鼠的體質(zhì)量呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，且隨著鑭暴露劑量增加，仔鼠體質(zhì)量增加呈下降趨勢(shì)，表明鑭暴露影響了仔鼠生長(zhǎng)發(fā)育，仔鼠全腦質(zhì)量及皮質(zhì)質(zhì)量隨染鑭劑量的增加而降低。全腦系數(shù)和皮質(zhì)系數(shù)逐漸增高，說明仔鼠的大腦皮質(zhì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育受到影響。HE染色顯示，染鑭后仔鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯少于對(duì)照組，細(xì)胞排列較稀疏，分布不規(guī)則，表明海馬神經(jīng)皮質(zhì)組織細(xì)胞已受損。

Morris 水迷宮是檢測(cè)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的經(jīng)典方法[10]。在水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)中，隨染鑭劑量的增加，仔鼠進(jìn)入目標(biāo)象限的次數(shù)及在目標(biāo)象限持續(xù)的時(shí)間均減少，仔鼠尋找原隱藏站臺(tái)的能力減弱，說明鑭暴露損傷了仔鼠神經(jīng)系統(tǒng)致使其學(xué)習(xí)記憶能力下降。

ROS是機(jī)體在缺氧狀態(tài)下大量合成的一種產(chǎn)物，過量的ROS與線粒體膜可相互作用，導(dǎo)致膜的通透性變化，從而誘發(fā)細(xì)胞的程序性死亡[11]。長(zhǎng)期以來，ROS被公認(rèn)為以壞死驅(qū)動(dòng)力參與到了細(xì)胞凋亡過程，有研究表明，ROS含量與神經(jīng)細(xì)胞的損傷程度為明顯正相關(guān)關(guān)系[12-13]。另外，MDA是一種脂質(zhì)過氧化物，是在機(jī)體中由多種不飽和脂肪酸在氧自由基的作用下發(fā)生脂質(zhì)過氧化作用而形成的，此過程可引起明顯的細(xì)胞損傷，因此組織中MDA含量的高低可作為組織細(xì)胞損傷程度的反映[14-15]。李夢(mèng)倩等[16]指出，細(xì)胞程序性壞死后可釋放大量ROS，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA水平升高，由此可見，ROS與MDA含量的增加可反映神經(jīng)細(xì)胞程序性壞死程度加重。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著鑭暴露劑量的增加，仔鼠海馬皮質(zhì)組織中ROS與MDA的含量較對(duì)照組明顯增加，鑭暴露會(huì)損傷仔鼠神經(jīng)細(xì)胞，從而誘導(dǎo)其發(fā)生程序性壞死，具有一定的劑量-反映關(guān)系。

綜上所述，鑭暴露影響仔鼠神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)和發(fā)育，隨著染鑭劑量的增加，仔鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)減緩、腦質(zhì)量和皮質(zhì)質(zhì)量減輕、皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞減少，ROS和MDA的含量增加，空間學(xué)習(xí)記憶能力下降，提示鑭暴露導(dǎo)致仔鼠海馬皮質(zhì)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，進(jìn)而誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生程序性壞死，影響其正常生長(zhǎng)發(fā)育和學(xué)習(xí)記憶，其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究證明。