齊 宇, 李紅俠, 馬騁晨, 吳善潘, 劉 宇

(宿州學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 宿州 234000)

谷氨酸(glutamic acid，Glu)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)信號傳遞的主要遞質(zhì)之一，對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)定具有重要作用[1]，但當(dāng)其濃度過高時(shí)會引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物，導(dǎo)致線粒體功能受損，進(jìn)而產(chǎn)生更多的氧自由基，加重細(xì)胞損傷、衰老和死亡。近年來研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血[2-3]、肌萎縮側(cè)索硬化[4]、帕金森病[5]、阿爾茨海默病[6]等神經(jīng)性疾病均是由谷氨酸釋放量過高引起的，腦組織中的神經(jīng)細(xì)胞損傷是以程序性死亡形式進(jìn)行的[7-10]。

香豆素又名1,2-苯并吡喃酮[11]，在植物界中廣泛存在，提取簡單，且熒光量子產(chǎn)率高[12]，香豆素及其衍生物是中藥成分中必不可少的[13-14]。研究表明，香豆素衍生物(CD)具有提高免疫力、抗炎、抗菌、抗癌、抗阿爾茨海默病、抗帕金森病等多種生理活性。近年來關(guān)于香豆素的結(jié)構(gòu)修飾備受研究者們關(guān)注，而哌嗪是含氮雜環(huán)堿性官能團(tuán)，可增加藥物的水溶性、堿性、穩(wěn)定性等，能夠提高藥物的生物學(xué)性質(zhì)[15]。天麻素(Gastrodin)也稱天麻苷，是中藥塊莖天麻中皂苷類的主要化學(xué)成分[16]，在天麻的活性成分中含量最高，具有抗驚厥、鎮(zhèn)痛、抗中樞神經(jīng)系統(tǒng)衰老、抗炎、增加腦血流量[17-19]等作用，臨床上多用于治療神經(jīng)退行性疾病、頭暈等[20-21]。有研究證實(shí)，天麻素還可以抗氧化、抗自由基以及保護(hù)細(xì)胞膜、抗凋亡、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)，對神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用[22]。天麻素還能對神經(jīng)毒性損害起修復(fù)作用[23]。

PC12細(xì)胞具有交感神經(jīng)元特性，來源于鼠腎上腺髓質(zhì)的嗜鉻瘤，廣泛用于神經(jīng)細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)以谷氨酸誘導(dǎo)PC12細(xì)胞建立模型，通過加入CD和天麻素，研究二者協(xié)同作用對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，為腦部重大疾病的治療提供借鑒依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、試劑與材料

掃描酶標(biāo)儀：Sunrise，奧地利TECAN；流式細(xì)胞儀：C6，美國BD；CO2培養(yǎng)箱：Heracel，美國Kendro；倒置熒光顯微鏡：CX-40，日本OLYMPUS。

DMEM培養(yǎng)基：南京化學(xué)試劑有限公司；新生牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司；胰蛋白酶、谷氨酸和MTT：Sigma公司；雙抗：南京化學(xué)試劑有限公司；香豆素衍生物(CD)：宿州學(xué)院化學(xué)實(shí)驗(yàn)室；谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶和丙二醛檢測試劑盒：南京建成生物公司；PC12細(xì)胞株：中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞存活率測定

將對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞，按每孔1×105個(gè) 細(xì)胞培養(yǎng)于 96 孔板中，每孔加入100 μL，待細(xì)胞貼壁后，分別加入0.0、2.5、5.0、10.0、25.0 μmol/L的天麻素或0.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μmol/L的CD。細(xì)胞存活率測定步驟如下：加藥完成后繼續(xù)培養(yǎng)(培養(yǎng)箱溫度為37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%)24 h后每孔加5 mg/mL的MTT 15 μL，4 h后將每孔的液體完全吸走，再加入150 μL的二甲亞砜，于水平搖床震蕩8～10 min，用酶標(biāo)儀檢測 490 nm 處的吸光度值，細(xì)胞存活率=用藥后490 nm處吸光值/用藥前490 nm處吸光值×100%。該過程可篩選出藥物的最佳濃度。

后續(xù)實(shí)驗(yàn)分為對照組、模型組、天麻素組和聯(lián)合組進(jìn)行。將對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞，按每孔1×105個(gè) 細(xì)胞培養(yǎng)于 96 孔板中，每孔加入100 μL，待細(xì)胞貼壁后，對照組加入100 μL的完全培養(yǎng)基；模型組加入100 μL含谷氨酸的完全培養(yǎng)基；天麻素組為最佳濃度天麻素加入1 h后，再加入谷氨酸；聯(lián)合組為先加入最佳濃度天麻素和CD 1 h后，再分別加入谷氨酸。所有谷氨酸濃度均為15.0 mmol/L[24]。細(xì)胞存活率測定步驟同上：細(xì)胞存活率=用藥組或模型組490 nm處吸光值/對照組490 nm處吸光值×100%。該過程可篩選出CD的最佳配伍濃度。

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 相關(guān)指標(biāo)的測定

取對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞鋪于6孔板中，細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，于溫度為37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)定的方案(對照組、模型組、天麻素組、CD組、聯(lián)合組)加藥，24 h后終止培養(yǎng)，測定SOD(超氧化物歧化酶)、MDA(丙二醛)、GSH-PX(谷胱甘肽過氧化物酶)的活性(按照SOD、MDA、GSH-PX試劑盒的說明書進(jìn)行操作)，在532 nm下測定其吸光度值，根據(jù)說明書的公式計(jì)算。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測

將對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞接種于6孔板(2×108個(gè)/L)，實(shí)驗(yàn)分組同1.2.2，加藥培養(yǎng)24 h，對照組加相同量的細(xì)胞培養(yǎng)基。培養(yǎng)結(jié)束后將細(xì)胞收集，PBS(冷的)漂洗2次，懸浮于200 μL Binding Buffer，再加入5 μL Annexin V-FITC/PI和5 μL PI輕振混勻，10 min后，再加入Binding Buffer 300 μL室溫避光反應(yīng)5 min，上機(jī)檢測。用Flowjo 7.6.1(FACSCA2BUR, Becton Dickinson, USA)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并出圖。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥物對細(xì)胞存活率的影響

PC12細(xì)胞經(jīng)不同濃度0.0、2.5、5.0、10.0、25.0 μmol/L的天麻素處理后存活率分別為(95.42±1.23)%、(98.78±0.98)%、(93.75±0.74)%、(81.25±0.85)%和(73.75±0.87)%，因此，天麻素的最佳濃度為2.5 μmol/L(此濃度下細(xì)胞存活率最高)；細(xì)胞經(jīng)藥物CD(0.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μmol/L)處理后的存活率分別為(95.42±1.23)%、(73.56±0.56)%、(85.24±0.38)%、(80.43±0.93)%和(71.79±1.29)%，因此，選擇濃度為5.0、10.0和20.0 μmol/L的CD分別與天麻素(2.5 μmol/L)聯(lián)合應(yīng)用于谷氨酸處理的PC12細(xì)胞上。結(jié)果見表1。

由表1可知，經(jīng)過15.0 mmol/L的谷氨酸處理24 h后的模型組細(xì)胞存活率為(60.26±1.97)%，比對照組低35.16%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；經(jīng)天麻素(2.5 μmol/L)干預(yù)，再經(jīng)谷氨酸處理的PC12細(xì)胞存活率明顯增高，為(87.38±0.14)%，而CD聯(lián)合天麻素(2.5 μmol/L)后細(xì)胞存活率更優(yōu)，其中CD配伍濃度為10 .0 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率最高，為(93.78±0.93)%。因此，與天麻素(2.5 μmol/L)配伍的最佳CD濃度為10.0 μmol/L。

表1 藥物對PC12細(xì)胞存活率的影響

2.2 藥物對SOD、GSH-Px和MDA的影響

由表2可知，模型組與對照組比較，SOD、GSH-Px和MDA含量均具有極顯著差異性。藥物處理組與模型組比較，其SOD、GSH-Px和MDA含量均有明顯變化。天麻素(2.5 μmol/L)與CD(10.0 μmol/L)組協(xié)同作用后，GSH-Px和SOD的活力均高于模型組，分別是模型組的2.16倍和1.67倍，且達(dá)到極顯著差異，也高于2種藥物單獨(dú)作用的結(jié)果。MDA的含量降低，低于模型組2.33倍，也達(dá)到了極顯著差異。說明二者的協(xié)同，保護(hù)了受損的細(xì)胞。

表2 藥物對GSH-Px、SOD和MDA的影響

2.3 藥物抑制谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡

使用AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)，24 h后檢測各組PC12細(xì)胞的凋亡變化。圖1是流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖，圖中左下方象限表示活細(xì)胞，即FITC-/PI-；右下方象限表示早期細(xì)胞凋亡，即FITC+/PI-；右上方象限表示晚期凋亡，即FITC+/PI+；左上方象限表示死亡細(xì)胞，即FITC-/PI+。

由圖1可以看出，對照組細(xì)胞早期凋亡率是3.06%，晚期凋亡率是2.50%，細(xì)胞凋亡率低，損傷少；模型組細(xì)胞的早期凋亡率是12.60%，晚期凋亡率是12.80%，與對照組比晚期凋亡率增多；天麻素(2.5 μmol/L)處理的細(xì)胞，早期凋亡率是8.41%，晚期凋亡率是10.80%，與模型組比較凋亡率明顯降低；CD(10.0 μmol/L)處理的細(xì)胞，早期凋亡率是7.88%，晚期凋亡率是9.95%，和天麻素的效果相近，凋亡的細(xì)胞也較模型組低。天麻素(2.5 μmol/L)和CD(10.0 μmol/L)協(xié)同作用時(shí)，早期凋亡率是8.08%、晚期凋亡率是6.01%，細(xì)胞凋亡率為14.09%，較模型組的25.40%降低了11.31%，早期凋亡的細(xì)胞與藥物單獨(dú)作用變化不明顯，但晚期凋亡明顯低于這兩種藥物單獨(dú)作用，說明二者協(xié)同作用對谷氨酸損傷的細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用。

3 討論

PC12細(xì)胞用于研究多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，像阿爾茨海默病、帕金森病等疾病。谷氨酸作為一種非必須氨基酸，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，對神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能活動起著重要的維持作用。已有研究證實(shí)，谷氨酸為腦內(nèi)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，如過度激活相應(yīng)受體會造成繼發(fā)性、氧化性神經(jīng)毒性，引起胞內(nèi)神經(jīng)毒性級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷、衰老和死亡[25]。氧化應(yīng)激在細(xì)胞功能調(diào)解中起著重要作用，多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制都與氧化應(yīng)激關(guān)系密切，氧化應(yīng)激的發(fā)生進(jìn)而能抑制細(xì)胞凋亡，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病防治中具有重要意義[26]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，15.0 mmol/L的谷氨酸處理的PC12細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率為(60.26±1.97)%，與對照組相比有顯著差異(P<0.01)，谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶活力明顯下降，丙二醛含量明顯上升，細(xì)胞的凋亡率明顯升高。

有研究表明，天麻素對H2O2損傷的PC12細(xì)胞具有顯著保護(hù)作用，天麻素預(yù)處理組能夠抑制谷氨酸誘導(dǎo)的凋亡，多種CD具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用[27-28]。本實(shí)驗(yàn)利用天麻素(2.5 μmol/L)+CD(10.0 μmol/L)培養(yǎng)PC12細(xì)胞24 h后，與模型組比較，細(xì)胞存活率增加25.47%，谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶等指標(biāo)也均增加，分別是模型組的2.16倍和1.67倍，且達(dá)到極顯著差異，高于2種藥物單獨(dú)作用；MDA的含量降低，低于模型組2.33倍，達(dá)到了極顯著差異；細(xì)胞凋亡率降低了11.31%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明二者的協(xié)同作用保護(hù)了受損的細(xì)胞。

綜上所述，天麻素和香豆素衍生物協(xié)同作用能夠保護(hù)谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與拮抗谷氨酸誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激有關(guān)。研究結(jié)果為天麻素、香豆素衍生物作為治療腦的神經(jīng)性疾病藥物提供了理論參考。