孫雪皎，陳 琳，陳 慧，黃 尤，劉瓊霞，寧 宇

(柳州市人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，廣西 柳州 545006)

磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)屬于胞內磷脂酰肌醇激酶之一，是生命活動中最為重要的信號通路之一，不僅與v．sre和v．ras等癌基因的產物相關，而且PI3K本身具有絲氨酸/蘇氨酸激酶的活性，故同樣具有磷脂酰肌醇激酶的活性[1]。PI3K分為3類，目前研究熱點主要是Ⅰ類，由一個調節(jié)亞基和一個催化亞基組成，對生物細胞的分裂，分化和凋亡等有著密切的聯系，并與癌細胞的生成和轉移有一定聯系[2]。LY294002是第一個人工合成的PI3Kα/δ/β的抑制劑，不僅能夠抑制自噬體的形成，而且還能夠使Akt/PKB失活，抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡[3-4]。慢性阻塞性肺疾病(COPD)是臨床常見的氣道不完全可逆性氣流受限性疾病，研究指出患此疾病的最主要危險因素之一便是吸煙，有毒顆?；驓怏w異常所引起的肺部炎性反應也是造成COPD漸進性發(fā)展的主要原因[4-5]。為進一步了解COPD的炎性機制，研究并為該疾病的防治工作提供新的思路，本文通過應用CSE刺激細胞以及PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002的干預，明確PI3K/Akt-FoxO1信號通路在煙草煙霧暴露下單核細胞細胞株炎性反應中的重要作用及機制。

1 資料與方法

1.1實驗材料：選擇由中國科學院細胞庫所提供的人單核淋巴瘤細胞U937細胞為研究對象。

1.2方法：U937細胞加入到5～10 ml 10%胎牛血清的無菌塑料培養(yǎng)瓶，并置于37℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的對數生長期細胞，離心后進行培養(yǎng)基重懸，稀釋至1.5×104個/ml，并接種于6孔板，每孔加入細胞懸液2 ml，并分為三組：對照組；煙草煙霧提取物(CSE)組；PI3K抑制劑組。應用Brdu法確定實驗中CSE的合適濃度，其中CSE的制備是將10支去濾嘴的香煙點燃后，用50 ml注射器對煙霧進行連續(xù)抽取，并輸入至10 ml PBS緩沖液中，密閉后搖晃瓶身即為CSE。PI3K抑制劑組的細胞給予LY294002預孵育2 h后給予CSE刺激過夜，之后給予TNF-α刺激過夜；CSE組不應用LY294002，其余同抑制劑組；對照組患者僅給予腫瘤壞死因子(TNF)-α。

1.3觀察指標：應用ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液中白細胞介素(IL)-8的水平，應用Western印跡檢測PI3K/Akt通路關鍵蛋白Akt、p-Akt蛋白以及FoxO1及p-FoxO1蛋白的表達。

2 結果

2.1三組IL-8水平檢測結果比較：CSE組IL-8水平為(2.24±0.56)mmol/L,明顯高于PI3K抑制劑組的(1.70±0.43)mmol/L及對照組的(1.97±0.50)mmol/L，組間和組內比較，差異具有統(tǒng)計學意義(F=3.072，P<0.05)。

2.2三組Akt、p-Akt蛋白以及FoxO1及p-FoxO1蛋白的表達水平比較:PI3K抑制劑組的p-Akt表達較CSE組減弱，但較對照組增強，p-FoxO1表達較CSE組增強，但較對照組減弱(P均<0.05)，Akt及FoxO1表達無明顯變化(P>0.05)。見表1。

表1 三組Akt、PAkt蛋白以及FoxO1及p-FoxO1蛋白的表達水平比較

3 討論

COPD已經成為全球性衛(wèi)生問題，也是導致我國居民肺部疾病死亡的主要病因之一，國內外相關研究均已證實煙草煙霧、空氣污染會導致肺組織內環(huán)境出現氧化應激，不僅造成氣道氧化損傷，使得氣道炎性反應加劇，而且還會因此引起氣道重塑、氣流受限，并因此影響肺功能的正常表達[6]。COPD患者的炎性因子是引起慢性炎性反應的主要因素，然而傳統(tǒng)糖皮質激素對COPD患者肺泡巨噬細胞的炎性因子抑制效果幾乎無效，即糖皮質激素抵抗作用，使得COPD患者的治療無法達到預期效果[7]，這在本研究中CSE組的IL-8水平明顯高于PI3K抑制劑組及對照組的結果中獲得了證實。因此尋求更為安全有效的信號傳導通路來進行炎性因子的抑制成為臨床研究的熱點。

LY294002 是一種廣譜 PI3K 抑制劑，抑制 PI3Kα,PI3Kδ 和 PI3Kβ ，也可抑制 CK2 的活性；同時是一種競爭性 DNA-PK 抑制劑，可逆結合 DNA-PK 的激酶結構域；而且是一種自噬和凋亡激活劑[8]。本研究通過對U937細胞進行CSE建模并選擇PI3K抑制劑LY294002，其中的AKT是PI3K的主要效應分子，在整個通路中負責信號傳導從而有效調控細胞的功能；而p-Akt是PI3K在活化狀態(tài)下產生3，4二磷酸磷脂酰肌醇和3，4，5三磷酸磷脂酰肌醇后，AKT與二磷酸磷脂酰肌醇反應達到部分激活并在三磷酸磷脂酰肌醇協(xié)助下最終達到AKT的完全活化狀態(tài)，從而有效完成由細胞膜-細胞膜的生物信號傳遞作用[9]。Forkhead轉錄因子FOXO1調節(jié)涉及多種細胞功能基因的表達，包括凋亡、DNA修復、細胞周期的停滯和葡萄糖代謝等，AKT磷酸化FOXO1，抑制其核轉位而阻止其轉錄激活作用[10]。本研究顯示PI3K抑制劑組的PAkt表達較CSE組減弱，但較對照組增強，p-FoxO1表達較CSE組增強，但較對照組減弱；分析原因在于CSE組因煙草煙霧環(huán)境導致細胞的PI3K高表達和AKT活性增加，也因此引起了p-Akt的高表達；但當抑制組和CSE組共同應用TNF-α后，由于LY294002的抑制效果能夠有效降低細胞的p-Akt表達水平，從而有效抑制IL-8水平；而對照組由于僅接受TNF-α刺激，缺乏煙草煙霧所形成的氧化應激環(huán)境所造成[11-12]。

綜上所述，PI3K抑制劑LY294002可明顯減弱通路關鍵蛋白p-Akt的表達，增強p-FoxO1的表達，進而明顯減弱煙草煙霧暴露下單核細胞的炎性反應。結果表明，PI3K/Akt信號通路活性及其下游FoxO1蛋白的表達與煙草煙霧暴露的單核細胞炎性反應表達有關，以此為切入點，將為今后COPD的炎性反應機制研究及防治工作提供新的思路。