范慧婕，賴逸貴，蔣雪峰，王強(qiáng)，李孔正，傅應(yīng)昌，張為

1.陽江市人民醫(yī)院，廣東 陽江 529500； 2.南方醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州 510515

《中國心血管病報(bào)告 2018》和《中國心血管健康與疾病報(bào)告2020概要》指出，我國心血管病死亡率位居首位，占全民死亡率40%以上，給我國經(jīng)濟(jì)帶來沉重負(fù)擔(dān)，防治心血管疾病刻不容緩[1-2]。動脈粥樣硬化(atherosclerotic，AS)是誘發(fā)心血管疾病的主要病理生理基礎(chǔ)，有效控制AS的發(fā)生發(fā)展是降低心血管意外發(fā)生的關(guān)鍵所在[3]。

AS是一種由于脂質(zhì)代謝紊亂和免疫失衡引起的慢性炎癥疾病。炎癥學(xué)說是AS最早的發(fā)病機(jī)制之一，在AS斑塊尚未形成的前期，炎癥狀態(tài)就已經(jīng)出現(xiàn)[4]。研究認(rèn)為，與AS發(fā)生發(fā)展關(guān)系較為密切的炎癥細(xì)胞是巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞受到不同刺激時(shí)可極化成不同的亞型，而不同的亞型發(fā)揮不同的生物學(xué)作用，介導(dǎo)AS的發(fā)展進(jìn)程[5]。巨噬細(xì)胞分為M1和M2兩種，其極化失衡可影響AS的發(fā)展進(jìn)程[6]。巨噬細(xì)胞具有可塑性，其極化指的是巨噬細(xì)胞在體內(nèi)外微環(huán)境影響下表現(xiàn)出的極端異質(zhì)性，M1 型巨噬細(xì)胞又稱為經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞，可由脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)及干擾素等炎癥因子刺激而成，主要有促炎作用；M2型巨噬細(xì)胞又稱為替代激活的巨噬細(xì)胞，可由白細(xì)胞介素-4(interleukin-4，IL-4)等細(xì)胞因子刺激而成，具有抗感染作用[7]。目前，巨噬細(xì)胞極化亦是防治AS藥物研究的側(cè)重點(diǎn)，調(diào)控巨噬細(xì)胞極化是防治AS的有效策略之一[8]。

橙皮苷又名陳皮苷、橘皮苷，廣泛存在于陳皮、枳實(shí)等中藥中。研究表明，橙皮苷具有抗氧化、抗腫瘤、降血壓、抗炎等藥理作用[9-12]，但橙皮苷對AS中巨噬細(xì)胞極化的作用機(jī)制未有深入報(bào)道。本研究主要探討橙皮苷對巨噬細(xì)胞的作用。

1 材料

1.1 動物與細(xì)胞雄性ApoE-/-小鼠購買自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，5周齡，60只，體質(zhì)量 20～22 g；Raw 264.7巨噬細(xì)胞購買自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 藥物與試劑橙皮苷(成都曼思特生物科技有限公司，貨號：A0032)；辛伐他汀(美國默沙東公司，批號：18032502)；LPS(上海源葉生物科技有限公司，貨號：S11060)；胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)液、青鏈霉素溶液、體積分?jǐn)?shù)0.25%含有EDTA的胰酶(美國Thermo Fisher生物科技有限公司，貨號：10100147、A4192301、10378016、2520072)；三酰甘油(triglycerides，TG)、總膽固醇(cholesterol，TC)、低密度脂蛋白(lowdensity lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、重組人精氨酸酶1(arginase-1，ARG1) 、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-10試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號：A110-1-1、A111-1-1、A113-1-1、A112-1-1、J052-1、H321-1、H009-1、H007-1-1)；P-AMPK，AMPK，PPAR-γ，P-P65，P65，GAPDH(美國CST公司，貨號：4186S、12063S、2435T、3039S、8242T、5174T)。

1.3 儀器CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司，型號：3111)；離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)有限公司，型號：TG16WS)；電泳儀(美國Bio-Rad公司，型號：powerpac HC)；酶標(biāo)儀(美國MP公司，型號：ID5)。

2 方法

2.1 動物分組及給藥將雄性ApoE-/-小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分6組，即空白組、模型組、陽性對照組、橙皮苷低劑量組、橙皮苷中劑量組、橙皮苷高劑量組，每組10只?？瞻捉M用普通飼料喂養(yǎng)，其余組用高脂飼料(21%脂肪，0.5%膽固醇)喂養(yǎng)16周復(fù)制AS模型；陽性對照組于第9周開始在高脂飼料基礎(chǔ)上給予辛伐他汀(5 mg·kg-1)灌胃；橙皮苷組于第9周開始在高脂飼料基礎(chǔ)上給予橙皮苷低劑量(100 mg·kg-1)、中劑量(200 mg·kg-1)、高劑量(400 mg·kg-1)灌胃。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 血脂檢測末次給藥24 h后，各組小鼠眼球采血，收集血清，按照試劑盒說明書操作檢測各組小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C含量。

2.2.2 小鼠主動脈根部油紅O染色小鼠處死后制備主動脈根部的冰凍切片(厚度10～15 μm)浸泡于甲醇-鈣固定液中固定。固定后的切片經(jīng)水洗，放于體積分?jǐn)?shù)60%異丙醇中，再置于油紅O染色液中染色10 min。于體積分?jǐn)?shù)60%異丙醇溶液中稍分化，水洗。置于明礬蘇木素液中復(fù)染細(xì)胞核30～60 s，流水沖洗稍風(fēng)干，甘油明膠封固，顯微鏡下觀察各組小鼠主動脈血管壁脂質(zhì)沉積情況，用Image J軟件分析小鼠主動脈瓣斑塊面積。

2.2.3 小鼠血清TNF-α、IL-6、Arg-1、IL-10檢測采用ELISA法檢測小鼠血清進(jìn)行TNF-α、IL-6、Arg-1、IL-10水平。

2.3 分子對接從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫 (RCSB PDB，https：//www.rcsb.org) 下載AMPK的晶體結(jié)構(gòu)，使用PyMOL軟件(2.1.0版本)分離原配體和靶蛋白，用ADT對靶蛋白進(jìn)行去水、加氫等處理；從PubChem數(shù)據(jù)庫 (Pubchem，https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載橙皮苷SDF構(gòu)象，用ADT進(jìn)行加氫、計(jì)算電荷等處理，運(yùn)用Autodock對接功能，計(jì)算受體和配體不同構(gòu)象的最低結(jié)合能，并對不同構(gòu)象的最低結(jié)合能進(jìn)行排序，運(yùn)用PyMOL分析和觀察活性化合物與靶蛋白的對接結(jié)果。

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)將Raw 264.7細(xì)胞以每孔3×105接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，模型組加入含 100 pg·L-1LPS的RPMI 1640培養(yǎng)液，空白組加普通RPMI 1640培養(yǎng)液，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h。橙皮苷組在模型組基礎(chǔ)上加入橙皮苷：橙皮苷低、中、高濃度組分別給予橙皮苷 5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1。

2.5 Western Blot法檢測細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)細(xì)胞分組和培養(yǎng)方法同上，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，然后進(jìn)行蛋白變性，配膠(4%濃縮膠，10%分離膠)、上樣(每孔上樣量為15 μg)、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、二抗，最后曝光，以GAPDH為內(nèi)參，用Image J軟件對蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠TG、TC、HDL-C及LDL-C水平比較模型組小鼠血清TG、TC、LDL-C水平高于空白組，HDL-C水平低于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示模型建立成功。與模型組比較，橙皮苷中劑量組、高劑量組及陽性對照組小鼠血清TG、TC和LDL-C水平降低，HDL-C水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組小鼠血清中TG、TC、HDL-C及LDL-C水平比較

3.2 各組小鼠主動脈斑塊比較與空白組比較，模型組小鼠主動脈瓣血管中發(fā)現(xiàn)大量的脂質(zhì)積累，膠原纖維含量減少，斑塊趨于不穩(wěn)定；與模型組比較，橙皮苷高劑量組和陽性對照組能抑制小鼠血管中脂質(zhì)的累積，顯著減少主動脈內(nèi)膜增厚，顯著減少脂質(zhì)區(qū)域，但陽性對照組優(yōu)于橙皮苷高劑量組。見圖1。與模型組比較，空白組、陽性對照組及橙皮苷高劑量組油紅O染色斑塊面積減小，見圖2。

圖1 各組小鼠主動脈斑塊形成(比例尺：500 μm)

注：與模型組比較，**P<0.01

3.3 各組小鼠TNF-α、 IL-6、Arg-1、IL-10水平比較與模型組比較，空白組、橙皮苷低劑量組、橙皮苷中劑量組、橙皮苷高劑量組TNF-α、 IL-6水平降低，Arg-1、IL-10水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

注：A：血清TNF-α含量；B：血清IL-6含量；C：Arg-1含量；D：血清IL-10含量；與模型組比較，**P<0.01

3.4 橙皮苷與AMPK的結(jié)合能力的預(yù)測使用分子對接程序 AutoDock vina 對橙皮苷與AMPK的結(jié)合能力預(yù)測，結(jié)果提示橙皮苷可以與AMPK的 ILE-46、GLN-109、ASN-111、ASN-110 等殘基形成氫鍵而結(jié)合，結(jié)合力為-10.158 kcal·mol-1，表明橙皮苷與AMPK有較好的結(jié)合能力。橙皮苷與AMPK結(jié)合構(gòu)象見圖4。

注：A.橙皮苷與AMPK結(jié)合的外部示意圖；B.橙皮苷與AMPK殘基結(jié)合的示意圖

3.5 橙皮苷對AMPK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響橙皮苷使LPS誘導(dǎo)的Raw 264.7巨噬細(xì)胞p-AMPK、PPAR-γ蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，p-P65/P65水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖5。

注：A：Raw 264.7細(xì)胞的P-AMPK，AMPK，PPAR-γ，P-P65，P65，GAPDH的蛋白表達(dá)條帶；B：Raw 264.7細(xì)胞的p-AMPK，AMPK，PPAR-γ，P-P65，P65，GAPDH的蛋白表達(dá)相對值；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

4 討論

心血管急性事件一直是心血管疾病防治的重點(diǎn)與難點(diǎn)，AS是其重要的病理生理基礎(chǔ)，也是其發(fā)病的重要原因之一。研究表明，AS的斑塊脂質(zhì)及其氧化衍生物的暴露可刺激巨噬細(xì)胞極化，M1型巨噬細(xì)胞極化促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展，而M2性巨噬細(xì)胞極化可有效保護(hù)AS的發(fā)生發(fā)展[8]。因此，尋找調(diào)控巨噬細(xì)胞M2極化的藥物是目前研究抗AS的熱點(diǎn)之一，而中藥是這方面藥物的重要來源。既往研究報(bào)道，丹參酮IIA、紅景天苷、人參皂苷Rb1等可通過調(diào)控巨噬細(xì)胞極化防止AS斑塊的形成[13-15]，巨噬細(xì)胞極化是防治AS藥物的研究熱點(diǎn)。研究指出，橙皮苷可有效抑制AS斑塊的形成[12]，調(diào)節(jié)多種心血管危險(xiǎn)因素包括血脂異常、血糖異常、血壓異常等[11]，但其對AS巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控作用尚未見有報(bào)道。

LPS是研究AS巨噬細(xì)胞極化細(xì)胞模型的常用誘導(dǎo)劑，可代表AS發(fā)生發(fā)展過程的慢性炎癥改變，ox-LDL常用于造模模擬體內(nèi)高脂環(huán)境[16]。本研究中小鼠造模時(shí)長16周，周期較長，主要研究小鼠在高脂影響下的血管慢性炎癥性改變，從而導(dǎo)致主動脈斑塊的形成，故相應(yīng)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)采用的是LPS刺激巨噬細(xì)胞的體外模型模擬體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的炎癥變化。

本實(shí)驗(yàn)采用高脂飼料喂養(yǎng)構(gòu)建ApoE-/-小鼠AS體內(nèi)模型和LPS誘導(dǎo)的Raw 264.7巨噬細(xì)胞極化構(gòu)建體外模型，通過血清學(xué)、病理學(xué)、分子對接和Western Blot等方法，發(fā)現(xiàn)橙皮苷可有效改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠AS斑塊形成，降低血脂水平，減少M(fèi)1巨噬細(xì)胞極化細(xì)胞因子TNF-α、 IL-6釋放，上調(diào)M2巨噬細(xì)胞極化細(xì)胞因子Arg-1、IL-10 水平，降低P-P65的表達(dá)，上調(diào)P-AMPK/PPAR-γ的表達(dá)。

核因子-κB P65(nuclear factor-κB)是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控AS炎癥反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子、黏附分子表達(dá)。NF-κB P65信號通路的活化貫穿于AS血管內(nèi)皮損傷到斑塊形成的各個(gè)環(huán)節(jié)[17]。此外，P65可促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1極化，增加TNF-α、IL-6的釋放[18]。AMPK即腺苷酸活化蛋白激酶，是一種細(xì)胞能量感受器，是調(diào)節(jié)機(jī)體合成代謝和分解代謝的主要蛋白激酶，影響蛋白質(zhì)、脂肪、糖類的代謝途徑，容易受到缺血缺氧、氧化損傷等病理因素的影響，對心血管起到保護(hù)作用[19-20]。PPAR-γ即過氧化物酶體增殖物激活受體，是AMPK下游調(diào)控糖脂代謝和炎癥的重要轉(zhuǎn)錄因子，研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ可調(diào)控脂質(zhì)代謝，巨噬細(xì)胞逆轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇、抗炎及保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞等作用[19-21]。AMPK的活化可以上調(diào) PPAR-γ 的表達(dá)。此外，研究報(bào)道激活A(yù)MPK/PPAR-γ 可促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞極化，發(fā)揮抗AS的炎癥作用，同時(shí)可通過抑制NF-κB(P65)活化，抑制M1巨噬細(xì)胞極化，從而發(fā)揮保護(hù)AS的作用[22]。

綜上所述，橙皮苷可能通過激活A(yù)MPK/PPAR-γ通路，抑制NF-κB(P65)活化，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化，抑制M1極化細(xì)胞因子的釋放，促進(jìn)M2極化細(xì)胞因子表達(dá)，抑制高脂飲食誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠AS發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果發(fā)掘了AS治療的新靶點(diǎn)，闡明橙皮苷防治AS的內(nèi)在機(jī)制，為AS的治療和后續(xù)研究確定新的靶點(diǎn)和思路，但其對AS巨噬細(xì)胞極化的具體調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。