范 婭， 劉 麗， 杜 衎， 孫 燕， 劉兆倩， 馮海洋， 張穎穎， 高德民

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 濟南 250355； 2.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院， 濟南 250355)

北柴胡(BupleurumchinenseDC.)是傘形科柴胡屬多年生草本植物，其根作為柴胡入藥，主要活性成分是柴胡皂苷和揮發(fā)油[1]，具有解表和里、疏肝解郁，升舉陽氣的功效[2]，臨床上常用來治療炎癥性疾病和感染性疾病[3]。柴胡在北半球分布廣泛，自然生態(tài)多樣，氣候類型復(fù)雜，品種多樣性豐富[4-6]，導(dǎo)致柴胡種子表型性狀地理變異顯著。據(jù)研究，北柴胡種子的種長、千粒重、含水量與地理分布密切相關(guān)，且差異顯著[7]。但關(guān)于北柴胡種子性狀變異與地理氣候因子相關(guān)性的研究較少，影響了柴胡大田推廣和品種選育。

揮發(fā)油是一類植物次生代謝產(chǎn)物，在植物信號傳遞過程中發(fā)揮著重要作用[8]，而揮發(fā)油成分和含量不僅影響植物種子的活性，還能進一步影響植物的生長發(fā)育和藥材的品質(zhì)[9]。北柴胡種子油管中油腔較大，且胚乳中含有脂肪油滴，具有香氣，但在常溫保存下生活力極易喪失。辛霞[10]研究表明，種子中脂肪的代謝與種子活力具有一定的相關(guān)性。但關(guān)于柴胡種子中揮發(fā)油與活性關(guān)系的研究仍未見報道。

本研究對不同來源北柴胡種子的表型性狀進行分析，揭示北柴胡種子表型性狀變異與地理氣候因子的關(guān)系，同時利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對北柴胡種子揮發(fā)油成分進行分離和鑒定，比較不同來源的揮發(fā)油成分的差異，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的研究數(shù)據(jù)，旨在為北柴胡種源鑒定及種子質(zhì)量評價提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

本實驗所用的北柴胡種子均為栽培品種，于2020年10月上旬收集完成，并由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分子實驗室ITS基因序列鑒定為北柴胡種子，樣品信息如表1所示。憑證標(biāo)本存放于山東中醫(yī)藥大學(xué)標(biāo)本室(SDCM)。

表1 6個北柴胡種子樣品信息

1.2 方 法

1.2.1表型性狀測定

參照張浩等[11]的方法測量種子的種長、種寬和種厚；參照何慶海等[12]的方法精確測量種子的千粒重和含水量，每組試驗設(shè)3次重復(fù)。

1.2.2生活力測試

生活力測試的原理為無色溶于水無色的2,3,5-tryphenyl tetrazolium chloride(TTC)與植物新陳代謝所產(chǎn)生的氫離子相結(jié)合產(chǎn)生紅色復(fù)合物[13]。根據(jù)Norton等[14]的研究稍加改動，使用1% TTC溶液浸泡柴胡種子，37 ℃下浸泡18 h后，縱切種子，在光學(xué)顯微鏡下觀察種子染色情況。沒有被染紅的種子記為沒有活力。每組試驗設(shè)3次重復(fù)。

1.3 揮發(fā)油提取

北柴胡種子粉碎精確稱量500.00 g，加入6 000 mL的蒸餾水，使用Clevenger的裝置進行水蒸氣蒸餾，持續(xù)回流提取8 h，收集揮發(fā)油[10]，加入適量無水Na2SO4，離心后收集揮發(fā)油于棕色玻璃瓶中，-20 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

采用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對所得揮發(fā)油進行分析，實驗條件如下，GC條件：色譜柱Agilent HP-5(30 m×250 m×0.5 m)，進樣口溫度290 ℃，程序升溫：初始溫度40 ℃保持3 min，然后以每分鐘10 ℃直到280 ℃保持20 min。運行時間47 min。載氣為高純氦(純度≥99.9%)，分流比100∶1，流速1 mL/min，進樣量1 L，去除溶劑峰。MS條件：EI離子源，全掃描模式采集數(shù)據(jù)，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，傳輸線溫度290 ℃，電子轟擊能量70 eV，掃描范圍m/z 35～600全掃描。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計分析，變異系數(shù)計算公式：

利用所得質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫NIST 08進行比對，初步獲得化合物信息，同時根據(jù)質(zhì)譜信息，進一步人工解析與文獻進行比對確認(rèn)。使用峰面積歸一化法確定揮發(fā)油各成分相對百分含量。使用SPSS 21.0軟件對所得的揮發(fā)油成分進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子表型性狀分析

如表2所示。北柴胡種子形態(tài)差異變化較大，種長范圍在2.724～3.358 mm之間，長寬比在2.729～3.239之間，千粒重在1.129～1.688 g之間，含水量在6.32%～8.86%之間，生活力在40%～65%之間。B 4、B 5、B 6與B 1、 B 2和B 3相比，B 4、B 5、B 6的長寬比范圍為2.997～3.239 mm、千粒重為1.630～1.688 g、含水量為7.75%～8.86%，均高于B 1、B 2、B 3的北柴胡種子；但B 4、B 5、B 6的生活力范圍為40%～46%，低于B 1(48%)、B 2(65%)和B 3(49%)。說明不同來源的北柴胡種子的形態(tài)和性狀指標(biāo)均存在顯著性差異，其性狀存在較大的變異，遺傳信息豐富[7]。

表2 6種北柴胡種子物理特性信息采集

2.2 北柴胡種子表型性狀變異分析

變異系數(shù)常用來表示表型多樣性，其大小間接反映了群體多樣性的豐富程度。變異系數(shù)越大，群體間離散性越大，即表型多樣性越豐富；變異系數(shù)小則表明該群體的性狀離散度低，表型多樣性差[15]。使用SPSS 21.0軟件對北柴胡種子的表型性狀進行變異分析結(jié)果(表3)表明，其表型變異系數(shù)(CV)為生活力>千粒重>含水量>種長>種厚>種寬；性狀的相對極差(R′)可以用來衡量群體內(nèi)的極端變異程度[16]，而相對極差的大小則為生活力>含水量>種長>種厚>種寬>千粒重。從總體來看，種寬和種厚的變異程度相對較小，而生活力和含水量的變異程度相對較大。

表3 北柴胡種子表型性狀變異分析

2.3 表型性狀與地理氣候因子相關(guān)性分析

種子表型性狀與地理氣候因子進行相關(guān)性分析顯示(表4)，千粒重與含水量、種寬和年平均溫度呈顯著正相關(guān)(p<0.05)，含水量與種寬、經(jīng)度和緯度呈顯著性正相關(guān)，種寬和種厚與年平均溫度呈顯著負相關(guān)，說明地理位置及溫度對種子的表型性狀有較大影響[17]。戚文濤等[7]研究發(fā)現(xiàn)，北柴胡種子的種長、種寬、種厚及千粒重等指標(biāo)隨經(jīng)度的升高而改變，含水量隨海拔的降低，降水量的增加而增加。千粒重是衡量種子質(zhì)量的指標(biāo)之一，柴胡種子籽粒大小對植物苗期生長速度及植株生物學(xué)產(chǎn)量具有重要影響[18]。余馬等[19]研究發(fā)現(xiàn)，柴胡種子的千粒重很容易受到環(huán)境的影響，基因型與環(huán)境之間存在很強的相互作用。這與本研究結(jié)果一致。付堯等[20]發(fā)現(xiàn)，種子含水量與種子活力密切相關(guān)，然而本研究發(fā)現(xiàn)，地理氣候因子和種子的表型性狀等因素對種子的生活力沒有顯著影響，這可能是由于儲存時間與條件、種子成熟度和品種之間的差異等因素導(dǎo)致[19,21]。

表4 表型性狀與地理氣候因子相關(guān)性分析

2.4 種子揮發(fā)油提取率

如表5所示，揮發(fā)油提取率整體較低，揮發(fā)油提取率B 1>B 2>B 6>B 3>B 4>B 5，B 1的提取率明顯高于其余5個品種，說明品種間的差異較大。柴胡揮發(fā)油顏色差異也較為明顯，B 1和B 2顏色為淺黃色，B 3為深黃色，B 4、B 5、B 6顏色相近，為亮黃色。揮發(fā)油含量整體提取率較低可能是由于種子處在休眠期，種子體內(nèi)代謝活動緩慢，而揮發(fā)油作為次級代謝產(chǎn)物，其含量受休眠時間的影響。

2.5 北柴胡種子揮發(fā)油成分鑒定

對收集到的揮發(fā)油進行GC-MS分析。經(jīng)過比對和分析，6個品種共鑒定出49種化合物(表6)，來自山東濟南的B 1和B 2分別鑒定出12種化合物和14種化合物。來自甘肅定西的B 3共鑒定出23種化合物；來自內(nèi)蒙古赤峰的B 4共鑒定出23種化合物；來自山東淄博的B 5共鑒定出25種化合物；來自黑龍江伊春的B 6共鑒定出23種化合物。其中有α-caryophyllene(α-石竹烯)和β-caryophyllene(β-石竹烯)為共有成分，占總成分的2.65%～56.88%。在B 5樣品中所占比例最少，為2.65%，在B 2樣品中所占比例最高，為56.88%。由表6可知，不同產(chǎn)地的北柴胡種子揮發(fā)油成分含量差異較大。本試驗鑒定的北柴胡種子揮發(fā)油成分與羅穎[9]研究的來自湖北地區(qū)的北柴胡種子揮發(fā)油成分差異較大，造成成分差異的原因可能與儲藏條件[22-24]、采集地點、海拔和休眠日期有關(guān)[25-27]。

表6 6種北柴胡種子揮發(fā)油成分及其相對含量

2.6 北柴胡種子揮發(fā)油成分聚類分析及主成分分析

使用SPSS 21.0軟件對所得揮發(fā)油成分進行聚類分析，使用方法為Ward法，聚類結(jié)果如圖1所示，當(dāng)平方歐式距離為20時，聚類分為兩類。B 1與B 2聚為一類，B 3～B 6聚為一類。當(dāng)平方歐式距離為5時，聚類分為四類，其中B 4、B 5和B 6聚為一類，B 1、B 2和B 3分別聚為一類，其聚類結(jié)果表明，不同品種的北柴胡種子化學(xué)成分存在較大差異。

圖1 6種北柴胡種子揮發(fā)油成分聚類分析

對所有北柴胡種子揮發(fā)油成分進行主成分分析，依據(jù)特征值Total>1的條件進行選擇，由主成分1和主成分2進行衡量，主成分1的方差貢獻率為46.23%，主成分2的方差貢獻率為27.70%，累計貢獻率為73.93%，計算各樣品得分繪制主成分分析的空間成分圖(圖2)，B 3與其他樣品差異較大，單獨歸為一類，B 4、B 5和B 6這3種樣品成分最為相似，聚為一類。B 1和B 2成分具有一定差異，各自歸為一類。主成分分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果基本一致。

圖2 6種北柴胡種子揮發(fā)油成分主成分分析

表6(續(xù))

2.7 揮發(fā)油共有成分與表型性狀相關(guān)性

參照Mahboobeh等[28]的研究方法，對北柴胡種子揮發(fā)油共有成分與種子生活力進行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，α-石竹烯與β-石竹烯生活力分別呈顯著相關(guān)(p<0.05)和極顯著相關(guān)(p<0.01)。α-石竹烯與β-石竹烯是雙環(huán)倍半萜類化合物，是植物揮發(fā)性成分的重要組成部分，主要由胞質(zhì)的甲羥戊酸途徑合成[29]。北柴胡種子的生活力除遺傳特性外，還與種子的成熟度、萌發(fā)和劣變等生理過程有密切聯(lián)系。隨著種子生活力的上升，各種代謝也逐漸活躍，其代謝產(chǎn)物種類也增加[30]。其中B 4、B 5和B 6共有成分α-石竹烯和β-石竹烯占其總成分的2.65%～4.12%，其生活力在40%～46%之間，總體生活力較低。B 2的共有成分含量為56.88%，其生活力最高為65%，表明共有成分α-石竹烯與β-石竹烯的含量與生活力呈正相關(guān)關(guān)系。生活力常用來表示種子的生存能力，是評價種子的質(zhì)量的重要指標(biāo)，根據(jù)揮發(fā)油成分的差異情況，可為北柴胡種子的質(zhì)量鑒別提供參考依據(jù)，但關(guān)于具體代謝機制和內(nèi)在聯(lián)系，有待進一步研究[31]。

3 結(jié) 論

本實驗通過對北柴胡種子表型性狀進行測量分析，同時探究了北柴胡種子表型性狀與地理氣候因子的關(guān)聯(lián)，結(jié)果表明，年平均溫度與千粒重呈顯著正相關(guān)，與種寬和種厚呈顯著負相關(guān)，經(jīng)緯度與含水量呈顯著性正相關(guān)，說明地理位置及溫度對于種子的表型性狀有較大影響。同時是對6種北柴胡種子揮發(fā)油進行提取鑒定，共鑒定出49種化合物，其中有β-石竹烯和α-石竹烯為共有成分，且共有成分含量差異較大，共有成分含量與生活力呈正相關(guān)，本研究首次系統(tǒng)研究了不同來源北柴胡種子生活力與揮發(fā)油成分之間的關(guān)系，其結(jié)果將為北柴胡種子質(zhì)量評價和種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供新的理論依據(jù)，并為北柴胡種子的種源鑒定與篩選提供參考依據(jù)。后續(xù)在此基礎(chǔ)上可進一步研究不同產(chǎn)地北柴胡種子對產(chǎn)量的影響。