周國(guó)雁， 陳 丹， 伍少云， 隆文杰， 武曉陽， 蔡 青

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所/云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 昆明 650205)

小麥胚乳貯藏蛋白中麥谷蛋白、醇溶蛋白[1]的含量及其二者的比例決定著面粉的二次加工品質(zhì)。其中，不同的麥谷蛋白在SDS-PAGE電泳中的遷移率不同，被分為高分子量麥谷蛋白(High Molecular Weight，HMW)和低分子量麥谷蛋白(Low Molecular Weight，LMW)。HMW麥谷蛋白只占麥谷蛋白總量的25%～40%、貯存蛋白或面筋蛋白的10%左右[2]，但能解釋小麥面粉品質(zhì)變異的30%～79%[3]，由于位于1 A、1 B、1 D染色體長(zhǎng)臂上的Glu-1基因座位的相關(guān)亞基(glutenin subunit，GS)控制，決定著面團(tuán)的延展性和面筋彈性，對(duì)面包烘烤品質(zhì)和面制品蒸煮品質(zhì)有著重要影響，是改良小麥品質(zhì)的關(guān)鍵遺傳因素[2]。LMW麥谷蛋白約占麥谷蛋白總量的60%左右，由1 A、1 B和1 D染色體短臂上的Glu-3基因座位[4]的相關(guān)基因控制，決定著面團(tuán)的強(qiáng)度和粘度，尤其是對(duì)面筋拉伸阻力和延展性[5]的影響甚至超過了HMW-GS[6]，也是改良小麥面粉二次加工品質(zhì)的重要遺傳因素。

研究表明，Glu-3座位內(nèi)不同的位點(diǎn)也有不同的效應(yīng)，其中對(duì)面團(tuán)強(qiáng)度貢獻(xiàn)的順序?yàn)椋篏lu-A3位點(diǎn)，d>f>c>b>e；Glu-B3位點(diǎn)，g>b>f>i>d>a>h>c；對(duì)面團(tuán)延伸性貢獻(xiàn)的順序?yàn)椋篏lu-A3位點(diǎn)，c>d>f>b>e；Glu-B3位點(diǎn)，i>b>a>f>g>h>c>d；而Glu-D3位點(diǎn)的基因之間對(duì)品質(zhì)性狀的影響差異較小，所以將Glu-A3d、Glu-B3b、Glu-B3g和Glu-B3i確定為優(yōu)質(zhì)LMW-GS[7]。對(duì)于中國(guó)小麥品種，與面包、面條品質(zhì)緊密相關(guān)的LMW-GS位點(diǎn)是Glu-A3和Glu-B3，因?yàn)閷?duì)和面時(shí)間的影響表現(xiàn)為Glu-B3>Glu-A1=Glu-B1=Glu-A3，對(duì)面團(tuán)耐揉性的影響表現(xiàn)為Glu-B3=Glu-B1>Glu-A3>Glu-A1，對(duì)沉淀值的影響表現(xiàn)為Glu-B3>Glu-B1>Glu-A1>Glu-A3(Glu-A1、Glu-B1為HMW-GS)[8-9]。所以，對(duì)于中國(guó)優(yōu)質(zhì)面包、面條小麥品種，Glu-B3位點(diǎn)更為重要一些。另外，不同LMW麥谷蛋白基因的組合對(duì)面粉加工品質(zhì)的影響也不同，帶有基因組合Glu-A3b+B3b+B3d、Glu-A3b+B3b+B3c、Glu-A3c+B3b+B3c的品種，一般大都具有優(yōu)異的面包品質(zhì)[10]。

常用于檢測(cè)LMW-GS等位變異的方法有SDS-PAGE電泳、雙向電泳、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)和PCR擴(kuò)增等。SDS-PAGE技術(shù)應(yīng)用廣泛，但因LMW-GS帶型復(fù)雜，且與醇溶蛋白條帶重疊，很容易造成誤讀誤判；雙向電泳雖然分辨率高，但適合性或通用性有待進(jìn)一步證明，因?yàn)檫@種方法區(qū)分不了一些特殊的LMW-GS；MALDI-TOF-MS能夠較好地區(qū)分Glu-D3位點(diǎn)的等位變異，但是對(duì)Glu-A3和Glu-B3位點(diǎn)的等位變異識(shí)別效果不佳，且儀器昂貴[11-12]。相對(duì)而言，PCR方法是最簡(jiǎn)單、方便的一種方法。因此，為快速篩選、發(fā)掘優(yōu)質(zhì)LMW-GS的品種或育種材料，Wang等[13-14]根據(jù)在Glu-A3、Glu-B3位點(diǎn)克隆的基因序列開發(fā)了檢測(cè)Glu-A3、Glu-B3位點(diǎn)不同基因的STS標(biāo)記。Zhang等[15]、Van Campenhout等[16]分別開發(fā)出可檢測(cè)基因Glu-A3d、Glu-B3的功能標(biāo)記；而Francis等[17]和Chai等[18]分別開發(fā)出檢測(cè)1 B/1 R易位系基因Glu-B3j、ω-secalin的PCR標(biāo)記。

本試驗(yàn)前期，已經(jīng)有研究者利用SDS-PAGE方法鑒定并分析了云南省省級(jí)作物種質(zhì)資源庫保存的云南不同歷史時(shí)期選育的152份小麥品種(系)的LMW-GS組成與分布[19]，發(fā)現(xiàn)其中66份(43.4%)材料攜帶優(yōu)質(zhì)HMW-GS 1，84 D 2-2813、滇801、靖343等3份材料帶有優(yōu)質(zhì)亞基13+16，73-16、802-87、鳳0483、云麥54、靖麥12號(hào)等12份(7.9%)材料帶有優(yōu)質(zhì)亞基14+15，822-698、832-63、春980、滇7034、鳳麥34、云選11-12等20份(13.2%)材料帶有優(yōu)質(zhì)亞基17+18，832-714、862-103、春980、鳳0483、鳳麥34等8份材料帶有優(yōu)質(zhì)2+10，福利麥、云麥27號(hào)、0230、云麥36、云選11-12、臨麥15號(hào)等37份(24.3%)材料帶有優(yōu)質(zhì)亞基5+10，832-63、滇7034、靖343、云麥61等24份(15.8%)材料帶有優(yōu)質(zhì)亞基5+12；84 D 2-2813、832-63、春980、鳳0483、滇7034、靖343、靖麥12號(hào)、鳳麥34、云選11-12等17份(10.5%)材料具有優(yōu)質(zhì)亞基組合13+16、或14+15或17+18、2+10、或5+10或5+12。品質(zhì)評(píng)分在7分及以上的材料24份，占15.8%，如福利麥、822-852、云麥42號(hào)、云選11-12、臨麥15號(hào)等?？梢?，這些品種(系)中有較高比例可開展優(yōu)質(zhì)小麥育種的優(yōu)質(zhì)親本，為充分利用這些優(yōu)質(zhì)育種材料改良，提高云南選育小麥品種的面粉加工品質(zhì)，本研究利用上述文獻(xiàn)報(bào)道的分子標(biāo)記，在基本明確HMW-GS組成基礎(chǔ)上進(jìn)一步弄清這些材料所帶有的LMW-GS，以期篩選或挖掘出HMW-GS和LMW-GS都表現(xiàn)優(yōu)異的材料或品種(系)，并為其育種利用提供分子生物學(xué)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試品種(系)為云南省省級(jí)作物種質(zhì)庫保存的云南省選育品種79份(表2標(biāo)注為“V”)、品系78份(表2標(biāo)注為“L”)、省外或境外引進(jìn)的材料20份(表2標(biāo)注為“I”)。在選育品種(系)中152份已鑒定HMW-GS的組成，其中在Glu-A1(1)、Glu-B1(13+16或14+15或17+18)和Glu-D1(5+10或5+12)三個(gè)位點(diǎn)都為優(yōu)質(zhì)HMW-GS的材料10份，如84 D 2-2813、832-63、麗育1號(hào)、滇7034、昆7808、德麥2號(hào)、滇89 D 2-29、楚麥9024、靖343和云選11-12等；在Glu-B1(13+16或14+15或17+18)和Glu-D1(2+10或5+10或5+12)兩個(gè)位點(diǎn)為優(yōu)質(zhì)HMW-GS的材料16份，如84 D 2-2813、832-63、春980、鳳0483、滇7034、靖343、靖麥12號(hào)、鳳麥34、云選11-12等，占10.5%。品質(zhì)評(píng)分在7分及以上的材料24份，如福利麥、822-852、云麥42號(hào)、云選11-12、臨麥15號(hào)等，占15.8%。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1DNA提取

每份參試材料隨機(jī)選取50粒種子催芽生長(zhǎng)至第7天，取新鮮幼嫩的混合麥苗，用CTAB法[20]提取全基因組DNA，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度，然后稀釋至100 ng/μL。

1.2.2PCR擴(kuò)增與電泳檢測(cè)

用于檢測(cè)參試材料LMW-GS的分子標(biāo)記共15對(duì)(表1)，其中Glu-A3座位5對(duì)，即引物P 1～P 5，分別檢測(cè)Glu-A3a、Glu-A3b、Glu-A3d、Glu-A3e等4個(gè)基因。Glu-B3座位10對(duì)，即P 6～P 15。這些引物均由擎科生物技術(shù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系為20 μL，包括2×TSINGKE Master Mix 10 μL,上下游引物各0.4 μL(10 μmol/L)，模板DNA 1.5 μL(25 ng/μL)，ddH2O 7.7 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min；94 ℃ 50 s，50～55 ℃退火45～50 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 3 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 試驗(yàn)選用的15種標(biāo)記

2 結(jié)果與分析

15對(duì)引物中有7對(duì)(P 1、P 2、P 3、P 7、P 8、P 11和P 14)在所有參試材料中都無擴(kuò)增產(chǎn)物，剩余8對(duì)引物在157份參試材料中擴(kuò)增到目標(biāo)條帶(表2)，占參試材料總數(shù)的88.7%，另外20份參試材料無目標(biāo)條帶或擴(kuò)增產(chǎn)物，約占參試材料總數(shù)的11.3%。

表2 177份云南育成及引進(jìn)小麥種質(zhì)資源低分子麥谷蛋白基因檢測(cè)結(jié)果

表2(續(xù))

表2(續(xù))

表2(續(xù))

在Glu-A3基因座位，除引物P 1、P 2和P 3在所有參試材料中都無擴(kuò)增產(chǎn)物外，引物P 4在德宏508-512、巧家3號(hào)、保山農(nóng)選3號(hào)、云麥33和滇802-87等45份材料中能擴(kuò)增到488 bp的目標(biāo)條帶(圖1)，約占157份材料(下同)的28.7%，說明這些參試材料帶有低分子量麥谷蛋白基因Glu-A3d。P 5引物在云麥20號(hào)、云南778、78鑒-35、怒江662-525-2、昆麥1號(hào)和云植803等6份參試材料中擴(kuò)增到158 bp的目標(biāo)條帶(圖2)，說明這些參試材料帶有低分子量麥谷蛋白基因Glu-A3e，約占3.8%。

注：M為Maker DL 2000；1～24依次為云麥34、云麥33、昆麥1號(hào)、滇84 D 2-2813、滇822-852、滇802-87、滇812-244、滇822-698、滇832-63、滇832-653、滇832-714、滇842-254、滇852-18、滇852-181、滇852-192、滇852-685、滇862-39、滇862-103、滇862-753、滇437、云植803、 春980、鳳系7849、鳳麥18。

注：M為Maker DL 2000；擴(kuò)增到158 bp條帶的材料依次為云麥20號(hào)、云南778、78鑒-35、怒江662-525-2、昆麥1號(hào)和云植803。

在Glu-B3座位，Glu-B3基因的引物P 6在麒麟福利麥、迪慶79格選4號(hào)和云麥20號(hào)等105份參試材料中擴(kuò)增到636 bp的目標(biāo)條帶(圖3)，說明這些材料帶有低分子麥谷蛋白基因Glu-B，約占66.9%。

注：M為Maker DL2000；1～24依次為云麥34、云麥33、昆麥1號(hào)、滇84 D 2-2813、滇822-852、滇802-87、滇812-244、滇822-698、滇832-63、滇832-653、滇832-714、滇842-254、滇852-18、滇852-181、滇852-192、滇852-685、滇862-39、滇862-103、滇862-753、滇437、云植803、 春980、鳳系7849、鳳麥18。

P 9引物僅在文山1011、巧家2號(hào)、遼春10號(hào)3份材料中擴(kuò)增到Glu-B3c基因472 bp的目標(biāo)條帶(圖4)，約占1.9%；引物P 10在云麥27號(hào)、原墨1號(hào)、紅河紅輻1號(hào)、78鑒-35等22份材料中擴(kuò)增到Glu-B3g基因的目標(biāo)條帶853 bp(圖5)，占14.0%；引物P 12在大理鳳系7901、滇832-63、滇842-254等14份材料中擴(kuò)增到Glu-B3h基因的目標(biāo)條帶1 022 bp(圖6)，占8.9%；引物P 13在云南778、滇7206、德麥3號(hào)、綿陽11號(hào)等22份材料中擴(kuò)增到基因621 bp的目標(biāo)條帶(圖7)，占14.0%；引物P 15在滇822-852、滇812-244、滇862-39、滇862-103等共50份材料中擴(kuò)增到ω-secalin基因的1 100 bp，說明大約28.2%的材料都帶有ω-secalin或Glu-B3j基因(圖8)。

注：M為Maker DL 2000；1～33依次為麒麟福利麥、迪慶79格選4號(hào)、迪慶79格選5號(hào)、迪慶79格選10號(hào)、迪慶79格選13號(hào)、云麥20號(hào)、云麥27號(hào)、云麥29號(hào)、滇484、云南778、原墨1號(hào)、文山1011、紅河紅輻1號(hào)、紅河南平麥、78鑒-35、保山墨巴66/原農(nóng)53、德宏508-512、滇73-16、滇84 V-417、滇84 V-418、盈江滇175、滇7206、滇7208、巧家1號(hào)、胚育1號(hào)、巧家2號(hào)、巧家3號(hào)、滇726、怒江662-525-2、大理鳳系7901、石屏南原1號(hào)、西南36-428、保山農(nóng)選3號(hào)。

注：M為Maker DL 2000；1～33依次為麒麟福利麥、迪慶79格選4號(hào)、迪慶79格選5號(hào)、迪慶79格選10號(hào)、迪慶79格選13號(hào)、云麥20號(hào)、云麥27號(hào)、云麥29號(hào)、滇484、云南778、原墨1號(hào)、文山1011、紅河紅輻1號(hào)、紅河南平麥、78鑒-35、保山墨巴66/原農(nóng)53、德宏508-512、滇73-16、滇84V-417、滇84V-418、盈江滇175、滇7206、滇7208、巧家1號(hào)、胚育1號(hào)、巧家2號(hào)、巧家3號(hào)、滇726、怒江662-525-2、大理鳳系7901、石屏南原1號(hào)、西南36-428、保山農(nóng)選3號(hào)。

注：M為Maker DL 2000；1～33依次為云麥34、云麥33、昆麥1號(hào)、滇84 D 2-2813、滇822-852、滇802-87、滇812-244、滇822-698、滇832-63、滇832-653、滇832-714、滇842-254、滇852-18、滇852-181、滇852-192、滇852-685、滇862-39、滇862-103、滇862-753、滇437、云植803、 春980、鳳系7849、鳳麥18、大理鳳803N2-30-18-1、大理819M9-1-9、大理819M4-2-6、大理鳳0483、大理鳳0103、大理鳳0230、滇801、靖麥2號(hào)、麗育1號(hào)。種(洛夫林13)血統(tǒng)的材料只有滇822-852(ZM 17034，云0637)1份，

注：M為Maker DL 2000；1～33依次為麒麟福利麥、迪慶79格選4號(hào)、迪慶79格選5號(hào)、迪慶79格選10號(hào)、迪慶79格選13號(hào)、云麥20號(hào)、云麥27號(hào)、云麥29號(hào)、滇484、云南778、原墨1號(hào)、文山1011、紅河紅輻1號(hào)、紅河南平麥、78鑒-35、保山墨巴66/原農(nóng)53、德宏508-512、滇73-16、滇84 V-417、滇84 V-418、盈江滇175、滇7206、滇7208、巧家1號(hào)、胚育1號(hào)、巧家2號(hào)、巧家3號(hào)、滇726、怒江662-525-2、大理鳳系7901、石屏南原1號(hào)、西南36-428、保山農(nóng)選3號(hào)。

注：M為Maker DL 2000；1～24依次為云麥60、云麥61、云麥62、云麥63、云麥64、云麥56、靖麥17號(hào)、靖麥19號(hào)、臨麥6號(hào)、臨麥15號(hào)、臨麥16號(hào)、文麥8號(hào)、文麥9號(hào)、文麥11號(hào)、文麥14號(hào)、云麥52、云麥68、云麥101、多穗白、多穗白(紅粒)、滇75-041-1、昌0245-17-6、繁六、保山雜交種1756/農(nóng)選3號(hào)。

3 討 論

3.1 利用Glu-B3、Glu-B3j、ω-secalin基因引物鑒定1 BL/1 RS易位系的可靠性

Van Campenhout等[16]認(rèn)為，攜帶1 BL/1 RS的品種能夠通過Glu-B3基因引物PCR產(chǎn)物的缺失來區(qū)分。但文中Glu-B3基因引物O 11 B 5(GGTACCAACAACAACAACCC)和O 11 B 3 (GTTGCTGCTGAGGTTGGTTC)，分別是本文引物P 6的F和R，是根據(jù)T.aestivumGlu-3gene序列(X 84887、X 84960)設(shè)計(jì)的，產(chǎn)生的636 bp產(chǎn)物位于可變重復(fù)區(qū)域(variable repeat domain)，與黑麥遺傳信息無關(guān)。另外，Glu-B3基因位于1 B染色體短臂，而1 BL/1 RS易位系是小麥1 B染色體長(zhǎng)臂的部分或片段被黑麥1 R染色體短臂的一部分所取代，理論上1 BL/1 RS材料都應(yīng)具有染色體1 BS。在Chai[18]的研究中，雖然P 6引物在1 BL/1 RS材料中無擴(kuò)增產(chǎn)物，但并沒有暗示可以用這對(duì)引物來鑒別1 BL/1 RS 材料。因此，盡管本文引物P 6對(duì)德麥4號(hào)DNA的擴(kuò)增與梁強(qiáng)等[21]的結(jié)果一致，無PCR產(chǎn)物，但是Ali N等[22]、魏學(xué)軍等[23]、梁強(qiáng)等[21]用引物P 6有無PCR擴(kuò)增產(chǎn)物來區(qū)分1 B/1 R易位系是欠妥的。至于Francis等[17]設(shè)計(jì)的Glu-B3j基因引物(P 14)，雖然是小麥背景下快速檢測(cè)黑麥染色質(zhì)的有用工具，但對(duì)于本文所有參試材料均無PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，也許與此引物本身穩(wěn)定性、通用性，或本文參試材料遺傳背景有一定關(guān)系。中國(guó)1 BL/1 RS品種大多與洛類，即洛夫林系列品種有關(guān)，根據(jù)《中國(guó)小麥遺傳資源目錄1976—1986，第一分冊(cè)(國(guó)內(nèi)部分)》記載，本試驗(yàn)材料中明顯帶有洛類品用Chai[18]根據(jù)黑麥ω-secalin基因序列設(shè)計(jì)的引物P 15對(duì)其DNA擴(kuò)增，表明其帶有ω-secalin基因，為1 BL/1 RS系材料，與系譜信息一致。所以，與引物P 6、P 14相比，用引物P 15來區(qū)分1 BL/1 RS易位系也許更可靠一些。本研究以引物P 15共篩選出1 BL/1 RS材料50份，占有PCR產(chǎn)物材料157份的31.8%，如品系滇822-852、滇812-244、滇862-39、品種春980、云麥38、云麥51、德麥4號(hào)等?？梢姡? BL/1 RS材料在參試材料中占有相當(dāng)高的比例。但是，這些材料不宜作為優(yōu)質(zhì)小麥育種研究的親本[24]，因?yàn)? BL/1 RS易位系雖然具有矮稈、高抗和豐產(chǎn)等特性[25]，攜帶有抗條銹病基因Yr9、稈銹病基因Sr31、葉銹病基因Lr26和白粉病基因Pm8[26]，然而由于1 RS黑麥堿蛋白使面團(tuán)的吸水性和水溶性增大，造成面團(tuán)發(fā)粘，面筋質(zhì)量下降，使面粉加工品質(zhì)變劣[27-29]。

3.2 同時(shí)攜帶優(yōu)質(zhì)HMW-GS和LMW-GS材料的應(yīng)用前景

根據(jù)Zhang等[7]確定的優(yōu)質(zhì)LMW-GS基因Glu-A3d、Glu-B3b、Glu-B3g和Glu-B3i，本試驗(yàn)篩選出攜帶Glu-A3d、Glu-B3g、Glu-B3i單個(gè)優(yōu)質(zhì)LMW-GS的材料共63份；帶有優(yōu)質(zhì)LMW-GS組合Glu-A3d+Glu-B3g的材料有巧家3號(hào)(云0538)、墨依(云0962)和中作8131(云1217)等3份，帶Glu-A3d+Glu-B3i的材料有滇802-87(云0638)和云麥33(云1260)2份；帶Glu-B3g+Glu-B3i的材料只有綿陽11號(hào)(云0963)1份。結(jié)合廣泛公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)HMW-GS 1、13+16或14+15或17+18和5+10或5+12，篩選出同時(shí)具有優(yōu)質(zhì)高、低分子量麥谷蛋白基因組合的材料4份，如帶有1、17+18、5+12、A3d基因組合的材料滇832-63和昆7808；帶有1、17+18、5+12、B3g基因組合的楚麥9024，帶有13+16、5+12、B3g基因組合的滇801等。這10份優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源，占總參試材料數(shù)的5.6%，比例很小，應(yīng)成為云南小麥優(yōu)質(zhì)品種選育重點(diǎn)研究和利用的親緣材料。其中，中作8131、云麥33號(hào)是優(yōu)質(zhì)面包小麥品種，綿陽11號(hào)是具有廣泛適用性的生產(chǎn)用種。另外，這些優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源材料都是選育品種(系)，不像原始或地方品種具有很多育種研究難以在短時(shí)改良的不良性狀，因而在育種研究中獲得新品種(系)的機(jī)會(huì)相對(duì)更高一些。