李卓琳， 李德志， 毛 爽， 楊 帆， 藺吉祥

(1.上海師范大學(xué)天華學(xué)院， 上海 201815； 2.華東師范大學(xué)生態(tài)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院， 上海 200241；3.上海市城市化生態(tài)過程與生態(tài)恢復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 200241； 4.崇明生態(tài)研究院， 上海 202162；5.自然資源部大都市區(qū)國(guó)土空間生態(tài)修復(fù)工程技術(shù)創(chuàng)新中心， 上海 200062；6.東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院， 黑龍江 哈爾濱 150040)

土壤鹽漬化日趨嚴(yán)峻，已成為世界性難題，嚴(yán)重影響著植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育[1-3]。全球鹽漬化土壤面積約為9.5億hm2，我國(guó)約3 600萬hm2[4-5]。種子發(fā)芽和幼苗形態(tài)建成是植物生活周期中最脆弱也是極為重要的階段[6]。種子作為植物生活史的重要環(huán)節(jié)，對(duì)物種延續(xù)起著至關(guān)重要的作用。種子能否在鹽脅迫條件下萌發(fā)成苗也是植物種群繁衍的前提。由于長(zhǎng)期對(duì)不同鹽濃度環(huán)境的適應(yīng)，同一植物種群也可能會(huì)產(chǎn)生不同的適應(yīng)對(duì)策，從而發(fā)生趨異適應(yīng)[7-8]。種皮不同是趨異適應(yīng)的主要特征，種皮顏色的差異可能導(dǎo)致萌發(fā)時(shí)間、耐鹽性和休眠特性等產(chǎn)生差異，甚至后代的生長(zhǎng)發(fā)育也會(huì)發(fā)生適應(yīng)性變化，這種多樣性在一定程度增強(qiáng)了植物個(gè)體對(duì)多變環(huán)境的適應(yīng)能力[9-10]。

海三棱藨草是莎草科多年生草本植物，也是我國(guó)的特有鹽沼植物，其耐鹽以及耐厭氧環(huán)境的特性使其成為原生裸地上的先鋒植物[7-9]。目前，長(zhǎng)江口是國(guó)內(nèi)海三棱藨草分布面積最大的區(qū)域[10]，但在20世紀(jì)90年代后期，上海地區(qū)圍墾引種了大量的互花米草，而互花米草快速擴(kuò)張，對(duì)海三棱藨草的生境造成了極大的威脅，使得海三棱藨草適宜生存空間越來越窄[11]。另外，海三棱藨草不僅是中國(guó)的特有植物種，同時(shí)棲息在長(zhǎng)江口鹽沼上的二級(jí)保護(hù)動(dòng)物水鳥類也以它的球莖、小堅(jiān)果為食[12]，海三棱藨草種群的退化或喪失可能會(huì)間接導(dǎo)致二級(jí)保護(hù)動(dòng)物更稀少。因此，探究海三棱藨草種子萌發(fā)對(duì)生境關(guān)鍵因子的響應(yīng)是研究其種群恢復(fù)的關(guān)鍵。

目前從事植物生長(zhǎng)發(fā)育及生理特征對(duì)鹽脅迫響應(yīng)的研究中有部分學(xué)者關(guān)注植物的表型可塑性問題[13-14]，因?yàn)橹参镌趹?yīng)對(duì)環(huán)境的改變時(shí)，往往被迫采取相應(yīng)的適應(yīng)對(duì)策，有時(shí)還會(huì)將這種適應(yīng)能力傳遞給后代。有些植物在不同生境中產(chǎn)生的趨異適應(yīng)在再次回到相同環(huán)境時(shí)消失，有些則持續(xù)[15]。前期野外調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，不同生境下的海三棱藨草種子在百粒重等方面有顯著差異，同時(shí)種皮顏色也不一致，具有較為明顯的黃色、褐色和黑色的區(qū)別。不同生境(鹽分不同)下的海三棱藨草種子在相同鹽分處理時(shí)發(fā)芽率是否一致、兩個(gè)生境下不同顏色的種子所占比例是否有差異等諸多適應(yīng)對(duì)策問題還并不明確。因此，本研究通過探索來自兩個(gè)生境的海三棱藨草種子在相同鹽脅迫處理下的發(fā)芽率是否一致，來驗(yàn)證生境差異導(dǎo)致海三棱藨草產(chǎn)生的趨異適應(yīng)在種子發(fā)芽階段是否消失的問題；通過野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)的三種不同顏色海三棱藨草的種子，進(jìn)一步分析長(zhǎng)期生活在兩個(gè)生境下的海三棱藨草種子萌發(fā)的趨異適應(yīng)問題，為恢復(fù)海三棱藨草種群篩選種子提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 野外調(diào)查與處理

供試海三棱藨草種子(百粒重約0.65 g)于2015年和2016年10月末采集于上海崇明東灘鳥類自然保護(hù)區(qū)北部海三棱藨草和海三棱藨草、互花米草混合群落處，簡(jiǎn)稱生境A和生境B。生境A靠近光灘，屬于低潮位，水分足，鹽分低；生境B靠近大堤，屬于中潮位，水分低于生境A而鹽分高于生境A。在兩個(gè)群落處隨機(jī)剪取完整的穗大于等于100個(gè)，每個(gè)穗之間的采集距離至少為3 m。采集好的穗分別裝入信封袋中，做好標(biāo)記，挑選飽滿的種子晾干。

在挑選種子的過程中，發(fā)現(xiàn)種子的顏色有差異，分別為黃色、棕色和黑色(圖1)。將兩個(gè)生境下不同顏色的種子進(jìn)行簡(jiǎn)單清洗后分別浸泡在配置好的4‰NaCl鹽溶液中，置于4 ℃冰箱中冷藏春化，于2017年3月進(jìn)行室內(nèi)種子發(fā)芽實(shí)驗(yàn)。海三棱藨草種子的發(fā)芽溫度設(shè)置為晝/夜溫度分別為18 ℃/28 ℃，低溫8 h，高溫14 h，光照時(shí)長(zhǎng)為14 h。試驗(yàn)處理將NaCl溶液作為鹽度添加成分，分別設(shè)置0、5‰、10‰、15‰和20‰等5個(gè)梯度，每個(gè)處理設(shè)4次重復(fù)(因種子數(shù)量原因，此處生境和鹽分的交互實(shí)驗(yàn)中僅使用棕色種子)。

圖1 不同顏色種子的對(duì)比

1.2 萌發(fā)指標(biāo)測(cè)定

經(jīng)過春化的種子在萌發(fā)實(shí)驗(yàn)之前再進(jìn)行一次篩選，挑選大小基本一致的種子，之后用0.1%的次氯酸鈉溶液浸泡10 min，充分消毒，然后再用蒸餾水沖洗干凈，在自然條件下晾干后備用。

分別取30粒生境A和生境B的棕色海三棱藨草種子均勻平鋪于雙層濾紙的培養(yǎng)皿中進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，培養(yǎng)皿的直徑為12.5 cm。試驗(yàn)初始時(shí)，每皿加入10 mL相應(yīng)的鹽溶液作為處理組，蒸餾水作為對(duì)照組，記錄初始重量，每個(gè)處理重復(fù)4次。之后每天用稱重法補(bǔ)充蒸發(fā)失去的水分以保持鹽濃度的基本恒定。將種皮前端開裂作為判斷種皮開裂的標(biāo)準(zhǔn)，將種皮開裂露白作為判斷種子萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)。每天09：00時(shí)記錄發(fā)芽的種子數(shù)量，試驗(yàn)共進(jìn)行20 d。

種皮開裂率(%)=(種皮開裂的種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

種子發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件處理，生境位置和鹽分的影響采用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)，當(dāng)雙因素交互作用顯著時(shí)，生境位置之間的差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不同濃度鹽分影響的差異采用單因素方差分析，并進(jìn)行多重比較。數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，作圖均應(yīng)用sigmaplot 10.0軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對(duì)兩個(gè)海三棱藨草種群種皮開裂率及種子發(fā)芽率的影響

由表1可知，海三棱藨草所處的生境位置和鹽分及其交互作用均顯著影響種皮的開裂率和種子的萌發(fā)率(p<0.05)。海三棱藨草種子在鹽分濃度為15‰和20‰時(shí)種子的發(fā)芽率為0。在10‰時(shí)僅有6.7%的種子種皮開裂，但仍然沒有種子發(fā)芽，表明鹽分是限制海三棱藨草種子萌發(fā)的主要因素，而生境B種子的發(fā)芽率要高于生境A，這可能是長(zhǎng)期生長(zhǎng)在生境A和生境B環(huán)境下的海三棱藨草產(chǎn)生了不同的發(fā)芽適應(yīng)對(duì)策。

表1 鹽脅迫和生境位置對(duì)海三棱藨草種子萌發(fā)的影響

由圖2可得，2015年種皮的開裂率及種子的萌發(fā)率均高于2016年。2015和2016年，兩生境下海三棱藨草種皮的開裂比例和發(fā)芽率均隨著鹽濃度的升高而顯著降低。

圖2 鹽脅迫對(duì)不同生境位置的海三棱藨草種子發(fā)芽進(jìn)程的影響

在相同鹽濃度條件下，生境A的海三棱藨草種皮開裂比例和種子萌發(fā)率均低于生境B的種子。2015年采回的種子在鹽濃度為0和5‰時(shí)，生境B的海三棱藨草種皮開裂率分別比生境A的高20%和207.2%，而種子萌發(fā)率比生境A的高約10倍(p<0.05)。在鹽濃度為10‰時(shí)雖有6.7%的種皮開裂，但已完全停止發(fā)芽。2016年采集回的種子在鹽濃度為0時(shí)，生境B的海三棱藨草種皮開裂率比生境A的高12.5%，而在鹽濃度為5‰時(shí)種皮開裂比率為0，但種子萌發(fā)率比生境A的高166.7%和100%(p<0.05)。以上結(jié)果表明，生境A和生境B的種子即使在相同的鹽濃度下種皮裂開率和種子發(fā)芽率的差異并沒有消失，生境B的種皮開裂比例和種子萌發(fā)率都高于生境A，且生境B的種子更耐鹽。隨著鹽濃度的升高，即使種皮開裂，種子萌發(fā)的比率也明顯降低。

2.2 兩個(gè)生境不同顏色種子比例及種皮顏色對(duì)海三棱藨草種皮開裂率、種子發(fā)芽率的影響

如圖3所示，生境A和生境B的海三棱藨草種群中都有黃、棕、黑3種顏色的種子，綜合年份分析，3種顏色種子占采集種子總數(shù)的比例在年際間差異不大，但不同顏色種子在兩個(gè)種群中所占的比例差異較大，其中生境A的黃色種子在2015年比生境B的多131.8%，在2016年比生境B的多159.8%；而生境A的棕色種子在2015年比生境B的減少了23.9%，在2016年比生境B的減少了29.5%；生境A 的黑色種子的比例也有所降低，分別比生境B的減少了62.5%和 50.2% (圖3)。這可能是生境A的黃色種子占主導(dǎo)，而生境B中棕色種子占主導(dǎo)地位且黑色種子也顯著增加。因此，可以得出生境B黑色種子所占比例高于生境A。

圖3 生境對(duì)不同顏色種子所占比例的影響

由圖4所得，黑色種子種皮的開裂率大于棕色種子和黃色種子，但種皮顏色對(duì)種皮開裂的比率影響并未達(dá)到顯著水平(p>0.05)。然而黑色種皮種子的發(fā)芽率比棕色種子和黃色種子顯著高42.5%和50%，黃色種子和棕色種子萌發(fā)率差異并不顯著(p>0.05)。

注：小寫字母代表不同種皮顏色對(duì)種子的發(fā)芽率具有顯著效應(yīng)。

3 討 論

植物種子在萌發(fā)階段往往會(huì)受到一系列環(huán)境因素共同的影響，植物一方面利用種子萌發(fā)可以擴(kuò)張植物種群的分布范圍，另一方面還可以保證種群基因多樣性。一般來說，鹽生植物對(duì)鹽分具有較好的耐受性，土壤中鹽分產(chǎn)生的滲透脅迫及有毒離子(如過量的Na+)產(chǎn)生的離子效應(yīng)都會(huì)抑制種子萌發(fā)，并且是抑制種子萌發(fā)的關(guān)鍵因素[16-17]。微地形的變化也會(huì)造成水分和表土鹽度的明顯差異[18]。例如，在上海崇明東灘的一定高程內(nèi)，隨著高程的增加，土壤的含水量逐漸減少而鹽度增加。鹽生植物為適應(yīng)動(dòng)蕩的環(huán)境而產(chǎn)生不同形態(tài)的種子，且種子的發(fā)芽率也完全不同[19]。

本研究結(jié)果表明，海三棱藨草種子的萌發(fā)率隨著處理鹽濃度的升高而降低。此外在超過10‰鹽分處理的條件下，種皮雖然開裂，但種子并未萌發(fā)，這說明鹽分是影響海三棱藨草種子萌發(fā)的主要因素之一。海三棱藨草雖然為鹽生植物，但其多生長(zhǎng)在低潮位(生境A)，水分多鹽分相對(duì)低，所以它的原生環(huán)境鹽分濃度也不足5‰，結(jié)果也表明海三棱藨草種子的萌發(fā)率在無鹽分處理時(shí)最高，而在5‰時(shí)已顯著降低，在10‰時(shí)基本失去萌發(fā)能力，這與Van等[20]的研究結(jié)果相一致。

在野外條件下，隨著高程的增加，水分減少而鹽分增加，海三棱藨草主要生長(zhǎng)在低潮位，部分在中潮位和互花米草生長(zhǎng)在一起，這可能是因?yàn)楹Ｈ馑懖莸柠}敏感性導(dǎo)致它向高程高的區(qū)域擴(kuò)張極為困難，所以海三棱藨草主要在低潮位生長(zhǎng)，少量在中潮位和入侵物種互花米草生長(zhǎng)在一起。但也因海三棱藨草長(zhǎng)期生活在不同的環(huán)境，它們?cè)谝巴獾纳L(zhǎng)情況也不相同。生境A的海三棱藨草長(zhǎng)勢(shì)整體優(yōu)于生境B。

眾所周知，同一植物長(zhǎng)期生活在不同生境會(huì)發(fā)生趨異適應(yīng)，這能在一定程度上降低其在異質(zhì)生境下承受的環(huán)境壓力，維持一定的適合度，這種以生理反應(yīng)為基礎(chǔ)的可塑性反應(yīng)通常能在短時(shí)間內(nèi)逆轉(zhuǎn)，也不會(huì)對(duì)物種的適應(yīng)性進(jìn)化產(chǎn)生影響[15]。但現(xiàn)有研究也發(fā)現(xiàn)，雖然植物短時(shí)間內(nèi)受到環(huán)境脅迫時(shí)植物表型的應(yīng)答反應(yīng)會(huì)隨著脅迫的結(jié)束而消失，但在長(zhǎng)時(shí)間的脅迫下，植物可能會(huì)將這種適應(yīng)對(duì)策能力遺傳給子代，因此如果發(fā)生趨異適應(yīng)的植物在相同環(huán)境下的差異沒有消失，這可能意味著植物在長(zhǎng)期適應(yīng)的過程中發(fā)生了適應(yīng)性進(jìn)化，而不僅僅是對(duì)環(huán)境的響應(yīng)。Vu等[21]證明了來自鹽生和非鹽生環(huán)境苜蓿后代種子發(fā)芽的跨世代可塑性。本研究結(jié)果顯示，海三棱藨草不僅在不同鹽濃度下表現(xiàn)出差異，兩個(gè)生境間也表現(xiàn)出顯著差異(表1)，這表明取自兩個(gè)生境的種子即使在相同的鹽濃度下，種皮的開裂比例和種子發(fā)芽率也有所不同，因此在種子發(fā)芽這一部分印證了生長(zhǎng)在兩個(gè)生境下的海三棱藨草在種子發(fā)芽階段的差異并未消失，且在鹽分為5‰時(shí)，生境B的種子發(fā)芽率顯著高于生境A,這與它們?cè)谝巴庵仓甑纳L(zhǎng)環(huán)境一致。

本研究中生境A位于低潮位，經(jīng)受水淹的概率高于生境B，但是鹽分卻小于生境B，王亮等[22]研究也指出，海三棱藨草對(duì)抗水淹的能力要高于耐鹽的能力。另外，海三棱藨草屬于克隆植物，克隆植物在不同生境下會(huì)權(quán)衡有性和無性繁殖以達(dá)到最大的適合度。生境B的擾動(dòng)更強(qiáng)，雖然種子少但是發(fā)芽率卻相對(duì)較高，這也是有性繁殖成功的原因之一。王亮等[22]指出，海三棱藨草在密度高、競(jìng)爭(zhēng)壓力大的條件下基本放棄有性繁殖，將更多的能量用于無性繁殖，而相反地在密度相對(duì)低、競(jìng)爭(zhēng)壓力小的條件下有性繁殖。而張大勇等[23]指出，克隆植物在環(huán)境適宜時(shí)往往采用無性繁殖，而在火燒、干旱等環(huán)境波動(dòng)較大的生境中會(huì)將更多的能量投資在有性繁殖上，因?yàn)榉N子進(jìn)入種子庫(kù)可休眠潛伏多年，在環(huán)境適宜時(shí)重新萌發(fā)生長(zhǎng)，以維持種群的延續(xù)。本研究取樣的兩個(gè)生境分別位于低潮位(生境A)和中潮位(生境B)，生境A是海三棱藨草的主要分布區(qū)域，生境B是海三棱藨草和入侵物種互花米草的混合群落交錯(cuò)區(qū)，但是互花米草的地上部在取樣當(dāng)年已被機(jī)器打掉，但地下部的根莖并沒有消失，所以物種間的競(jìng)爭(zhēng)仍然存在，生境B的海三棱藨草種子發(fā)芽率要高于生境A, 這也支持了張大勇等[24]的研究結(jié)果。因此推測(cè)自然條件下產(chǎn)生的差異在海三棱藨草的種子發(fā)芽階段并未消失，相關(guān)遺傳學(xué)的試驗(yàn)在進(jìn)一步驗(yàn)證中。

種皮的顏色是鹽生植物對(duì)環(huán)境異質(zhì)性的一種重要適應(yīng)方式，又稱之為種子的多態(tài)性，鹽生植物通常產(chǎn)生黑色和褐色兩種顏色的種子[24-25]，且各種形態(tài)的種子所占的比例也不同。產(chǎn)生不同形態(tài)種子的物種多定居于擾動(dòng)比較強(qiáng)烈、環(huán)境惡劣的環(huán)境，逆境脅迫會(huì)給植株造成強(qiáng)大的選擇壓力，迫使種子發(fā)生變異以提高對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力和種群繁殖的成功率，這也是植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中逐漸演變出來的對(duì)策[26]。海三棱藨草作為先鋒種，經(jīng)歷潮汐作用造成的水淹以及鹽分等脅迫因子，所以也和很多鹽生植物一樣產(chǎn)生不同顏色的種子。

本研究結(jié)果顯示，生境A的黃色種子所占比例最高，生境B的棕色種子所占比例最高，黑色種子雖然占比少，但是生境B的黑色種子所占比例顯著高于生境A，且后續(xù)的發(fā)芽實(shí)驗(yàn)也顯示出黑色種子的發(fā)芽率是最高的。此外，在比較兩個(gè)生境對(duì)相同鹽脅迫的響應(yīng)差異是否消失時(shí)，本研究均采用量比較多的棕色種子，而生境B的棕色種子發(fā)芽率也高于生境A。上述結(jié)果表明，生境B的種子發(fā)芽率高于生境A，生境B的海三棱藨草也產(chǎn)生更多的黑色種子來提高其發(fā)芽率，所以無論是在提高高發(fā)芽率顏色種子的比例上，還是在提高種子耐鹽性上，生境B的海三棱藨草都優(yōu)于生境A，這可能是海三棱藨草長(zhǎng)期生活在生境B產(chǎn)生的適應(yīng)性策略。

4 結(jié) 論

海三棱藨草種子隨著鹽濃度的升高萌發(fā)率逐漸降低，最后為0，清水對(duì)照組發(fā)芽率最高，在10‰的鹽濃度下僅有種皮開裂但并沒有種子發(fā)芽，這表明鹽分是限制海三棱藨草種子萌發(fā)的主要因素之一。

生境A和生境B的海三棱藨草種子(棕色)即使在相同的鹽脅迫處理下差異也并沒有消失，生境B的種子發(fā)芽率高于生境A，且生境B的種子耐鹽性高于生境A的種子。這可能是海三棱藨草種子發(fā)芽階段在長(zhǎng)期適應(yīng)的過程中發(fā)生了適應(yīng)性進(jìn)化，而不僅僅是對(duì)環(huán)境的短期響應(yīng)。

生境B的黑色種子占比顯著高于生境A,且黑色種子的萌發(fā)率要高于黃色和棕色種子，所以生境B海三棱藨草種子無論是在提高高發(fā)芽率顏色種子的比例上，還是在提高種子耐鹽性上，生境B的海三棱藨草種子都優(yōu)于生境A。因此，想利用種子恢復(fù)海三棱藨草種群，可以盡量選擇深色且耐鹽性更高的生境B的種子。