趙蕾，李娟

(1.十堰市太和醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，十堰 442000；2.十堰市婦幼保健院產(chǎn)科，十堰 442000)

男性不育具有復(fù)雜性和多樣性特點(diǎn)，精子發(fā)生、成熟、輸送任意環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題均可引起男性不育[1]。少弱精子癥指精子濃度且活力低于參考值下限，其在男性不育中約占46%[2]。隨著男科學(xué)研究進(jìn)展及人類基因組計(jì)劃完成，不少學(xué)者已關(guān)注到基因多態(tài)性與少弱精子癥的關(guān)系[3]。亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是一種葉酸與同型半胱氨酸(Hcy)代謝中重要的黃素依賴酶，可通過介導(dǎo)5，10-亞甲基四氫葉酸向5-甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)變，參與DNA合成、修復(fù)及DNA甲基化過程[4]。MTHFR基因有二十多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中以MTHFR基因C677T多態(tài)性常見，其C→T突變可引起MTHFR耐熱性及活性降低[5]。研究指出，MTHFR活性降低可限制體內(nèi)Hcy向甲硫氨酸的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致血清Hcy水平升高，而Hcy具有細(xì)胞毒性，在人類心腦血管疾病、免疫相關(guān)疾病等多種疾病的發(fā)生中占重要地位[6]。既往研究顯示，MTHFR基因C677T多態(tài)性可能通過介導(dǎo)高Hcy血癥參與冠脈病變[7]。目前關(guān)于MTHFR基因C677T多態(tài)性、血清Hcy水平與少弱精子癥患者的不育關(guān)系尚無定論，本研究通過探究少弱精子癥患者M(jìn)THFR基因C677T多態(tài)性及血清Hcy水平變化，分析二者與精液質(zhì)量相關(guān)性，旨在為該類人群的臨床診療提供參考。

資料與方法

一、研究對象

選取2019年4月至2021年4月于十堰市太和醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心就診的少弱精子癥不育男性102例，設(shè)為研究組。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)夫婦婚后同居≥1年，正常性生活未避孕下不育，且排除女方因素；(2)2次檢查(間隔時(shí)間≥2周)均提示精液中精子濃度<20×106/ml、精子活力(a級(jí)+b級(jí))<50%且a級(jí)<25%；(3)年齡22～45歲；(4)無特殊既往史、家族史。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)生殖器發(fā)育異常者；(2)染色體核型異常者；(3)合并隱睪、嚴(yán)重精索靜脈曲張、附睪損傷、生殖系統(tǒng)感染等已知可能影響精液質(zhì)量的疾?。?4)合并嚴(yán)重心腦血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫相關(guān)疾??；(5)近期有影響生精藥物服用。

另選取同期80例育前檢查正常的男性為對照組，對照組連續(xù)2次精液質(zhì)量均正常，排除標(biāo)準(zhǔn)同研究組。該研究已通過倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署知情同意書。

二、研究方法

1.MHTFR基因型檢測：EDTA-2Na抗凝管收集患者空腹肘靜脈血4 ml，混勻后于-70℃保存?zhèn)溆谩Ｈ±鋬鰳颖居?7℃水浴下復(fù)融，采用全血基因組DNA提取試劑盒(溶液型，上海索萊寶生物)提取基因組DNA，采用紫外分光光度計(jì)檢測基因組DNA純度，OD260/280比值1.8～2.0間視為DNA溶液純度佳。PCR反應(yīng)進(jìn)行目的基因擴(kuò)增，上游引物序列5’-CAGTCCCTGTGGTCTCTCTTCAT-3’、下游5’-CTCACCTGGATGGGAAA-GAT-3’，引物設(shè)計(jì)及合成由上海生工生物工程有限公司完成。PCR反應(yīng)體系共25 μl，包括基因組DNA 1 μl、上下游引物(100 mmol/L)各1 μl、Taq DNA聚合酶(5 U/μl)0.125 μl、10×PCR buffer 2.5 μl、dNTP(2.5 mmol/L)2 μl、補(bǔ)充去離子水至總體積25 μl。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)熱3 min，94℃變性30 s、57℃退火30 s、72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃終延伸5 min。采用ABI 3500dx型測序儀(AB公司，美國)進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測序分析，由上海生工生物工程有限公司完成，依據(jù)相關(guān)基因位點(diǎn)比對結(jié)果分為野生型(CC型)、雜合突變型(CT型)、純合突變型(TT型)。

2.血清Hcy檢測：采集患者空腹靜脈血2 ml，經(jīng)3 000 rpm離心10 min分離血清，應(yīng)用AU-2700型全自動(dòng)生化分析儀(OLYMPUS，日本)，采用酶循環(huán)法檢測Hcy水平，檢測步驟嚴(yán)格按試劑盒(上海信裕生物科技)說明書操作。

3.精液檢測：研究對象禁欲3～7 d后，通過手淫方式收集精液標(biāo)本，充分液化后，采用精子自動(dòng)檢測分析系統(tǒng)(ZKPACS-E型，北京中科恒業(yè)科技)行精液常規(guī)分析，包括精子總數(shù)、精子濃度、精子總活力及前向運(yùn)動(dòng)精子百分率。采用精子染色質(zhì)擴(kuò)散法(SCD法，深圳博銳德生物)檢測精子DNA碎片指數(shù)(DFI)，操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行，檢測結(jié)果于400倍鏡下觀察，根據(jù)光暈有無及大小評價(jià)精子DNA碎片化情況，其中無光暈或小光暈(即精子頭直徑≤1/4)視為精子DNA斷裂為碎片。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般資料比較

兩組研究對象間年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、睪丸體積(左、右)、末次排精時(shí)間、精液酸堿度、吸煙史等基本資料的比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 一般資料比較[(-±s)，%]

二、MTHFR基因C677T多態(tài)性基因型及等位基因頻率分布比較

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，研究組與對照組MTHFRC667T基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.705，P<0.05)；研究組CC型頻率、C等位基因頻率顯著低于對照組，而T等位基因頻率顯著高于對照組(P<0.05)(表2)。

表2 MTHFR基因C677T多態(tài)性基因型及等位基因頻率分布比較[n(%)]

三、MTHFR基因C677T多態(tài)性與少弱精子癥易感性關(guān)系

調(diào)整年齡、BMI、吸煙史后，攜帶MTHFRC667T TT基因型、CT基因型男性少弱精子癥易感性分別是CC型的4.152倍[95%CI(1.331，12.768)]、2.001倍[95%CI(1.126，3.875)]；攜帶MTHFR基因C677T的T等位基因是C等位基因的1.902倍[95%CI(1.175，2.948)](表3)。

表3 MTHFR基因C677T多態(tài)性與少弱精子癥易感性關(guān)系

四、血清Hcy水平及精液質(zhì)量比較

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，研究組血清Hcy水平及DFI水平均顯著高于對照組(P<0.05)，精子總數(shù)、精子濃度、精子總活力、前向精子運(yùn)動(dòng)率均顯著低于對照組(P<0.05)(表4)。

表4 兩組血清Hcy水平及精子質(zhì)量比較(-±s)

五、不同基因型患者血清Hcy水平及精液質(zhì)量比較

將102例少弱精子癥患者按基因型分組，比較不同MTHFRC667T基因型患者血清Hcy水平及精液質(zhì)量指標(biāo)的差異。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，不同基因型間的血清Hcy水平及精液質(zhì)量指標(biāo)均有顯著性差異(P<0.05)，其中血清Hcy水平、DFI水平均表現(xiàn)為TT型>CT型>CC型(P<0.05)，精子總數(shù)、精子濃度、精子總活力、前向精子運(yùn)動(dòng)率均表現(xiàn)為TT型

表5 不同基因型患者血清Hcy水平及精子質(zhì)量比較(-±s)

六、少弱精子癥患者Hcy水平與精液質(zhì)量相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析顯示，少弱精子癥患者血清Hcy水平與精子總數(shù)(r=-0.277)、精子濃度(r=-0.446)、精子總活力(r=-0.528)、前向精子運(yùn)動(dòng)率(r=-0.495)均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與DFI呈正相關(guān)(r=0.671，P<0.05)。

討 論

精子作為男性生殖的最終效應(yīng)細(xì)胞，其數(shù)量多少、活力高低可決定受精成功與否，而精子的發(fā)生受多基因相互作用調(diào)控，探究相關(guān)基因遺傳多態(tài)性能一定程度上解釋精子發(fā)生障礙和男性不育機(jī)制[8]。MTHFR作為葉酸與Hcy代謝中的重要酶，可介導(dǎo)5，10-亞甲基四氫葉酸還原為5-甲基四氫葉酸，前者與DNA合成、修復(fù)關(guān)聯(lián)密切，后者可為DNA甲基化反應(yīng)提供原料[9]。MTHFR基因定位于染色體lp36.3，目前已發(fā)現(xiàn)該基因20多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中與疾病相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)報(bào)道也越來越多[10]。MTHFR基因C677T是常見多態(tài)性位點(diǎn)，位于MTHFR催化區(qū)，當(dāng)該位點(diǎn)胞嘧啶(C)為胸腺嘧啶(T)替代后，編碼的丙氨酸由纈氨酸取代，并產(chǎn)生一個(gè)Hinfl和Taql限制性酶切位點(diǎn)，可引起MTHFR耐熱性、活性降低[11]。MTHFRC667T基因型分布頻率在不同國家、不同地區(qū)及不同種族之間均存在差異[12]。本文研究發(fā)現(xiàn)，研究組CC型、C等位基因頻率較對照組低，T等位基因頻率較對照組高，提示MTHFRC667T基因多態(tài)性可能與少弱精子癥發(fā)生有關(guān)。調(diào)整年齡、BMI、吸煙史后，發(fā)現(xiàn)TT基因型、CT基因型少弱精子癥風(fēng)險(xiǎn)分是CC型的4.152倍、2.001倍，攜帶MTHFR基因C677T的T等位基因易感性升高1.902倍，提示TT型、CT型是少弱精子癥的易感基因型，T等位基因是其易感基因。推測原因，MTHFRC667T發(fā)生T等位基因突變后，使得MTHFR結(jié)構(gòu)及功能異常，可介導(dǎo)DNA基因甲基化紊亂，而DNA甲基化作為人類精子發(fā)生過程中重要的調(diào)控機(jī)制之一，其紊亂可導(dǎo)致基因無法正確表達(dá)，引起精子發(fā)生障礙[13]。有文獻(xiàn)報(bào)道[14]，MTHFR缺乏雄性小鼠可檢出精子中印記基因甲基化紊亂，導(dǎo)致小鼠生精障礙及不育，該結(jié)論也間接支持本研究結(jié)果。

Hcy是甲硫氨酸循環(huán)代謝中間產(chǎn)物，MTHFRC667T表達(dá)為TT或CT型時(shí)，可引起5，10-亞甲基四氫葉酸向5-甲基四氫葉酸還原過程障礙，使得Hcy代謝中甲基減少，Hcy再甲基化生成甲硫氨酸也隨之下降，最終引起Hcy在體內(nèi)堆積[15]。高Hcy具有細(xì)胞毒性，可通過介導(dǎo)氧自由基生成、精子氧化應(yīng)激損傷、睪丸動(dòng)脈血管硬化等機(jī)制參與少弱精子癥發(fā)生[16]。本研究顯示，研究組血清Hcy水平顯著高于對照組，且不同MTHFRC667T基因型患者血清Hcy水平差異顯著，表現(xiàn)為TT型>CT型>CC型。由此可見，MTHFRC667T基因多態(tài)性可能通過介導(dǎo)高Hcy血癥影響精液質(zhì)量。DFI是反映精子DNA完整性的指標(biāo)，其水平越高，提示精子DNA損傷越嚴(yán)重，精液質(zhì)量也越差[17]。本文結(jié)果顯示，MTHFRC667T TT型、CT型精子總數(shù)、精子濃度、精子總活力、前向精子運(yùn)動(dòng)率較CC型下降，DFI水平升高，而Hcy水平與精子總數(shù)、精子濃度、精子總活力、前向精子運(yùn)動(dòng)率均呈負(fù)相關(guān)，與DFI呈正相關(guān)，提示MTHFRC667T基因多態(tài)性、Hcy水平均與精液質(zhì)量有關(guān)，結(jié)合前文結(jié)果，也驗(yàn)證了MTHFRC667T基因多態(tài)性通過影響Hcy水平來影響精液質(zhì)量這一推論。本研究提示臨床，應(yīng)重視少弱精子癥不育患者M(jìn)THFRC667T基因多態(tài)性及Hcy水平檢測，對高風(fēng)險(xiǎn)基因型、高Hcy水平男性可針對性予以相關(guān)干預(yù)如補(bǔ)充葉酸、核黃素等以降低Hcy水平，或許對提高患者精液質(zhì)量有積極意義，值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，MTHFRC677T基因多態(tài)性與少弱精子癥男性不育有關(guān)，其中TT型、CT型是易感基因型，T等位基因是易感基因，其機(jī)制之一可能是通過高Hcy血癥途徑影響精液質(zhì)量，導(dǎo)致男性不育。重視MTHFRC677T基因多態(tài)性相關(guān)檢測及針對性干預(yù)可能對少弱精子癥治療、實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育有積極意義。