曹 靜

(商丘師范學(xué)院 生物與食品學(xué)院,河南 商丘 476000)

臨床上腫瘤的傳統(tǒng)治療方式對(duì)正常細(xì)胞具有很大損傷性,在用藥過程中會(huì)產(chǎn)生較大的副作用；另外傳統(tǒng)抗腫瘤藥物由于長(zhǎng)時(shí)間使用而形成的耐藥性問題也亟待解決.針對(duì)腫瘤治療中藥物產(chǎn)生的毒副作用和耐藥性問題,開發(fā)減毒增效的新型抗腫瘤藥物已經(jīng)成為發(fā)展趨勢(shì)[1-3].

抗菌肽是一類具有廣譜抗細(xì)菌、真菌和部分病毒能力的小分子多肽[4],其中陽(yáng)離子型抗菌肽還具有抗腫瘤效果,如蜂毒素(melittin),Tachyplesin I(鱟素I),天蠶素A 和 B等[5,6],進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)某些抗菌肽不僅可以特異性抑制某些腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),而且對(duì)正常細(xì)胞損傷小,該特性為尋找新型抗癌藥物帶來新的方向[7,8].Melittin來源于蜂毒,具有很高的生物學(xué)活性和藥理作用,具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤[9,10]等作用,但Melittin具有的溶血性限制了它在腫瘤治療上的應(yīng)用.

近年來腫瘤的靶向治療成為研究熱點(diǎn),靶向治療可以克服傳統(tǒng)治療存在的弊端.靶向藥物通過特異性結(jié)合到腫瘤細(xì)胞上,針對(duì)性的殺死腫瘤細(xì)胞同時(shí)降低對(duì)正常組織和細(xì)胞的損傷.研究表明運(yùn)用靶向抗腫瘤藥物[11,12],可以改善抗腫瘤藥物的選擇毒性,提高抗腫瘤藥物的治療效果.本研究根據(jù)抗菌肽Melittin序列特點(diǎn)選擇連接的靶向肽具有分子量小、特異性強(qiáng)、免疫反應(yīng)性低的特點(diǎn),從而達(dá)到減毒增效的目的[13-15].

ELISA和流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)顯示PC型小肽中的PC94、肝癌細(xì)胞具有最高的結(jié)合活性,并且PC94在正常細(xì)胞中不存在,多肽SP94與肝癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的結(jié)合活性,可競(jìng)爭(zhēng)性抑制PC94與肝癌細(xì)胞的結(jié)合,因此SP94可作為肝癌細(xì)胞的靶向多肽[16].

整合素avP3受體是一種在腫瘤組織新生血管內(nèi)皮細(xì)胞膜和多種惡性腫瘤細(xì)胞表面均有高表達(dá),而在絕大多數(shù)正常器官系統(tǒng)和成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞不表達(dá)的腫瘤標(biāo)志物[17].RGD多肽(精氛酸-甘氨酸-天冬氣酸Arg-Gly-Asp)能夠結(jié)合腫瘤細(xì)胞或者新生血管特異表達(dá)的整合素avβ3受體,從而能夠?qū)⑺幬锇邢蛐詫?dǎo)入腫瘤部位,達(dá)到降低對(duì)正常組織細(xì)胞的損害,提高治療效果的目標(biāo)[14].

本研究選擇了兩種靶向肽SP94、RGD分別與melittin連接,對(duì)比了melittin連接兩者后抗腫瘤性和溶血性變化,對(duì)不同靶向肽連接多肽后生物活性的變化情況進(jìn)行探討和分析.

1 材料與方法

1.1 材料

(1)細(xì)胞與培養(yǎng)基：人宮頸癌細(xì)胞(Hela)、人肝癌細(xì)胞(HepG2)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；MEM、NEAA(Hyclone)、DMEM購(gòu)自南京生興生物技術(shù)公司,胎牛血清(Millipore)購(gòu)自南京福麥斯公司；細(xì)胞培養(yǎng)液為10% FBS,90% DMEM(MEM).

(2)多肽：melittin、SP94-melittin、RGD-melittin多肽由上海安馳生物技術(shù)公司合成.

melittin、SP94-melittin、RGD-melittin多肽序列見表1：

表1 melittin、SP94-melittin、RGD-melittin多肽序列

(3)主要實(shí)驗(yàn)試劑：Triton-100、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自南京鼎國(guó)生物技術(shù)公司；JC-1凋亡細(xì)胞線粒體膜電位試劑盒、流式細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自南京優(yōu)寧維生物技術(shù)公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

(1)細(xì)胞培養(yǎng)：Hela、HepG2于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng),細(xì)胞培養(yǎng)箱條件為 37 ℃,5% CO2.

(2)細(xì)胞鋪板加藥試驗(yàn)：調(diào)整細(xì)胞密度達(dá)到2×105/mL,鋪12孔板,置培養(yǎng)箱中過夜.次日孔內(nèi)加入0、1、2、4、7、10 μM的藥物濃度刺激細(xì)胞24 h,反應(yīng)結(jié)束后開始進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn).

(3)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況：首先使用胰酶消化細(xì)胞,800 rpm,離心5 min,棄上清收集細(xì)胞于離心管,接著加入Binding buffer 195 μL和AV染料5 μL,振蕩混勻后室溫放置10 min,注意避光；反應(yīng)結(jié)束后每管內(nèi)再加入Binding buffer 190 μL和PI染料 10 μL,振蕩混勻后冰上放置于流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè).

(4)檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位變化情況：取1 mL細(xì)胞懸液,800 rpm,5 min,離心后棄上清.管內(nèi)加入0.5 mL JC-1工作液,充分混勻,放置于培養(yǎng)箱(37 ℃,5% CO2)10 min.洗滌細(xì)胞：每管加2 mL 1× Assay Buffer,懸浮細(xì)胞,800 rpm,5 min,離心后棄上清,重復(fù)一次；洗滌后各管加入1× Assay Buffer 0.5 mL于流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè).

(5)溶血試驗(yàn)：準(zhǔn)備1 mL采集的血液,加入10 mM PBS,1000 rpm,15 min,去上清,多次洗滌至上清澄清.離心去上清后,取500 μL,加24.5 mL 10 mM PBS,混勻,制成血液制品.取500 μL制備好的血液樣品置于水浴鍋中37 ℃孵育15 min,然后加入500 μL待測(cè)品,同時(shí)制備陽(yáng)性對(duì)照組(Triton-100)和陰性對(duì)照組(PBS組),37 ℃水浴鍋孵育1 h.溶血率計(jì)算：

注：于OD 540處檢測(cè)吸光度值

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS方差分析程序?qū)?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示.

2 結(jié)果

2.1 melittin,SP94-melittin 和RGD-melittin促HepG2細(xì)胞凋亡情況

靶向肽SP94和RGD對(duì)肝癌細(xì)胞都具有較高的結(jié)合活性,將抗菌肽melittin分別與其連接,比較Melittin、SP94-melittin和RGD-melittin促肝癌細(xì)胞HepG2凋亡情況的差異性,以此分析靶向肽的不同對(duì)抗菌肽抗腫瘤性的影響.

圖1 (A)顯示不同濃度melittin作用HepG2細(xì)胞24 h后細(xì)胞調(diào)亡情況：10 μM melittin 誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡率接近83%,誘導(dǎo)的凋亡率隨濃度增加而升高；圖1(B)顯示隨SP94-melittin劑量的增加,HepG2細(xì)胞凋亡率有所增加,但上升較為緩慢；圖1(C)顯示2 μM RGD-melittin作用24 h后,HepG2即有25%凋亡率；當(dāng)濃度達(dá)到4 μM時(shí),凋亡率達(dá)到51%；濃度為7、10 μM時(shí),凋亡率分別為62%、90%,凋亡百分率隨著劑量的增加而提高.

比較melittin,SP94-melittin 和RGD-melittin促HepG2細(xì)胞凋亡情況(見圖1(D))：三者在低濃度1、2 μM時(shí),HepG2細(xì)胞凋亡率區(qū)別不大；當(dāng)濃度增加到4 μM時(shí),差異性開始明顯,RGD-melittin、melittin、SP94-melittin細(xì)胞凋亡率分別為51%、31%和24%；而當(dāng)濃度增加到7 μM,RGD-melittin與melittin細(xì)胞凋亡率分別為62%、53%,兩者差距縮小,而SP94-melittin細(xì)胞凋亡率僅為26%,與4 μM相比較區(qū)別不大；當(dāng)濃度增大到10 μM,melittin與RGD-melittin細(xì)胞凋亡率分別為90%、83%,而SP94-melittin較低為60%；從以上結(jié)果可以看出SP94-melittin促HepG2細(xì)胞凋亡效果明顯低于melittin和RGD-melittin；而RGD-melittin效果強(qiáng)于melittin(P<0.01).

(A)melittin促HepG2細(xì)胞凋亡情況 (B)SP94-melittin促HepG2細(xì)胞凋亡情況 (C)RGD-melittin促HepG2細(xì)胞凋亡情況 (D)melittin,SP94-melittin和RGD-melittin促HepG2細(xì)胞凋亡情況；數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,n=3,p < 0.01圖1 melittin,SP94-melittin 和RGD-melittin促HepG2細(xì)胞凋亡情況

2.2 melittin,SP94-melittin 和RGD-melittin促Hela細(xì)胞凋亡情況

為進(jìn)一步證明melittin的抗腫瘤效果及驗(yàn)證RGD的靶向性,本研究選用Hela細(xì)胞作為模式細(xì)胞.由圖2 (A)可見,4 μM melittin可以誘導(dǎo)Hela細(xì)胞產(chǎn)生明顯凋亡(P<0.01),而且凋亡比例隨濃度的增加而逐漸增大.圖2 (B)顯示SP94-melittin在1 μM、2 μM、4 μM低濃度時(shí),Hela細(xì)胞凋亡率較低；在高濃度10 μM時(shí),作用24 h后誘導(dǎo)Hela細(xì)胞大部分凋亡；SP94-melittin組凋亡率在高濃度處較為明顯.由圖2(C)可見1 μM、2 μM的 RGD-melittin凋亡率相差不大；4 μM RGD-melittin 24h誘導(dǎo)Hela細(xì)胞產(chǎn)生明顯的凋亡(P<0.01),隨著劑量的增加,凋亡百分率升高.

(A)melittin促Hela細(xì)胞凋亡情況 (B)SP94-melittin促Hela細(xì)胞凋亡情況 (C)RGD-melittin促Hela細(xì)胞凋亡情況 (D)melittin,SP94-melittin和RGD-melittin促Hela細(xì)胞凋亡情況；數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,n=3,p < 0.01圖2 melittin,SP94-melittin 和RGD-melittin促Hela細(xì)胞凋亡情況

從圖2(D)比較melittin、SP94-melittin和RGD-melittin促Hela細(xì)胞凋亡情況：在低濃度1 μM、2 μM時(shí),三者凋亡情況相似；而當(dāng)濃度升至4 μM,melittin和RGD-melittin約為45%左右,SP94-melittin約為26%與低濃度相比變化不大；當(dāng)濃度增加到7 μM,從高到低依次為RGD-melittin(92%)、melittin(54%)、SP94-melittin(35%),三者差別較大；在10 μM處差距縮小,從高到低依次為RGD-melittin(92%),melittin(84%),SP94-melittin(74%).4 μM 的melittin與RGD-melittin即有明顯的抗腫瘤性,而 SP94-melittin作用較弱；隨濃度提高,RGD-melittin表現(xiàn)最為顯著,在7 μM濃度時(shí)凋亡率即達(dá)到92%,超出melittin 38%,SP94-melittin 57%,差異極顯著(P<0.01)；

根據(jù)以上結(jié)果本研究可以得出,連接有靶向肽SP94的melittin促凋亡效果在HepG2、Hela細(xì)胞上明顯低于單獨(dú)的melittin和RGD-melittin,尤其在4 μM、7 μM時(shí)；而RGD-melittin效果強(qiáng)于melittin(P<0.01).

2.3 SP94-melittin、RGD-melittin對(duì)HepG2細(xì)胞線粒體膜電位的影響

研究證明線粒體膜電位的降低是細(xì)胞凋亡的重要特征之一,因此本實(shí)驗(yàn)采用JC-1線粒體膜電位試劑盒標(biāo)記細(xì)胞,最終通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位變化來觀察抗菌肽RGD-melittin和SP94-melittin對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2線粒體膜電位的影響.

如圖3所示：4 μM和7 μM濃度的 SP94-melittin作用HepG2細(xì)胞24h后,線粒體膜電位與陰性組相比分別降低10%、15%；4 μM和7 μM濃度的RGD-melittin作用HepG2細(xì)胞24h后,線粒體膜電位與陰性組相比分別降低55%、45%；該結(jié)果再次證明SP94-melittin和RGD-melittin對(duì)HepG2抗腫瘤性；另外比較RGD-melittin和SP94-melittin線粒體膜電位變化情況得出,在7 μM與4 μM濃度作用下RGD-melittin抗腫瘤性顯著強(qiáng)于SP94-melittin.

數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,n=3,***p < 0.001圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)HepG2細(xì)胞線粒體膜電位變化情況

2.4 melittin,SP94-melittin 和 RGD-melittin溶血性比較

本實(shí)驗(yàn)將抗菌肽melittin分別與靶向肽SP94和RGD連接以達(dá)到增強(qiáng)抗菌肽靶向性同時(shí)減低其溶血性的目的.如圖4可見，各個(gè)濃度的melittin與SP94-melittin相比溶血率沒有顯著差異(P>0.05),RGD-melittin在0.04 μM及4 μM與melittin與SP94-melittin無顯著差異(P>0.05),但在0.2 μM、1 μM、2 μM濃度處與melittin與SP94-melittin相比差異極顯著(P<0.01).

圖4 melittin,SP94-melittin 和RGD-melittin溶血性比較

3 討 論

抗菌肽中的陽(yáng)離子型抗菌肽不但具有廣譜抗細(xì)菌、真菌和部分病毒的能力,還具有抗腫瘤活性,同時(shí)還可以刺激機(jī)體增強(qiáng)免疫力.通過本研究再次證實(shí)抗菌肽melittin具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性,與前人研究結(jié)果一致[9,10],另外本研究采用生物公司合成的多肽序列同樣具有正常的生物活性.

為使melittin在體內(nèi)對(duì)腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的靶向性,將melittin分別與對(duì)腫瘤細(xì)胞具有靶向性的多肽序列SP94、RGD連接,比較連接后的多肽序列的抗腫瘤性和溶血性的變化；抗腫瘤性由強(qiáng)到弱依次為RGD-melittin、melittin、SP94-melittin；SP94-melittin抗腫瘤性明顯低于melittin和RGD-melittin.線粒體膜電位變化也再次證明RGD-melittin抗腫瘤性強(qiáng)于SP94-melittin,并具有顯著(P<0.05)或極顯著差異(P<0.01).

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道Melittin的抗腫瘤機(jī)制是通過自身的二維結(jié)構(gòu)α-螺旋穿過腫瘤細(xì)胞膜引起細(xì)胞膜破裂,從而引起細(xì)胞內(nèi)容物外泄,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[18]；另有研究人員報(bào)道如果降低陽(yáng)離子型抗菌肽的螺旋性會(huì)引起該抗菌肽抗菌活性降低[19]；對(duì)于本文中不同靶向肽連接melittin后抗腫瘤性產(chǎn)生明顯差異,本研究分析melittin通過10個(gè)連接子與12氨基酸長(zhǎng)度的SP94連接,melittin通過3個(gè)連接子與3個(gè)氨基酸序列的RGD連接,連接較長(zhǎng)序列的SP94-melittin促腫瘤細(xì)胞凋亡性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于melittin和連接較短序列的RGD-melittin,而RGD-melittin與melittin相比促腫瘤細(xì)胞凋亡性增強(qiáng),說明連接較長(zhǎng)序列的靶向肽可能會(huì)降低melittin的α-螺旋結(jié)構(gòu)的生物活性,連接的較短序列對(duì)多肽的二維結(jié)構(gòu)影響有限,并且因其特異性,反而增加抗菌肽自身生物活性；從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出不同的靶向肽及靶向肽的長(zhǎng)度、特異性可能會(huì)影響多肽自身的生物活性.

從溶血性結(jié)果可以得出RGD-melittin溶血性顯著低于melittin與SP94-melittin,而SP94-melittin與melittin溶血性無明顯差異,其溶血性改變的機(jī)制尚不清楚.

本研究通過腫瘤細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)、線粒體膜電位測(cè)定和溶血實(shí)驗(yàn)比較melittin、SP94-melittin、RGD-melittin抗腫瘤性和溶血性,得出melittin連接不同靶向肽及連接序列的長(zhǎng)度對(duì)其生物活性具有一定的影響,設(shè)計(jì)人員在設(shè)計(jì)雜合肽序列時(shí)需要充分考慮各肽的生物活性及連接序列長(zhǎng)度對(duì)彼此間的影響.本研究對(duì)設(shè)計(jì)靶向抗腫瘤雜合肽具有一定參考價(jià)值；另外本研究設(shè)計(jì)的腫瘤靶向雜合肽RGD-melittin可作為納米粒子的運(yùn)載藥物靶向在腫瘤部位釋放以發(fā)揮其抗腫瘤效果.