李方烴 沈重成 英鑫 徐慧雯 李天宇 李光旭 陳智超 張欽 趙明威

作者單位：北京大學人民醫(yī)院眼科 眼病與視光醫(yī)學研究所 視網(wǎng)膜脈絡膜疾病診治研究北京市重點實驗室 北京大學醫(yī)學部眼視光學院 100044

角膜作為全身中神經分布最為密集的組織[1]，角膜神經除了其重要的感覺作用，其還承擔著反應性控制基礎淚液的分泌、瞬目以及角膜上皮的遷移和增殖[2-4]等作用。干眼為多因素引起的慢性眼表疾病，是由淚液的質、量及動力學異常導致的淚膜不穩(wěn)定或眼表微環(huán)境失衡，可伴有眼表炎性反應、組織損傷及神經異常，造成眼部多種不適癥狀和（或）視功能障礙[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)角膜神經的異常及改變是干眼主要的病理生理機制之一[2]。

隨著角膜活體共聚焦顯微（In vivo confocal microscopy，IVCM）技術的廣泛應用，國內外學者使用IVCM觀察角膜、結膜上皮密度，結膜鱗狀上皮化生以及角膜神經等的改變[6-9]。角膜上皮下神經纖維在干眼中的病理變化以及重要作用已經得到廣泛的認知[2]。但既往對干眼患者的角膜上皮下神經的形態(tài)研究結果卻大相徑庭。有研究發(fā)現(xiàn)干眼患者的角膜上皮下神經纖維密度較健康人群明顯減少[10-12]；另有研究發(fā)現(xiàn)干眼患者較正常人群角膜上皮下神經密度并無明顯改變[13-14]。出現(xiàn)研究結果差異巨大的原因之一可能是目前IVCM分析神經的方法存在著明顯的局限性，臨床上廣泛應用的IVCM為海德堡HRT-Ⅲ共聚焦顯微鏡，其得到的是分辨率為1 μm，面積為400 μm×400 μm的角膜圖像。此前研究采取的方式是選取不同部位多個角膜圖像進行分析并取平均值[15-16]，但由于不同部位角膜上皮下神經密度存在差異，此方法可能出現(xiàn)選擇偏倚因而會造成誤差，這也可能是導致不同研究中結果差異的原因之一。為此，我們設計通過拼接角膜上皮下神經圖像方式得到連續(xù)、大面積的角膜上皮下神經圖像，減小選擇偏倚導致的誤差。本研究通過使用角膜IVCM采集干眼患者角膜上皮下神經纖維圖像，拼接合成得到連續(xù)的大面積的角膜上皮下神經拼接圖像，比較拼接圖像分析方法與傳統(tǒng)分析方法在角膜神經形態(tài)方面及其與干眼臨床指標之間的相關性是否存在差異。

1 對象與方法

1.1 對象

納入標準：①年齡18～65 歲；②根據(jù)干眼專家共識[5]，具有干眼癥狀，淚膜破裂時間（Tear break up time，TBUT）≤5 s或NIKBUT＜10 s；或患者有干眼癥狀，但TBUT＞5 s且≤10 s或NIBUT為10～12 s，則角膜熒光素鈉染色陽性（≥5個點）。排除標準：①自身免疫性疾病，包括干燥綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕關節(jié)炎等；②移植物抗宿主??；③活動性結膜炎或角膜炎；④3 個月內使用除人工淚液外的滴眼液（如糖皮質激素滴眼液、免疫抑制劑滴眼液）或曾配戴角膜接觸鏡者；⑤6 個月內使用過臨時淚道栓子和永久淚道栓子或進行過眼科手術；⑥合并糖尿病，嚴重的慢性心、肝、腎、肺功能不全，嚴重耐藥菌感染，惡性腫瘤，精神病患者等影響用藥及不能配合者。

連續(xù)收集2021年1—5月北京大學人民醫(yī)院門診診斷為干眼的患者16 例（16 眼），所有受檢者均進行病史詢問、裂隙燈顯微鏡檢查、無創(chuàng)傷淚河高度（Noninvasive tear meniscus height，NITMH）、無創(chuàng)傷淚膜破裂時間（Noninvasive tear break up time，NITBUT）、TBUT、角膜熒光素染色（Corneal fluorescein staining，F(xiàn)L）評分、瞼板腺缺失比例、基礎淚液分泌試驗（Schirmer Ⅰ test，SⅠT）和IVCM檢查。本研究遵循赫爾辛基宣言，經北京大學倫理委員會批準（批號：2020PHB291-01），受檢者均簽署知情同意書。

1.2 檢查方法

所有患者進行雙眼完善的眼表檢查，包括眼表分析儀檢查（NITMH、NITBUT、瞼板腺紅外成像）、TBUT、FL、SⅠT及IVCM等。

1.2.1 眼表分析儀檢查 由同一檢查人員使用Oculus Keratograph 5M（Oculus Keratograph，德國Oculus公司）檢測NITMH、NITBUT、瞼板腺紅外成像，分別對上下瞼瞼板腺進行評分，評分標準為：0分：無明顯瞼板腺缺失；1分：缺失小于全部瞼板腺1/3 面積；2 分：缺失全部瞼板腺面積1/3～2/3；3分：缺失大于全部瞼板腺2/3面積。將上下瞼瞼板腺評分相加獲得最終評分（0～6分）[17]。

1.2.2 TBUT檢查 在裂隙燈顯微鏡鈷藍彌散光源下，以患者睜眼時立即用秒表開始計時，囑患者持續(xù)保持睜眼，觀察角膜表面熒光素鈉涂布情況，直到角膜出現(xiàn)1個黑斑時停止計時。

1.2.3 FL評分 TBUT計時結束后，觀察患者角膜各方位熒光素染色情況，以美國國立眼科研究所（National Eye Institute，NEI）評分方法進行評估并記錄[18]。

1.2.4 SⅠT檢測 將淚液試紙條上緣（天津晶明新技術開發(fā)有限公司）放在下瞼中外1/3 處的結膜囊內，其余部分就自瞼裂懸掛在眼瞼之外，囑患者閉眼休息5 min，5 min記錄試紙條濕潤長度。

1.2.5 共聚焦顯微鏡檢查方法 使用IVCM（HRT-3型，德國Hidelberg公司）中“RCM”模塊觀察角膜上皮下神經結構。檢查方法：檢查前對受檢眼進行表面麻醉（0.4%奧布卡因滴眼液，日本參天制藥）2次，同時將有潤滑作用的卡波姆凝膠（德國博士倫公司）涂于IVCM鏡頭，并在其上安裝1次性角膜接觸帽（德國Heidelberg公司），受檢者前額及下頜分別固定于前額架及下頜托上，采用“Sequence”模式進行連續(xù)拍攝。手動調整采集位置，連續(xù)采集角膜上皮下神經圖片。

1.3 角膜上皮下神經分析

1.3.1 傳統(tǒng)分析方法 由同一研究者選取5張單張無重復的角膜上皮下神經圖片，使用Neuron J（瑞士生物醫(yī)學圖像工作組）描繪角膜上皮下神經圖片中的角膜神經纖維，并提取圖像面積、神經總長度（圖像中神經總長度）、神經密度（圖像中每平方毫米神經總長度）、平均神經長度（圖像中平均神經長度）、最長神經長度（圖像中最長的神經長度）、最短神經長度（圖像中最短神經長度）、神經數(shù)量（圖像中總的神經纖維數(shù)量）、神經數(shù)量密度（圖像中每平方毫米神經纖維數(shù)量）數(shù)據(jù)進行分析，5張無重復的角膜上皮下神經纖維圖片數(shù)據(jù)取平均值。

1.3.2 角膜拼接圖片分析方法 同一研究者使用Image J（美國國立衛(wèi)生研究院）將2張連續(xù)采集的相鄰圖像中重合區(qū)域進行標記，應用Stitching插件中的Pairwise stitching將2張圖片融合拼接為1張圖片，以此將同一患者角膜上皮下神經圖片全部進行拼接得到1張大面積角膜上皮下神經圖片（見圖1）。若采集的相鄰圖像出現(xiàn)畸變則去除此畸變圖像，尋找神經清晰無畸變的相鄰圖片進行拼接；若相鄰采集圖片之間差異較大，拼接后神經連續(xù)性出現(xiàn)明顯問題，則放棄2張圖片的拼接。由同一研究者使用Neuron J分別描繪角膜拼接后圖像的角膜神經纖維，并提取圖像面積、神經總長度、神經密度、平均神經長度、最長神經長度、最短神經長度、神經數(shù)量、神經數(shù)量密度等數(shù)據(jù)進行分析。

圖1.傳統(tǒng)角膜神經分析方法與角膜神經拼圖分析方法的比較A：共聚焦顯微鏡采集角膜上皮下神經圖像（400 μm×400 μm）；B：傳統(tǒng)方式使用Neuro J描繪角膜上皮下神經；C：同一患者拼接后角膜上皮下神經圖像；D：使用Neuro J描繪拼接后角膜上皮下神經圖像Figure 1.Comparison of the traditional corneal nerve analysis method and the new mosaic image processing method.A:IVCM corneal subbasal nerve image (400 μm×400 μm).B:Traditional corneal nerve analysis method using Neuro J.C:The same patient's corneal nerve image using the mosaic image processing method.D:Using Neuro J to analyze the corneal subbasal nerves in the processed image.IVCM,in vivo confocal microscopy.

1.4 統(tǒng)計學方法

系列病例研究。采用SAS軟件（版本9.4）進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。本研究納入患者右眼數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。2種角膜神經分析方法中的角膜神經分析數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，采用Wilcoxon秩和檢驗比較2種方法數(shù)據(jù)的差異。干眼臨床指標以及角膜神經分析數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，采用Spearman相關分析干眼臨床指標之間的相關性及其與角膜神經數(shù)據(jù)的相關性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況及干眼臨床指標

本研究共納入干眼患者16 例（右眼16 只），均為女性，年齡19～61（中位數(shù)35.5）歲。干眼臨床指標：NITMH中位數(shù)0.16 mm，NITBUT中位數(shù)3.91 s，TBUT中位數(shù)3.5 s，F(xiàn)L評分中位數(shù)0.5，SⅠT中位數(shù)10 mm，瞼板腺紅外照相評分中位數(shù)3。其中NITMH與TBUT呈正相關（r=0.65，P=0.007），F(xiàn)L與年齡呈負相關（r=-0.64，P=0.007），SⅠT與NITBUT、TBUT、FL均呈負相關性（r=-0.62，P=0.010；r=-0.55，P=0.026；r=-0.60，P=0.015）。

2.2 IVCM分析結果

傳統(tǒng)方法和拼接圖像方法分析角膜上皮下神經形態(tài)所獲得的各角膜神經指標見表1。拼接圖像方法得到分析面積中位數(shù)為2.93 mm2，而傳統(tǒng)方法面積為0.16 mm2，2種方法得到的面積差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。拼接圖像方法在神經總長度、平均神經長度、最長神經長度、神經數(shù)量方面均明顯大于傳統(tǒng)分析方法（均P＜0.001），最短神經長度較傳統(tǒng)分析方法短（P＜0.001），神經密度較傳統(tǒng)方法高（P=0.049），差異均有統(tǒng)計學意義。但拼接圖像方法得到的神經數(shù)量密度與傳統(tǒng)方法得到的神經數(shù)量密度差異無統(tǒng)計學意義（P=0.111）。見表1。

2.3 2種方法獲得的角膜神經指標與干眼指標的相關性

在傳統(tǒng)分析方法中，NITBUT與平均神經長度、神經數(shù)量、神經數(shù)量密度均有相關性（r=0.52，P=0.037；r=-0.62，P=0.011；r=-0.62，P=0.011）。在拼接圖像分析方法中，NITBUT與平均神經密度呈負相關（r=-0.56，P=0.025），其余角膜神經指標與干眼指標均無相關性。

3 討論

在角膜神經研究中，通過測量IVCM下角膜上皮下神經長度、神經密度、神經數(shù)量等參數(shù)來量化評估角膜神經[19]。由于不同位置角膜上皮下神經分布不均勻[20]，研究發(fā)現(xiàn)單張角膜上皮下神經纖維圖像分析結果的可重復性及可靠性較差，因此目前大多數(shù)對角膜神經研究所采用的方式是使用多張不同位置的角膜上皮下神經圖像分析后取平均值，從而得到相對更好的可重復性結果，如Vagenas等[16]研究發(fā)現(xiàn)隨著統(tǒng)計圖像數(shù)量的提高，數(shù)據(jù)準確性也有所提高。而目前傳統(tǒng)的分析角膜上皮下神經圖像方法仍是選擇5～8 張不同位置的神經圖片進行分析，這可能導致了既往不同研究對干眼患者角膜神經分析的結論出現(xiàn)較大的差異[10-14]。

表1.傳統(tǒng)角膜神經分析方法與角膜神經拼圖分析方法比較Table 1.Comparison of traditional corneal nerve analysis method and the new mosaic image processing method

目前僅選用不同部位的5～8 張角膜神經圖片進行分析是因為一方面，選取的圖片越多，圖像分析的工作量會更大；另一方面，圖像數(shù)量的增多會造成統(tǒng)計重復部位的可能性增加，造成選擇的偏倚，降低神經統(tǒng)計結果的可靠性。目前已發(fā)表的各項研究中基本均采用由同一研究者進行角膜神經圖片的選擇和分析以減小誤差，但不同研究中研究者選取的角膜神經位置不同以及研究者分析的差異都會增加誤差，可能導致不同研究間的結果出現(xiàn)差異[21-22]。既往研究中曾嘗試采用1 mm2的角膜神經拼圖進行神經分析，但其相對面積較小，并且未與傳統(tǒng)方式比較，未能體現(xiàn)拼接圖像分析方法的優(yōu)勢，亦未能推廣角膜神經拼接分析方法[23]。

本研究通過對角膜上皮下神經纖維圖像進行拼接從而得到較傳統(tǒng)方式更大范圍面積的角膜神經纖維圖片，經分析發(fā)現(xiàn)，拼接方式得到分析面積中位數(shù)為2.93 mm2，而傳統(tǒng)方法面積僅為0.16 mm2，由于拼圖方式得到的圖片是連續(xù)的角膜上皮下神經，使得選擇角膜神經圖片位置所造成的選擇偏倚消失，同時完全避免了出現(xiàn)重復位置分析的可能性，能夠更加準確、全面地反映患者角膜上皮下神經的形態(tài)。通過對比拼接圖像分析與傳統(tǒng)分析方法發(fā)現(xiàn)，在角膜神經長度、角膜神經密度、平均角膜神經長度、最長角膜神經長度這幾個重要的角膜神經指標方面這2 種分析方法的差異均有統(tǒng)計學意義。尤其是角膜神經密度，其是評估多種全身及角膜神經疾?。ㄈ缣悄虿∩窠洸∽?、干眼、干燥綜合征等）的重要指標[10，24-27]，分析方式的誤差可能會對研究結論造成巨大影響，采用拼接圖像處理方法避免了重復計量等問題，大幅增加數(shù)據(jù)可靠性。在傳統(tǒng)抽樣分析的方法中，研究者需要從已掃描的圖片中選擇數(shù)張作為最后的分析圖片，但是角膜上皮下神經分布的不均勻導致研究者無法判斷所選圖片是否具有代表性，是否一定沒有重疊，可能會帶來選擇偏倚，因此以往研究需要評估角膜神經分析數(shù)據(jù)的可重復性[21-22]，但拼圖方式去除了選擇偏倚因素，使得可重復性大幅度提高。

本研究發(fā)現(xiàn)拼接圖像方法可以在更大范圍內獲得角膜神經長度、神經密度等數(shù)據(jù)，對神經長度和神經密度采樣范圍極大提升，從而增加數(shù)據(jù)可靠性。在角膜神經指標與干眼臨床指標的相關性分析上，也發(fā)現(xiàn)2種不同的角膜神經分析方法導致了NITBUT與角膜神經指標相關性的差異，使用拼接圖像分析發(fā)現(xiàn)NITBUT與神經纖維密度存在相關性。說明新的角膜拼接分析方法會對干眼臨床評估指標的研究結果產生影響，我們認為拼接神經分析數(shù)據(jù)能更全面、更準確地反映患者角膜神經形態(tài)特點，從而使角膜神經形態(tài)與干眼指標相關性分析的結論更為準確、可靠。

但本研究目前仍存在一些不足。首先，大面積的拼圖需要獲得大量同一平面的角膜上皮下纖維圖像，而其獲取需要較高技術的檢查人員以及患者相對良好檢查配合度，這在一定程度上限制了其應用的范圍。其次，大面積的圖片拼接是一個工作量巨大而極其繁瑣的工作[28]，手動拼接無法實現(xiàn)大樣本量研究。我們認為計算機輔助拼接是目前的解決方案[29]，并在積極嘗試，而人工智能則是圖像拼接技術的未來發(fā)展方向。此外，IVCM圖像質量也是重要限制因素。由于光學漸暈效應導致IVCM圖像邊界區(qū)域比中心區(qū)域亮度低，圖像在拼接處產生偽影[30]，造成角膜結構不清晰。目前研究團隊正在嘗試通過自適應漸暈矯正方法來提高拼接圖像質量，讓角膜拼接后神經結構更加清晰。同時，角膜神經拼接得到了以往分析方法所無法達到的更大面積、更大范圍的角膜神經圖像，以往的神經分析指標主要是針對0.16 mm2（400 μm×400 μm）的小面積圖像進行分析，如角膜神經長度、角膜彎曲度等指標，沒有針對更大面積角膜神經的形態(tài)分析方法，后續(xù)研究中我們將嘗試針對整體神經形態(tài)的分析方法。本研究的主要局限性是樣本量較小，由于角膜上皮下神經拼圖對IVCM圖像采集的質量要求相對較高，導致現(xiàn)階段采集大量優(yōu)質IVCM角膜上皮下神經圖像用于拼接較為困難，我們將在后續(xù)研究中完善方法，從而采集更多數(shù)據(jù)作為下一步研究的支撐。其次，本研究缺乏健康及重度干眼對照組，研究中入選的均為輕中度干眼患者，若能添加重度干眼患者或健康人群作為對照，比較2種分析方法在不同人群中角膜神經分析結果與干眼各項指標的相關性結果的差異，將更能體現(xiàn)新分析方法的優(yōu)勢，我們將在進一步研究中加入對照組進行研究分析。最后，本研究未進行干眼癥狀評分與角膜知覺檢測，此前有研究報道干眼癥狀評分和角膜知覺與角膜神經形態(tài)存在相關性[10]，而本研究未納入此2種指標進行相關性分析。

綜上所述，本研究使用IVCM角膜上皮下神經纖維圖片拼接方法得到1張連續(xù)、大面積的角膜神經圖像，對其神經形態(tài)進行分析，并與傳統(tǒng)角膜神經方法進行比較，結果發(fā)現(xiàn)干眼患者使用拼接方法分析的神經面積明顯高于傳統(tǒng)方法。與傳統(tǒng)神經分析方法比較，拼接圖像分析方法在神經總長度、平均神經長度、最長神經長度、神經數(shù)量方面均明顯高于傳統(tǒng)分析方法，拼接圖像分析方法中角膜神經密度也較傳統(tǒng)方法高。但2種分析方法在角膜神經數(shù)量密度差異無統(tǒng)計學意義，同時2種分析方法獲得的角膜神經指標與部分干眼臨床指標的相關性結果存在差異。拼接方法可以更大范圍、更準確、更可靠地評估干眼患者角膜上皮下神經。今后，我們將使用拼接圖像分析方法對不同的類型和病情程度的干眼患者的角膜神經形態(tài)進一步研究，從而更準確評估角膜神經在干眼中的重要作用。

利益沖突申明本研究無任何利益沖突

作者貢獻聲明李方烴：收集數(shù)據(jù)；選題、設計及資料的分析和解釋；撰寫論文；根據(jù)編輯部的修改意見進行修改。沈重成：收集數(shù)據(jù)；參與資料的分析和解釋。英鑫：收集數(shù)據(jù)；數(shù)據(jù)整理。徐慧雯：數(shù)據(jù)統(tǒng)計。李天宇、李光旭、陳智超：圖像整理、處理。張欽：參與選題、設計和修改論文的結果、結論；根據(jù)編輯部的修改意見進行核修。趙明威：修改論文中關鍵性結果、結論；根據(jù)編輯部的修改意見進行核修